纖維素酶降解秸稈特性及其基因工程研究進展

張森翔 尹小燕 龔志偉 楊忠華 侯亞利 周衛

（武漢科技大學化學工程與技術學院，武漢　430081）

纖維素酶降解秸稈特性及其基因工程研究進展

張森翔 尹小燕 龔志偉 楊忠華 侯亞利 周衛

（武漢科技大學化學工程與技術學院，武漢430081）

能源短缺和環境污染問題是人們關注的焦點。秸稈類生物質以其資源豐富、無污染及可再生等特性使其在解決能源危機方面具有極大應用前景。對秸稈類生物質通過纖維素酶的水解轉化為可發酵性的糖，再結合發酵技術可進一步生產乙醇、氫氣等能源物質，是一條成熟的能源化技術路線。其關鍵是秸稈生物質的預處理與高效的糖苷水解酶獲得。將從對秸稈類生物質的預處理、纖維素酶的作用機理研究和纖維素酶基因工程3個方面對當前的研究進展進行綜述與分析。這對于促進秸稈類生物質能源化應用具有指導意義。

纖維素；纖維素酶；秸稈生物質；纖維素水解效率；纖維素酶基因

秸稈類生物質是全球第四大能源物質。我國每年生產的玉米秸稈生物質1.5億t，利用纖維素轉化技術可生產1 500萬t生物燃料及1 800萬t加工產品，相當于4 500萬t石油產生的價值［1］。當前我國大量秸稈生物質未充分利用，許多在田地直接焚燒。這一方面使資源白白浪費；另一方面產生嚴重的大氣污染，如每年春夏之交的中原小麥秸稈田間燃燒給我國許多省造成重大的空氣污染。如何充分利用秸稈生物質資源，世界各國相繼提出了發展生物質資源的國家戰略計劃［2］，纖維素酶能將秸稈類生物質轉化為可發酵性糖，再結合發酵技術直接生產生物燃料，其具有技術成熟、效率高、環境友好等優點，成為了新能源研究領域的主要方向之一。高效、廉價、大量的纖維素酶等糖苷水解酶是其關鍵。本文將從對秸稈類生物質的預處理、纖維素酶的作用機理研究和纖維素酶基因工程技術三個方面對纖維素酶的研究進展進行綜述分析，以促進我國秸稈類生物質的利用技術。

1 秸稈的結構特征及其預處理方法

秸稈類生物質纖維素的結構特性直接影響纖維素酶對其的降解效率，其表面粗糙度［3］、結晶度、聚合度、木質素的組成和分布、半纖維素成分、粒度、孔隙率［4］、疏水性［5］和水吸附值［6］等都會阻礙纖維素酶的水解，故對秸稈本身的纖維素結構的研究成為纖維素酶降解纖維素基礎研究的一個重要方向。

纖維素是一種由β-1，4糖苷鍵聯接的n個D-吡喃型葡萄糖鏈形成的大分子多糖，通過氫鍵的締合作用，形成纖維束，按分子密度大小分為結晶區和無定形區，其中天然纖維素中主要為結晶纖維素。纖維素一般均包埋或嵌合在半纖維素和木質素里，形成網狀結構［7］。通過預處理，破壞木質素對纖維素的包裹及纖維素的晶體結構，使更多的纖維素裸露出來，即去除大量木質素，并最小程度的進行多糖結構修飾，保留纖維素的天然超微結構［8］，達到提高工業中纖維素和半纖維素利用的目的。

甘蔗渣、玉米秸稈、小麥秸稈及稻草粉等秸稈類生物質進行預處理的方法主要有物理法（機械粉碎、輻射）、物理化學法（蒸汽爆破、AFEX、CO2爆破、濕氧處理和臭氧分解）、化學法（酸水解、堿水解、離子液體處理和有機溶劑法）［9］。主要的成果歸納于表1中。其中物理法對環境的污染小，但是其過程耗能大，成本高，不適合大規模工業生產；化學法極易產生發酵抑制物，且部分酸堿濃度過大會腐蝕設備，污染環境；而物理化學法對其反應設備或者反應試劑要求高，成本昂貴。

