利用基因組改組技術選育阿維拉霉素高產菌

毛靈琪 李存治 陶興無 閆達中

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢　430023）

利用基因組改組技術選育阿維拉霉素高產菌

毛靈琪 李存治 陶興無 閆達中

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢430023）

為選育阿維拉霉素高產菌株，對野生型綠色產色鏈霉菌（Streptomyces viridochromogenes）Tü57進行傳統物理和化學誘變，并獲得一系列以阿維拉霉素A的含量為指標的正向突變體，再采用基因組改組技術將不同的正向突變體進行融合雜交，獲得融合子。在篩選融合子的過程中，采用傳統薄層色譜（TLC）和管碟法（二劑量法）結合進行初篩、高效液相色譜法進行復篩的篩選策略。經過基因組改組，篩選得到一株高產菌株R708，其在搖瓶實驗中阿維拉霉素A產量達到0.208 g/L，比野生菌株提高了20倍。基因組改組選育阿維拉霉素高產菌，能提高子代菌株的遺傳多樣性，比傳統誘變選育更快速有效。

綠色產色鏈霉菌Tü57；阿維拉霉素；誘變；基因組改組

阿維拉霉素（avilamycin）又稱卑霉素，肥拉霉素，它是綠色產色鏈霉菌（S. viridochromogenes）Tü-57發酵產生的二氯異扁枝衣酸酯，屬于正糖霉素族（orthosomycin）的寡糖類抗生素［1，2］，阿維拉霉素約有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M和N等14種結構組分，其中最具活性的是阿維拉霉素A組分，分子式為C61H88O32Cl2，分子量為1 403。市場上銷售的阿維拉霉素商品中，多為阿維拉霉素A和阿維拉霉素B的混合物。阿維拉霉素主要應用于飼料添加劑中，可顯著提高豬、肉雞等動物日平均增重和飼料報酬率，已在歐美、日本、南美、東亞等地區銷售使用，市場前景廣闊［3］。我國于2005年批準進口，國內對該抗生素的需求量不斷上升。目前國內研究多處于誘變育種階段，選育能夠滿足工業化生產需求的菌株具有重要的實用價值。

傳統阿維拉霉素高產菌株的篩選主要是通過管碟法（二劑量法）［4］和高效液相色譜法來檢測高產菌株，然而大多數鏈霉菌不只產生阿維拉霉素這一種抗生素，用二劑量法測定的抑菌圈計算出來的效價并不完全代表目標抗生素的效價；而高效液相色譜法要求的設備比較昂貴，應用于大規模菌種篩選不僅費時而且成本太高。以本實驗室保存的Tü57為出發菌，通過傳統誘變方法篩選到正向突變體，在此基礎上，通過基因組改組（genome shuffling）技術實現各正向突變株重組［5］，通過將二劑量法和薄層層析色譜法（thin-layer chromatography，TLC）有機結合，篩選高產變異菌株，不僅提高了篩選正向突變株的效率和準確性，而且降低了篩選成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 出發菌株：S. viridochromogenes Tü-57購自德國菌種保藏中心DSMZ。敏感指示菌：藤黃微球菌（Microccus luteus 28001），購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 培養基 （1）YEME培養基［6］：蛋白胨4 g/L，酵母提取物4 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO42 g/L，甘氨酸5 g/L。（2）高氏固體培養基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，FeSO40.01 g，瓊脂20 g，定容1 L，pH7.4。（3）液體種子培養基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，NaCl 5 g，定容1 L，pH7.2-7.4。（4）液體發酵培養基：甘露醇25 g，豆餅粉34 g，可溶性淀粉6.4 g，硫酸銨2.5 g，葡萄糖1 g，MgSO40.05 g，CaCO35 g，定容1 L，pH7.2-7.4。（5）敏感指示菌培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂1.5%，pH 7.0。（6）R2YE培養基［7］：蔗糖103.0 g，K2SO40.25 g，MgCl2·6H2O 10.12 g，葡萄糖10.0 g，水解酪蛋白0.1 g，微量元素溶液2.0 g，酵母膏5.0 g，TES緩沖液57.3 mL，KH2PO4（0.5%）10 mL，CaCl2·2H2O（5mol/L）4 mL，L-脯氨酸（20%）150 mL，NaOH（1 mol/L）7 mL，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 化學試劑 P緩沖液、微量元素溶液、TM緩沖液見參考文獻［7］。

