適于雙向電泳分析的酵母胞外蛋白提取方法

杜維樸永哲黃瑋谷月趙長(zhǎng)新

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連　116034；2.大連民族學(xué)院，大連　116600）

適于雙向電泳分析的酵母胞外蛋白提取方法

杜維1樸永哲2黃瑋1谷月1趙長(zhǎng)新1

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連116034；2.大連民族學(xué)院，大連116600）

采用了無蛋白酵母培養(yǎng)基培養(yǎng)FFC2144酵母細(xì)胞，用硫銨沉淀法、超濾法、凍干酚提等方法提取酵母胞外蛋白，計(jì)算3種方法的提取率并分別用雙向電泳的方法對(duì)提取到的蛋白樣品進(jìn)行分離，同時(shí)運(yùn)用質(zhì)譜鑒定分離后蛋白。其中凍干-平衡酚法提取后得到114個(gè)蛋白點(diǎn)，提取率為73.67%，圖譜識(shí)別的蛋白點(diǎn)最多圖譜最清晰，是研究分泌類蛋白質(zhì)組學(xué)理想的分離方法。

釀酒酵母；胞外蛋白；雙向電泳；提取方法

酵母作為首先完成基因組測(cè)序的低等真核生物因其遺傳背景清楚、無毒且易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)無論是用作基因工程的表達(dá)載體，還是在工業(yè)生產(chǎn)中都有著廣泛的應(yīng)用［1］。胞外蛋白是存在于培養(yǎng)介質(zhì)中的酵母分泌蛋白質(zhì)，起初在應(yīng)用酵母進(jìn)行釀造的過程中被人們所發(fā)現(xiàn)。最初的研究認(rèn)為蛋白質(zhì)作為一種能量物質(zhì)是不會(huì)被微生物排出細(xì)胞外［2］，后續(xù)的研究表明在培養(yǎng)介質(zhì)中確實(shí)存在蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，胞外蛋白逐漸被人們所重視并加以研究。楊靜等［3］對(duì)已公布的釀酒酵母6 700個(gè)蛋白質(zhì)序列做N端分析后發(fā)現(xiàn)163個(gè)蛋白有潛在的信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，是通過Sec-途徑分泌的胞外蛋白。胞外蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和調(diào)控方面起著重要的作用［4］，胞外蛋白是酵母蛋白質(zhì)組學(xué)中不可缺少的一部分。此外，在釀造工業(yè)中發(fā)酵液的蛋白質(zhì)成分直接決定著產(chǎn)品的品質(zhì)與不同批次產(chǎn)品之間的穩(wěn)定性，即使在相同條件下釀酒酵母的胞外分泌產(chǎn)物的組成也不盡相同，所以對(duì)酵母胞外蛋白的研究在生產(chǎn)上也具有一定的實(shí)際意義。同時(shí)酵母已經(jīng)成為基因工程表達(dá)的載體，分泌蛋白的研究對(duì)其高效表達(dá)分泌外源蛋白的效率有著指導(dǎo)意義。

胞外蛋白與胞內(nèi)蛋白相比具有含量低、隨機(jī)性大、樣品易被修飾（糖基化、磷酸化）等易造成提取困難的特點(diǎn)［5］。根據(jù)上述特點(diǎn)胞外蛋白的提取包括濃縮和除雜這兩個(gè)過程，且操作盡量在低溫短時(shí)間內(nèi)完成。雙向電泳作為一種高通量的手段在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中有著顯著優(yōu)勢(shì)［6］，同時(shí)又可以與蛋白質(zhì)印跡、質(zhì)譜等下游技術(shù)相結(jié)合對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行下一步分析。蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜的質(zhì)量與所提蛋白的純度密切相關(guān)，如何權(quán)衡提取方法與時(shí)間的關(guān)系成為得到高質(zhì)量圖譜的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過對(duì)3種酵母胞外蛋白提取方法的比較優(yōu)化確立最適宜雙向電泳的胞外蛋白提取條件，并選取5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，旨為酵母胞外蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 Saccharomyces cerevisiae FFC 2144（大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心）。

1.1.2 儀器 高速冷凍離心機(jī)H2050R-1（湘儀）；雙向電泳槽DYCZ-26B（北京六一）；冷凍干燥機(jī)VFD2000（北京博醫(yī)康）；恒溫?fù)u床ZWYR-2101C（智城）；三維搖床SK-D3309-Pro（大龍）；超濾儀（Congent）；臺(tái)式四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Thermo Scientific）。

