超聲輔助酶解鷹嘴豆蛋白制備抗氧化肽的研究

李芳，侯偉偉，任海波，張文，馬欣，孔令明，*

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830021；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

超聲輔助酶解鷹嘴豆蛋白制備抗氧化肽的研究

李芳1，侯偉偉2，任海波1，張文2，馬欣2，孔令明2，*

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830021；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

本文利用超聲波輔助酶解鷹嘴豆蛋白粉制備抗氧化多肽，采用響應(yīng)面分析法考察了超聲功率、超聲溫度和超聲時間對酶解產(chǎn)物的超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率和還原能力的影響。結(jié)果表明，最優(yōu)的超聲酶解條件為：超聲功率200 W、超聲溫度40℃、超聲時間28 min，在此條件下，酶解產(chǎn)物對超氧陰離子的清除率、對羥基自由基的清除率和還原能力分別為80.4%、9.2%和71.8%，實(shí)際的清除率分別為81.6%、9.4%和72.9%。在相同的濃度下，鷹嘴豆多肽對超氧陰離子的清除率、對羥基自由基清除率和還原能力占維生素C百分比較未經(jīng)超聲波處理的分別提高了4.0%、1.2%和7.8%。

超聲波；鷹嘴豆；酶解；多肽；抗氧化活性；響應(yīng)面分析法

鷹嘴豆（chickpea）屬豆科鷹嘴豆屬，又名桃爾豆、雞豌豆、雞頭豆，維吾爾語稱“諾胡提”，因其豆粒形狀似鷹頭而得名。鷹嘴豆富含優(yōu)質(zhì)蛋白，干籽粒中蛋白質(zhì)含量為15%～30%，其氨基酸含量豐富，每100 g蛋白質(zhì)含有氨基酸約80%～90%，且18種氨基酸種類齊全，8種必需氨基酸的組成均衡，約為33.6%～41.2%，其中賴氨酸含量相對較高［1］。鷹嘴豆蛋白因其氨基酸組成均衡、生物利用率高和抗?fàn)I養(yǎng)因子低而被作為植物蛋白的重要來源［2］，具有很好的開發(fā)利用價值。科學(xué)研究表明，將蛋白質(zhì)酶解可得到許多具多種生物活性的肽，它們具有的生物活性作用包括抗氧化作用、抗高血壓、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)等［3］。研究表明，酶解鷹嘴豆蛋白獲得的鷹嘴豆多肽具有一定的抗氧化活性［4］。

本文采用超聲波對鷹嘴豆蛋白質(zhì)進(jìn)行輔助酶解，就鷹嘴豆蛋白超聲波輔助酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為鷹嘴豆蛋白資源的開發(fā)利用和精深加工提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與試劑

鷹嘴豆蛋白粉：實(shí)驗(yàn)室自制；木瓜蛋白酶（80萬U/ g）：為南寧龐博生物工程有限公司提供；其余試劑均為分析純。

1.1.2儀器

HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市國立實(shí)驗(yàn)設(shè)備研究所；KQ-250DE型數(shù)控超聲波洗滌器：上海精密科學(xué)技術(shù)儀器廠；TD5A-WS型離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；85-2A恒溫磁力攪拌器：常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所；DEITA320型手持式pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；PL202型電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TU-1810型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BYK型真空冷凍干燥機(jī)：北京博愛康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司等。

1.2方法

1.2.1鷹嘴豆蛋白酶解工藝

鷹嘴豆蛋白粉→加水→調(diào)pH→加酶→超聲波輔助酶解→高溫滅酶→冷卻→離心→取上清液→干燥→鷹嘴豆多肽

1.2.2超氧陰離子清除率的測定

采用鄰苯三酚方法［5］。

1.2.3羥基自由基清除率的測定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［6-7］。

1.2.4還原能力的測定［8］

1.2.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理建立數(shù)學(xué)模型，以超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率及還原能力為響應(yīng)值，選擇超聲功率（X1）、超聲處理溫度（X2）、超聲處理時間（X3）這三個因素的三個較優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。通過響應(yīng)面曲面分析優(yōu)化鷹嘴豆抗氧化多肽的制備工藝。