蔗糖，K2SO4，MgCl2·6H2O，FeCl3·6H2O，Zn-Cl2，CuCl2·2H2O，MnCl2·4H2O，分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；Na2B4O7·10H2O，（NH4）6Mo7O24·4H2O，N-3-羥甲基-2-氨基乙磺酸（TES），亞硝基胍（nitrosoguanidine），三（羥甲基）氨基甲烷（Tris），順丁烯二酸均為分析純，購于Sigma-Aldrich。

1.1.4 儀器與設備 超凈工作臺，SW-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫培養振蕩器，ZWYR-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司；酸度計，S220-K，METTLER TOLEDO；離心機，5417R，Eppendorff；HPLC，Agilent 1100，Agilent；顯微鏡，Bio-1000/1000TR，德國Leica。

1.2 方法

1.2.1 TLC薄層色譜［8］展開體系：二氯甲烷∶甲醇（9∶1）。茴香醛顯色劑：甲醇-乙酸-硫酸（8∶1∶1）含1%的茴香醛。

磷酸鹽緩沖液：配制0.2 mol/L的NH4H2PO4和0.2 mol/L（NH4）2HPO4，將適量（NH4）2HPO4滴加到NH4H2PO4溶液中，調pH值為6.0。

1.2.2 通過鏈霉素抗性篩選突變體的前期準備

1.2.2.1 確定篩選突變體的鏈霉素濃度 將制備好的孢子懸液100 μL涂布于含硫酸鏈霉素質量濃度為2 μg/mL-12 μg/mL的高氏固體培養基平板上，每個梯度做3個平行，將相應濃度的孢子懸液涂布于未加抗生素平板上作為對照，28℃條件下培養7 d，待孢子長出后計算菌落形成率和致死率，計算公式：致死率（%） =1-鏈霉素抗性平板上長出的菌落數/未加抗生素對照平板上長出的菌落數×100%

1.2.2.2 確定紫外線誘變劑量 將制備好的孢子懸液置于30 W紫外燈下，30 cm距離條件下照射0-210 s，取100 μL涂布高氏固體培養基平板，每組時間劑量涂布3個平板。28℃條件下培養7 d后計算致死率。

1.2.2.3 確定亞硝基胍（NTG）誘變濃度 將制備好的孢子懸液懸浮于TM緩沖液中，以此懸液來稀釋4℃條件下保存的亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）母液（溶劑為四氫呋喃），最終獲得5-100倍稀釋的NTG母液。以用TM緩沖液懸浮的孢子懸液做空白對照，30℃水浴條件下保溫處理1 h，8 000 r/min離心沉淀孢子，以無菌水洗滌3次，每個濃度取100 μL涂布高氏固體平板，做3組平行。28℃培養7 d，記錄經過不同NTG濃度處理后孢子萌發形成的菌落數，計算致死率。

1.2.3 初篩阿維拉霉素高產菌株 將經紫外線（照射90 s）或NTG（NTG的四氫呋喃飽和溶液經TM緩沖液稀釋20倍）誘變過的菌株孢子涂布到鏈霉素（8 μg/mL）抗性平板上，當菌落長出孢子后刮取菌落孢子接種到裝有20 mL種子培養基的250 mL三角搖瓶內，28℃、180 r/min條件下培養60 h。然后以6%的接種量轉接到20 mL的發酵培養基上，28℃、180 r/min條件下培養96 h后補加葡萄糖至終質量濃度為20 g/L，再培養48 h后終止發酵。