每年夏季，長江以南的江河湖泊生長著大量水葫蘆，引起大面積生物危害。對其綜合利用，可達到變廢為寶的目的。常用的預處理方法，其能量損耗及產生三廢處理的成本壓力是制約其工業化應用的主要因素，深入研究其結構及化學特性，尋找一種經濟高效的預處理方法對秸稈的利用具有重要意義。筆者所在實驗室對木質纖維素成分達50%左右的水葫蘆進行預處理研究，結合物理法和化學法處理，利用纖維素酶降解后糖量和糖類作為評價指標，找到進行工業高效利用的預處理方法。

表1 甘蔗秸稈、玉米秸稈、小麥秸稈、稻草秸稈的預處理研究結果

2 纖維素酶作用機理研究

纖維素酶是由多種水解酶組成的復合酶，也稱纖維素酶系，包含：內切葡聚糖酶（Endoglucanase，EG；EC 3.2.1.4），外切葡聚糖酶（Exoglucanase，CBH；EC 3.2.1.91，EC 3.2.1.176），β-葡糖苷酶（β-glucosidase，BG；EC 3.2.1.21）［23］。通常認為纖維素酶降解纖維素的原理為協同作用，主要包括以下3個步驟：（1）CBH作用于纖維素線狀分子末端，水解1，4-β-D糖苷鍵，每次切下1個纖維二糖分子；（2）EG作用于纖維素內部的非結晶區，隨機水解β-1，4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量含非還原性末端的小分子纖維素AAA9家族（原GH61家族）的氧化降解酶類，具有微弱的內切葡聚糖酶活性，起初一直被作為糖苷水解酶，后經研究發現其三維結構與一般的EG不同，其可以通過氧化反應使得纖維素被部分氧化降解，并在一定程度上破壞其結晶結構，從而使纖維素更容易被纖維素酶降解［24］；（3）BG將纖維二糖和寡糖水解成葡萄糖分子［25］。

Cao等［26］通過利用纖維素酶降解不同類型的紙漿發現，纖維素酶解必須首先對纖維素的晶體結構進行破壞，并推斷出纖維素結晶區的解聚與解鏈是纖維素酶解過程的限速步驟，這導致CBH成為目前的研究熱點。CBH是持續性催化酶類，酶分子能相對線性底物進行單方向運動，在結合底物后至解離前可執行上千次持續性催化。其具有2個獨立的結構域，即1個催化功能結構域（Catalytic domain，CD）和1個纖維素結合功能結構域（Cellulose binding domain，CBD，或稱Carbohydrate binding module， CBM）。其中CD代表CBH的催化活性及對特定水溶性底物的特異性，其活性中心一般為孔道或者是深陷的凹槽，不同于一般酶分子的開放裂痕型結構，使其具有持續性酶解能力，其催化糖基轉移的機制與溶菌酶相似，是酸/堿催化的雙置換機制，在異頭碳原子位通過構型的保留或構型的轉化完成催化反應，其中兩個保守的羧基氨基酸分別作為質子供體和親核試劑［8，27，28］。CBM具有維持酶分子的構象穩定性，調節酶對可溶性、非可溶性底物專一性活力的作用；能疏解結晶纖維素結構的能力，維持纖維素酶的持續性降解，并利用吸附作用增大酶分子與底物的結合，輔助外切葡聚糖酶對天然纖維素底物的接近、定位與干擾等作用［28］。CBH借助CBM的吸附作用，結合并水解結晶纖維素的疏水表面，識別并解離纖維素鏈游離的還原末端，游離分子鏈還原端進入CD 催化孔道，形成復合物。每次水解產生一個纖維二糖，然后發生初步線穿和去結晶化運動，水解并排出纖維二糖，隨后進入下一催化循環過程進［27］（圖1）。

圖1 CBH線穿-釋放催化循環

Ciolacu等［32］對CBD進行吸附和解吸試驗發現，酶解過程中，纖維素酶需要通過CBD與結晶纖維素Ⅰ型結合，使分子間或分子內的氫鍵斷裂，之后酶解反應開始進行，其吸附動力學受表面積和孔隙率影響，解吸過程受無定形纖維素的疏水作用和pH及溫度的影響。Ding［8］、Costaouec［30］和Lou［31］的研究發現，木質素會對CBD產生非必要性吸附，浪費部分纖維素酶水解能力，而CBM對于纖維素酶降解可溶性的纖維素沒有輔助作用，但是對于結晶纖維素的降解促進作用表現很明顯。