表1　試驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels of test

2　結(jié)果與分析

2.1響應(yīng)面優(yōu)化超聲酶解條件試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)曲面方法的要求，展開17組試驗(yàn)，鷹嘴豆多肽的超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率及還原能力測定結(jié)果見表2。

表2　試驗(yàn)方案和結(jié)果Table 2Test design and results

采用Design Expert軟件，以超聲功率、超聲處理溫度和超聲處理時間為響應(yīng)變量，以超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率及還原能力為響應(yīng)值對表2進(jìn)行回歸分析，所得到的預(yù)測模型如下：

進(jìn)行鷹嘴豆多肽超氧陰離子清除率回歸方程的方差分析，結(jié)果如表3所示。

進(jìn)行鷹嘴豆多肽羥基自由基清除率回歸方程的方差分析，結(jié)果如表4所示。

表3　超氧陰離子清除率的方差分析表Table 3Variance analysis of superoxide anion radical scavenging rate experiment

表4　羥基自由基清除率的方差分析表Table 4Variance analysis of hydroxyl radical scavenging rate experiment

進(jìn)行鷹嘴豆多肽還原能力回歸方程的方差分析，結(jié)果如表5所示。

由表3、表4和表5可知，回歸方程Y1、Y2和Y3分別為顯著、極顯著和高度顯著，且失擬檢驗(yàn)均不顯著，說明回歸模型的擬合度良好。因此，可以用回歸方程替代真實(shí)試驗(yàn)對不同超聲輔助酶解條件下鷹嘴豆多肽的超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率及還原能力進(jìn)行預(yù)測。

由表3可以看出，超聲功率（X1）、超聲處理溫度（X2）和超聲處理時間（X3）3個因素中二次項(xiàng)X32對超氧陰離子清除率的影響高度顯著，而其余一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對超氧陰離子清除率的影響均不顯著。由表4可知，Y2回歸方程的一次項(xiàng)X2和X3對羥基自由基清除率的影響分別為高度顯著和顯著，二次項(xiàng)X12、X22對羥基自由基清除率的影響極顯著，而交互項(xiàng)對羥基自由基清除率的影響均不顯著。由表5可知，Y3回歸方程的一次項(xiàng)X1、X3對還原能力的影響分別為顯著和高度顯著，二次項(xiàng)X12、X22對還原能力的影響分別為顯著和高度顯著，交互項(xiàng)X2X3對還原能力的影響為高度顯著。

表5　還原能力的方差分析表Table 5Variance analysis of reducibility power experiment

考慮到鷹嘴豆多肽對超氧陰離子、羥基自由基清除能力及還原能力的綜合影響，采用響應(yīng)面軟件分析所得的最優(yōu)超聲輔助酶解條件為：超聲功率200 W、超聲溫度40℃、超聲時間28 min。在此條件下鷹嘴豆多肽對超氧陰離子的清除率為80.4%，對羥基自由基的清除率為9.2%，鷹嘴豆多肽的還原能力為71.8%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下鷹嘴豆蛋白抗氧化活性肽對超氧陰離子和羥基自由基的清除率分別為81.6%和9.4%，其還原能力為72.9%。與預(yù)測值的相對誤差在1.5%左右，證明利用響應(yīng)面分析法得到的超聲輔助酶解條件是可靠的，表明在實(shí)踐中應(yīng)用此模型進(jìn)行預(yù)測具有一定的價值。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果見圖1。

2.2鷹嘴豆多肽與抗氧化劑維生素C的抗氧化活性比較

在響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)超聲輔助酶解條件下制備鷹嘴豆多肽酶解液，分別將該?dān)椬於苟嚯拿附庖簩Τ蹶庪x子的清除率、對羥基自由基的清除率及還原能力與同濃度維生素C具有的抗氧化活性比較，結(jié)果見圖2和圖3。

圖1　響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Fig.1Results of response surface optimization

圖2　自由基清除能力的比較Fig.2Comparison of radical scavenging power

圖3　還原能力的比較Fig.3Comparison of reducibility power

由圖2可知，鷹嘴豆多肽與維生素C均具有較高的超氧陰離子的清除能力，其超氧陰離子清除率達(dá)到了同濃度維生素C的87.2%，而其對羥基自由基的清除能力較低。從圖3可知，鷹嘴豆多肽和維生素C均有一定的還原能力，同濃度下鷹嘴豆多肽的還原能力為維生素C的82.3%。