1.1.3 藥品 載體兩性電解質(zhì)pH4-6.5 載體兩性電解質(zhì) pH3-10（General Electric Company）；過硫酸銨、丙酮、苯酚、尿素（科密歐，優(yōu)級(jí)純），甲醇（科密歐，色譜純）；ASB-14 硫脲、CHAPS、色氨酸、組氨酸、YNB、精氨酸、丙烯酰胺、SDS（阿拉丁）。

1.1.4 培養(yǎng)基 采用改良無蛋白質(zhì)的全合成YNB培養(yǎng)基［7］，葡萄糖2%，（NH4）2SO41%，YNB 0.67%，DL-蘋果酸0.6%，酒石酸0.2%，色氨酸0.5‰，組氨酸0.5‰，精氨酸0.5‰。

1.2 方法

1.2.1 菌體生長(zhǎng)曲線的繪制與培養(yǎng)基蛋白含量的測(cè)定 將活化后的酵母細(xì)胞接種到Y(jié)NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（接種后的細(xì)胞量為100 CFU/mL，28℃，160 r/min）。每24 h取樣稀釋涂平板測(cè)定發(fā)酵液菌體濃度并用Bradford法［8］測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果確定胞外蛋白的最佳提取時(shí)間。

1.2.2 硫銨沉淀法提取蛋白 向離心過膜（0.22 μm）后的發(fā)酵液緩慢加入飽和（NH4）2SO4溶液，使發(fā)酵液中（NH4）2SO4終濃度達(dá)到80%。加入過程中保持冰水浴并緩慢攪拌，同時(shí)防止氣泡生成。沉淀過程完成后將溶液在4℃下過夜，次日在10 000×g條件下離心10 min。采用截留分子量為5 kD的透析袋對(duì)沉淀進(jìn)行透析除鹽6 h，每2 h更換一次透析液。然后將透析后的蛋白質(zhì)溶液冷凍干燥制成干粉（包括透析后仍不能溶解的沉淀），-80℃保存。

1.2.3 超濾法提取蛋白 采用截留分子量為5 kD的超濾膜對(duì)過膜后的發(fā)酵液進(jìn)行冰水浴濃縮至上樣濃度（100 μg/80 μL）后直接上樣。

1.2.4 凍干/平衡酚-丙酮沉淀法提取蛋白 將過膜后的發(fā)酵液直接凍干濃縮至80 mL，加入等體積的Tris-平衡酚（1 mol/L，pH8.0）冰浴攪拌30 min后離心棄上清，保留酚相及中間層。加入3倍體積的濃度為100 mmol/L的乙酸銨-甲醇后與-20℃過夜，次日離心后的沉淀先用含有0.1%（W/V）DTT的冷丙酮清洗，再用冷丙酮清洗2次，每次10 min。清洗后的蛋白進(jìn)行真空干燥除去殘余丙酮，于-80℃保存。

1.2.5 蛋白樣品的溶解及定量 取保存的蛋白質(zhì)干粉溶于適量的裂解液中（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% CHAPS，2% ASB-14，20 μL pH3-10兩性電解質(zhì)，0.1% DTT）4℃過夜并用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)裂解液體積估算蛋白質(zhì)提取率，并將裂解液稀釋至上樣所需濃度。

1.2.6 蛋白樣品的雙向電泳

1.2.6.1 等電聚焦 IEF膠條的制作 取540 μL H2O，200 μL 30%丙烯酰胺，0.6 g尿素，pH4-6載體兩性電解質(zhì)4.8 μL，pH3-10載體兩性電解質(zhì)24 μL，5 μL 10%過硫酸銨，4 μL TEMED混勻并緩緩注入到玻璃管中（12 cm），室溫聚合。等電聚焦電壓如表1所示。

表 1 等電聚焦程序和參數(shù)

1.2.6.2 膠條平衡 首先將等電聚焦后的膠條由玻璃管的一端擠出放入含有0.2 g/mL DTT的平衡液中平衡15 min，然后再置于0.2 g/mL碘乙酰胺中平衡17 min。平衡液：6 mol/L尿素，20%（V/V）甘油，2% SDS，50 mmol/L Tris-HCl（pH8.8，1.5 mol/L）。