雖然大量的研究成果使人們對纖維素酶的作用機制有了更深入的了解，但是纖維素酶在底物上進行持續性的水解纖維素的催化動力來源仍不明確，如CBD打斷分子鏈間和分子內氫鍵的動力機制。完成對CBH這種典型的持續性酶的降解機制的原理，將為人們研究其他類似持續性酶反應過程有一個指導作用，并對利用分子改造技術提高酶分子轉化效率奠定正確的理論基礎。

3 纖維素酶基因工程研究

纖維素酶工業化應用中有兩大難題，一是生物質細胞壁的抗降解屏障極大地制約了木質纖維素的轉化效率；二是現有的纖維素酶對于生物質中纖維素的糖轉化能力較低［8］。預處理技術能有效的解決第一個難題，而第二個難題常見以下2種方法，一種是篩選高效纖維素酶菌株，這是最常見的方法，如筆者所在實驗室篩選的一株高效的產纖維素酶菌株Trichoderma viride WUST 01［33］；另一種是采用基因工程技術構建所需產酶菌株。

注：a：Glycoside hydrolases；b：酶水解底物得立體化學機制，根據異頭碳原子位的構型的保留或轉化分為保留機制和反構機制；c：3D structure status；d：蛋白質結構分類數據庫；-：unclassified

昆蟲、軟體動物、原生動物、細菌、放線菌、真菌等都可以產生纖維素酶。通常真菌纖維素酶的產量大，組成復雜，大部分為胞外酶，分離純化操作要求低。其中，最有代表性的為里氏木霉。所產的纖維素酶是完整的纖維素酶復合體系，含有內切葡聚糖酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，外切葡聚糖酶Ⅰ、Ⅱ，β-葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ［25］。國際著名的纖維素酶制劑生產公司Novozyme 和Genencor多以里氏木霉為主要產酶菌株［34］。但是不同霉菌的纖維素酶產量不同，活性也不相同，如斜臥青霉易分泌較多的β-葡萄糖苷酶，里氏木霉分泌較多的外切葡聚糖酶，酶組分比例并不合理，酶活性較低。而細菌培養基成分簡單，生長周期短，表達蛋白的轉化及分離純化技術易于操作，其中大腸桿菌最具有代表性，將真菌中的纖維素酶在細菌中的大量表達是目前纖維素酶基因工程的一個研究方向。此外，酵母菌作為目前新型生物能源工業特別是生物乙醇生產中主要菌株，將纖維素酶基因重組到酵母菌中，可以實現從纖維素到葡萄糖再到酒精的完整發酵過程，極大地減少中間步驟，提高轉化效率，成為了目前纖維素酶基因工程的另一個研究方向。表2是對當前纖維素酶基因工程的主要研究情況進行的綜合。