3　結(jié)論

研究中采用超聲波輔助酶解鷹嘴豆蛋白粉，通過響應(yīng)面分析，以鷹嘴豆多肽的超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率及還原能力作為響應(yīng)值，優(yōu)化了超聲輔助酶解鷹嘴豆蛋白制備鷹嘴豆抗氧化活性肽的工藝。經(jīng)優(yōu)化確定的最優(yōu)超聲波輔助酶解條件為：超聲功率200 W、超聲溫度40℃、超聲時間28 min，在此條件下鷹嘴豆蛋白抗氧化活性肽對超氧陰離子的清除率為81.6%，對羥基自由基的清除率為9.4%，其還原能力為72.9%。在相同濃度下，鷹嘴豆多肽對超氧陰離子的清除率占維生素C的百分比較未經(jīng)超聲波處理的相比提高了4.0%；對羥基自由基的清除率占維生素C的百分比較未經(jīng)超聲波處理的相比提高了1.2%；其還原能力占維生素C的百分比較未經(jīng)超聲波處理的相比提高了7.8%。可見超聲波輔助水解鷹嘴豆蛋白可顯著地對鷹嘴豆蛋白進(jìn)行破壁，有利于蛋白酶的水解作用，在其余酶解條件均相同的情況下，有效地提高了鷹嘴豆多肽的抗氧化能力。

［1］張濤，江波，王璋.鷹嘴豆?fàn)I養(yǎng)價值及其應(yīng)用［J］.糧食與油脂，2004（7）：18-20

［2］Friedman M.Nutritional value of proteins from different food source. A review［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1996，44（3）：6-29

［3］Zhang Tao，Jiang Bo，Wang Zhang.Gelation properties of chickpea protein isolates［J］.Food Hydrocolloids，2007，21（1）：280-286

［4］劉宇，劉春泉，莊世文，等.鷹嘴豆肽清除自由基作用的研究［J］.食品科技，2008，34（3）：173-175

［5］吳建中.大豆蛋白的酶法水解及產(chǎn)物抗氧化活性的研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)博士學(xué)位論文，2003：36-47

［6］Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F，et al Antioxida tive properties of histidine co-ntaining peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（8）：49-53

［7］宗玉霞，楊海燕，勞菲，等.木瓜蛋白酶水解核桃粕制備抗氧化活性多肽的研究［J］.中國食品添加劑，2012（4）：170-176

［8］He Yenhun，F(xiàn)ereidoon Shahidi.Antioxidant activity of green tea and itscatechinsin afishmeatmodelsystem［J］.JAgricFoodChem，1997，45（5）：4262-4265

Study on Ultrasonic-assisted Enzymatic Hydrolysis of Chickpea Protein to Prepare Anti-oxidative Peptide

LI Fang1，HOU Wei-wei2，REN Hai-bo1，ZHANG Wen2，MA Xin2，KONG Ling-ming2，*
（1.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China；2.College of Food and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China）

In this paper，ultrasonic-assisted technology was used to hydrolyze chickpea protein powder for preparing anti-oxidative polypeptide.Response surface methodology was applied to study the effects of ultrasonic power，temperature and time on the superoxide anion radical scavenging rate，hydroxyl radical scavenging rate and reducibility of enzymolysis product.The result showed that optimum conditions were as follows：ultrasonic power 200 W，ultrasonic temperature 40℃，ultrasonic time 28 min.Under these conditions，the scavenging rate of superoxide anion radical and hydroxyl radical of chickpea polypeptide was 80.4%and 9.2%respectively，and reducibility of chickpea polypeptide was 71.8%.The actual scavenging rate was 81.6% and 9.4%respectively，and reducibility was 72.9%.At the same concentration，radical scavenging rate and reducibility of chickpea polypeptide and anti-oxidative capacity of vitamin C percentage increased by 4.0%，1.2%and 7.8%.

ultrasound；chickpea；enzymatic hydrolysis；polypeptide；anti-oxidative activity；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.010

2014-10-02

新疆維吾爾族自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（20131030615）作者簡介：李芳（1976—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。