將經發酵培養好的菌液振蕩混勻，取5 mL菌液置于50 mL的離心管內，離心去上清后加入5 mL丙酮，振蕩提取1 h。5 000 r/min條件下離心10 min取上清液，直接將上清液加入到牛津杯中，以二劑量法檢測上清液的效價［4］。將上清液加入等體積的二氯甲烷，靜止分層后取二氯甲烷層，定量吸取5 μL點樣于硅膠薄層層析板上。以二氯甲烷∶甲醇（9∶1）展開劑展開，噴以茴香醛顯色劑，鼓風干燥箱內200℃條件下顯色1 min，當樣品中阿維拉霉素A含量超過70 μg/mL時，可在硅膠板上形成清晰的黑色條帶。保留抑菌圈大且用TLC色譜法能檢測到有效成分的菌株。

1.2.4 高效液相色譜法對高產菌的復篩［9］將初篩高產菌株發酵液取適量體積置于1.5 mL的離心管內，真空干燥箱內揮發干，以丙酮-磷酸鹽（7∶3）重溶。以安捷倫高效液相色譜儀檢測樣品中有效成分的含量。流動相∶乙腈-0.2%（g∶mL）磷酸二氫銨溶液（用磷酸調節pH 值至3.0）（50∶50，V/V），檢測波長：214 nm ，柱流量：1 mL/min。安捷倫C18反相柱（5 μm；4.6 mm×250 mm），紫外可見吸收檢測器（UVD）。

1.2.5 基因改組技術重組各不同誘變來源的正向突變體

1.2.5.1 確定溶菌酶的處理時間［7］將出發菌株接種到YEME液體培養基中搖瓶培養96 h后用組織研磨器磨碎，取1 mL菌液離心去上清，然后加入用P緩沖液配制的濃度為1 mg/mL的溶菌酶溶液1 mL，30℃水浴條件下處理40 min后取100 μL用無菌水稀釋10倍，涂布再生平板，每隔10 min取樣一次。長出的菌落即認為是未去壁的孢子（以C表示）。用P緩沖液同法處理作為對照，長出的菌落以B表示。將酶解前的孢子涂布于高氏固體培養基上，30℃條件下培養4 d后計菌落數（以A 表示）。細胞破壁率計算公式如下：

細胞破壁率（%）=（B-C）/A×100%

1.2.5.2 原生質體隨機融合重組 將經溶菌酶處理1 h的菌體取出，用P緩沖液洗滌2次，再加5 mL的P緩沖液，用裝有脫脂棉的試管過濾，濾液轉入塑料離心管，將不同親本的原生質體懸液等量混合，離心富集原生質體后加0.8 mL含50%的PEG的P緩沖液，室溫下靜置2 min。取100 μL涂布到R2YE再生培養基平板上，用接種環鋪開原生質體懸液，28℃條件下培養24 h后再倒置培養。待菌落長出后，按1.2.3的方法初篩重組菌株，按1.2.4方法復篩重組菌株。進行20-30輪反復融合，篩選。

2 結果

2.1 篩選突變菌株的鏈霉素濃度

不同質量濃度鏈霉素對孢子致死率（圖1）顯示，致死率隨著鏈霉素濃度的增加而增加，當鏈霉素含量達到8 μg/mL時致死率已經高達90%。由于放線菌正向突變較多的出現在高致死率的條件下，因此確定鏈霉素質量濃度為8 μg/mL作為篩選高產菌株的敏感濃度。

圖1 鏈霉素對S. viridochromogenes Tü57的抑菌效果

2.2 紫外線誘變的照射劑量的確定

為了確定合適的紫外線處理時間，對待處理菌懸液分別用紫外線處理50-210 s，計算致死率。結果（圖2）顯示。致死率隨紫外照射時間延長而上升，當紫外照射時間達到90 s時，孢子致死率已高達99.7%。通常在高的紫外劑量下更易獲得高產菌株，以90 s紫外照射劑量誘變處理孢子。

圖2 紫外線對S. viridochromogenes Tü57的致死率

2.3 NTG誘變的濃度的確定

不同稀釋倍數的NTG母液對鏈霉菌孢子的致死率（圖3）顯示，高濃度NTG對孢子有很強的致死效應，隨著稀釋倍數的增加，NTG濃度的降低，對孢子的致死率逐步下降。當以20倍濃度稀釋的NTG母液誘變出發菌株孢子時，孢子的致死率達到了97%，選取以20倍濃度稀釋的NTG母液誘變處理孢子。