半纖維素酶基因克隆研究起步較晚，其中xylanase作為半纖維素的主要成分——木聚糖降解的關鍵水解酶研究較多。早期研究認為xylanase具有的特殊密碼子，N末端糖基化及要形成特定的二硫鍵，不易在大腸桿菌中功能性表達，后來探究發現糖基化對木聚糖酶酶活性可能影響不大，其后陸續有內切木聚糖酶和β-木聚糖酶于大腸桿菌中表達［44，45］，如Jun等［46］利用噬菌體 T7成功將Trichoderma reesei Rut C-30β-木聚糖酶基因Xyn2（570 bp）在E.coli中表達，所產酶對于樺木木聚糖有60%的水解率，而對麥麩的水解率低于40%。Le等［47］則利用OmsY蛋白成功將一種取自Thermomyces lanuginosus的熱穩定性高的xylanase于E.coli中表達，其融合蛋白具有可溶性，不需要IPTG誘導表達，在pH6.0和65℃獲得最高活性。而在酵母菌中，Okada等［48］將兩種Trichoderma reesei QM9414的xyn1和xyn2在Schizosaccharomyces pombe中表達，分別達到25 mg/mL和170 mg/mL。此外，將木聚糖酶于高產纖維素酶的絲狀真菌表達，也是目前一種提高真菌酶解能力的方法，Rose等［49］通過對甘油醛-6-磷酸脫氫酶的控制，將Trichoderma reesei QM6a的xyn2和egⅠ于Aspergillus niger中表達，且兩者在pH5.0和50℃下保持3 h后，仍有80%以上的酶活力。Beak等［50］分別用能表達T. aurantiacus EGI，T. reesei CBHII 和Aspergillus aculeatus BGLI 的3種酵母菌，按最佳酶配比EGI∶CBHII∶BGLI=6∶2∶1混合發酵產乙醇，達到2.1 g/L乙醇產量，不過其中缺少了半纖維酶，對生物質的利用并不完美。一般而言，半纖維素酶和纖維素酶的反應溫度在45-60℃之間，只是pH要求不同，尋找pH相近且酶活較高的纖維素酶和木聚糖酶，配置合適的酶成分比例，于酵母工程菌中聯合表達，提高對生物質轉化的利用率，可能是一種較好的研究方向。

隨著基因工程技術發展，其生物信息學和基因組學數據的完善，利用蛋白質家族或結構生物信息學對纖維素酶進行理性設計與進化改造，相較于過去基于DNA序列改組，具有更高的效率，同時可以有效地避免重組時的結構坍塌，利于快速篩選出穩定性或其他性能得到提高或改善的突變體。其中SCHEMA、ProSAR、ASR及ROSETTA是較為常見的蛋白質空間結構優化的理性設計算法［23］，其中SCHMA法已成功的用于纖維素酶CBHⅠ和CBHⅡ，并分別獲得Humicola insolens、Chaetomium thermophilum、T. aurantiacus、H. jecorina、Acremonium thermophilum及T. emersonii的高熱穩定性變異菌株［51，52］。

4 結語

能源和環境的壓力迫使我國急需將豐富的秸稈類生物質轉化技術產業化，纖維素酶是目前已知對于該類轉化過程中最好的處理方式之一。以纖維素轉化過程中的兩大問題為主，前者以預處理技術為手段，定性定量分析秸稈生物質結構對酶水解轉化率的影響，細化出酶水解的每一步帶來的生物質結構變化，同時要注意對反應后的廢物下游技術的研究。例如，熱水解后產生的大量廢水，酸堿處理后水中的有毒物質的處理，后者通過對比不同秸稈中的結構成分特點，設計能對其產生最大水解效率的纖維素酶，同時優化選擇出具有更高耐受性的工業生產的菌株，對纖維素酶工業應用進行的深入研究必將促進我國能源生物技術的發展與應用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Advances in Research of Straw Degradation with Cellulase and Its Genetic Engineering

Zhang Senxiang Yin Xiaoyan Gong Zhiwei Yang Zhonghua Hou Yali Zhou Wei
（School of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan430081）

Energy shortage and environmental pollution have become the public focusing issue. Straw biomass with its rich resources，non-polluting and renewable feature， has great application prospect in solving the energy crisis. Converting straw biomass to fermentable sugars by hydrolysis with cellulase and combing with fermentation may produce ethanol， hydrogen and other materials of energy， which has been a mature technology route. The crucial steps of utilizingstraw biomass are the pretreatment of straw biomass and efficient obtaining of glycoside hydrolases. We summarize and analyze the current research from 3 aspects: the structural characteristics of straw and its biological pretreatment；the mechanism of cellulase in hydrolysis of straw biomass； and the gene engineering for cellulase. It has a guiding significance in the promotion of applying straw biomass for energy.

cellulose；cellulase；straw biomass；hydrolysis efficiency of cellulose；cellulase gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.004

2014-08-09

國家自然科學基金項目（21376184），湖北省教育廳科學研究項目（D20121108）

張森翔，男，碩士研究生，研究方向：纖維素酶應用；E-mail：zhangsenxiang421@163.com

楊忠華，博士，教授，研究方向：生物化工；E-mail：yangzh@wust.edu.cn