2.4 TLC檢測阿維拉霉素A含量

離心收集突變體發酵后菌絲體，丙酮萃取后，加入等體積的二氯甲烷，靜止分層后取二氯甲烷層5 μL點樣于硅膠薄層層析板上，展層，茴香醛顯色。樣品及標準品的TLC檢測結果（圖4）表明，樣品中不同濃度的阿維拉霉素A，顯色條帶顏色深淺也會有所區別。當樣品中阿維拉霉素A濃度超過70 μg/mL，上樣量達到5 μL，經展層顯色后，可在展層板上看見明顯的黑色條帶，其Rf值約為0.4。

圖4 薄層層析色譜圖

2.5 鏈霉素抗性篩選紫外線誘變菌株和NTG誘變

菌株的結果

將孢子經紫外誘變或NTG誘變后，涂布于鏈霉素抗性平板，管碟法（二劑量法）和TLC初篩突變株，再經過高效液相色譜法完成高產菌株的復篩，篩選到來源于紫外誘變的高產菌株UV-589、UV-1432，產量分別比出發菌株（avilamycin A，10.40 μg/mL）提高了430%和446%（表1）；篩選到來源于NTG誘變的高產菌株N-639、N-2326，產量分別比出發菌株提高了517%和532%（表2）。

表1 紫外誘變篩選高產突變株結果

表2 NTG誘變篩選高產突變株結果

2.6 菌株經溶菌酶處理的破壁時間

實現不同突變體UV-589、UV-1432、N-639和N-2326的原生質體雜交融合，需要確定最佳去壁效果，用P緩沖液配制1 mg/mL的溶菌酶溶液處理菌體40-90 min不同時間，計算破壁率。結果（圖5）顯示，隨著溶菌酶處理菌體時間的延長，破壁率增加。當用1 mg/mL的溶菌酶處理相對最短時間1 h后，菌體破壁率已接近100%。因此，選擇溶菌酶處理時間為1 h。

圖5 溶菌酶破壁效果曲線圖

2.7 高效液相色譜對高產菌株（融合子）進一步

篩選和確定

將紫外誘變和亞硝基胍誘變后獲得突變株UV-589、UV-1432、N-639和N-2326進行雜交融合，經過幾十輪的基因組改組，獲得融合子。將菌株接種培養，發酵液經1.2.3所述方法處理后，利用薄層色譜法和管碟法初篩阿維拉霉素高產菌株，然后選擇其中較高的融合子的發酵液，通過高效液相色譜進一步測定阿維拉霉素A的含量，復篩高產量菌株，獲得一株高產菌株R708，阿維拉霉素A產量較出發菌株提高了20倍，搖瓶發酵阿維拉霉素A產量達到0.208 g/L。原始菌株的高效液相圖譜，見圖6，菌株R708的高效液相圖譜，見圖7。阿維拉霉素A的保留時間為22.258 min

圖6 出發菌株的發酵液的高效液相色譜圖

2.8 高產菌株的穩定性

采用平板連續傳代的方法測定R708菌株的遺傳穩定性，當R708傳到第50代時，隨機挑取20個單菌落，接種培養后測定阿維拉霉素的產量，其中14株阿維拉霉素的產量沒有改變，6株阿維拉霉素的產量下降。傳代結果表明R708隨著傳代次數的增加，部分菌株產量會下降。

3 討論

抗生素是一類次級代謝產物，涉及初級代謝和次級代謝多種酶系，調控機制復雜。雖然經典的隨機誘變、定向篩選的育種方法工作量大，周期長，隨機性強，效率低，很難在短時間內獲得高產量的正向突變株，但是依然是目前使用的主要育種手段。賀亞男等［10］對綠色產色鏈霉菌SV-1進行了氮離子注入技術，輔之以鏈霉素抗性篩選進行選育，使阿維拉霉素產量達到83.5 mg/L，較出發菌株提高195%。梁新樂等［4］以綠色產色鏈霉菌A-05為出發菌株，60Co γ射線、NTG誘變等多種手段進行誘變，以阿維拉霉素、鏈霉素、2-脫氧-D-葡萄糖和α-氨基丁酸抗性為篩選壓力，在獲得3個高產突變株的基礎上，再進行基因組重組，獲得高產菌株A11-13，發酵單位達1 318.7 mg/L，比出發A-05菌株提高了202.9倍。趙碩珍［11］以紫外線隨機誘變結合阿維拉霉素、2-脫氧-D-葡萄糖和高濃度CaCl2抗性篩選的推理選育方案，使阿維拉霉素產量達1 222 μg/mL，該高產菌株已經具備工業化的應用潛力。由此可見，利用多重誘變手段多次誘變比單一的誘變手段更有可能選育出阿維拉霉素高產菌。而在選育過程中，建立高通量的篩選方法，從大量的突變體中篩選出產量正向突變體也非常關鍵。

圖7 菌株 R708發酵液的高效液相色譜圖

Genome shuffling是在整個微生物基因組水平上進行重排的技術，經過遞推式多次融合，使基因組在較大范圍內發生交換和重組，將引起正向突變的不同基因重組到一個細胞中。它比傳統誘變選育更快速有效，能提高子代菌株的遺傳多樣性。近年來，利用基因組技術成功選育脂肪酶［12］、谷氨酸［13］和vitB12［14］高產菌株的報道證明，基因組改組技術是一種行之有效的育種方法。

本研究在紫外誘變和亞硝基胍誘變獲得幾種不同的正向突變株的基礎上，采用基因組重組技術將各正向突變體親本進行雜交融合，篩選整合各正向突變的重組子代（融合子）。改進篩選方法，將傳統的薄層色譜（TLC）及管碟法（二劑量法）結合應用進行初篩，可高通量檢測多個樣品，再以高效液相色譜法進行高產菌株的復篩。縮短了篩選時間，提高篩選效率。經過多輪基因組改組后，從大量的融合子中篩選到了一株高產菌株R708，搖瓶發酵產量達到0.208 g/L。本研究為阿維拉霉素的開發和應用奠定了基礎。

4 結論

本研究以不同的誘變方法篩選獲得的各種產量正向突變體作為突變體庫，經過幾十輪的基因組改組，并采用改進的篩選方法，從大量的融合子中篩選到了一株高產菌株R708，其產量比出發菌株提高了20倍，搖瓶發酵產量達到0.208 g/L。

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（責任編輯 狄艷紅）

Screening and Breeding Strains Producing High-yield Avilamycin by Genome Shuffling

Mao Lingqi Li Cunzhi Tao Xingwu Yan Dazhong
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan430023）

In order to screen strain producing high-yield avilamycin by mutagenesis， a wild-type strain Streptomyces viridochromogenes Tü57 was treated by a series of traditionally physical and chemical mutagenesis， resulting in the acquisition of numbers of forward mutants while judged by the great improvement in avilamycin A production. Genome shuffling was then carried out to fuse different sources of forward mutants， following with various fusants harvestry. The screening strategy adopted the combination method of thin layer chromatography （TLC） and cylinder-plate （two dosages technique） as the primary test， and high performance liquid chromatography （HPLC） as the secondary test. A mutant producing high-yield avilamycin， designated as R708， was obtained. The yield of avilamycin A from this mutant reached to 0.208 g/L in the shake flask experiment， which was a 20-fold increment compared to that of the wild-type strain. Our conclusion is that genome shuffling could increase the genetic diversity of the offspring strains； therefore this method is more quickly and efficiently than traditional mutagenesis in breeding strains producing high-yield avilamycin.

Streptomyces viridochromogenes Tü57；avilamycin；mutagenesis；genome shuffling

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.009

2014-09-16

湖北省自然科學基金項目（2008CDB067）

毛靈琪，女，碩士研究生，研究方向：微生物學；E-mail：qzjsmlq@163.com

閆達中，男，博士，副教授，研究方向：微生物學；E-mail：yandz6808@163.com