1.2.6.3 SDS-PAGE 將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到12%濃度的二維膠上進(jìn)行恒流電泳，參數(shù)為20 mA/gel 15 min，40 mA/gel直至溴酚藍(lán)移動(dòng)到膠條的最低端。

1.2.7 蛋白染色 Neuhoff考染法［9］。

1.2.8 質(zhì)譜分析 從最優(yōu)的圖譜中隨機(jī)選取5個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行脫色、胰酶酶解、質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

1.2.9 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 將質(zhì)譜得出的結(jié)果導(dǎo)出，在NCBI上得到蛋白質(zhì)序列，利用信號(hào)肽在線預(yù)測(cè)工具SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白序列中是否含有Sec途徑信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 菌體生長(zhǎng)與培養(yǎng)基蛋白含量的關(guān)系

如圖1所示，經(jīng)過活化的酵母接種后直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在48 h達(dá)到穩(wěn)定期，菌種濃度達(dá)到108CFU/mL。胞外蛋白在對(duì)數(shù)期時(shí)產(chǎn)生量很少，因?yàn)榘獾鞍讓儆诖渭?jí)代謝產(chǎn)物，在進(jìn)入穩(wěn)定期后含量逐漸增加。在培養(yǎng)120 h之后培養(yǎng)基中蛋白含量直線上升伴隨著菌種數(shù)的下降。原因是有部分菌體發(fā)生自溶，細(xì)胞液釋放到培養(yǎng)基中。從圖1可以得出培養(yǎng)96 h可以作為胞外蛋白的最佳提取時(shí)間。同時(shí)取96 h的酵母細(xì)胞經(jīng)掃描電鏡分析結(jié)果，（圖2）顯示酵母呈橢圓狀，形態(tài)均一且表面光滑，無細(xì)胞自溶和細(xì)胞質(zhì)外泄等情況。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間下菌體濃度與發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量

圖2 培養(yǎng)96 h酵母細(xì)胞掃描電鏡圖（1 000×）

2.2 三種方法提取率

經(jīng)過多次平行試驗(yàn)，由蛋白質(zhì)裂解液中蛋白質(zhì)含量與發(fā)酵液中總蛋白的含量之比換算出蛋白質(zhì)提取率。樣品經(jīng)雙向電泳分離后用PDquest 8.0分析結(jié)果，如圖3所示，硫銨沉淀法提取率低，提取的蛋白中主要為高豐度蛋白，得到的蛋白點(diǎn)少。凍干法的提取率較超濾法提高了30.78%，蛋白點(diǎn)數(shù)增加了83.87%。蛋白點(diǎn)數(shù)與蛋白質(zhì)的提取率呈正相關(guān)，當(dāng)提取率達(dá)到60%以上時(shí)低豐度蛋白才會(huì)在圖譜上顯現(xiàn)。

圖3 不同提取方法的提取率與蛋白點(diǎn)個(gè)數(shù)

2.3 不同方法提取蛋白的雙向電泳圖譜

分別將3種方法得到的蛋白質(zhì)樣品溶于裂解液中，定量之后以3 g/L的濃度上樣40 μL。經(jīng)過IEF及SDS-PAGE分離，最后用考馬斯染色液染色得到結(jié)果（圖4）顯示，凍干-平衡酚法蛋白點(diǎn)清晰，且拖尾的蛋白點(diǎn)較少，分離效果最好。硫酸銨沉淀法有大面積拖尾分離效果較差，而超濾法有部分蛋白未完全分離。

圖4 硫酸銨沉淀（a）、超濾（b）、凍干-平衡酚（c）提取蛋白的雙向電泳圖譜

2.4 質(zhì)譜分析結(jié)果

從最清晰的凍干法圖譜中隨機(jī)選取5個(gè)清晰的蛋白點(diǎn)作質(zhì)譜分析，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果（表2）顯示檢測(cè)匹配到4個(gè)蛋白點(diǎn)，剩余1個(gè)蛋白點(diǎn)未在數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配到。原因可能是蛋白發(fā)生修飾（糖基化、磷酸化）或降解導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)或分子量發(fā)生變化，肽段不能得到匹配。這種修飾細(xì)胞內(nèi)亦或是細(xì)胞外都有可能發(fā)生。檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)中有兩個(gè)經(jīng)SignalP 4.0 Server分析有信號(hào)肽剪切位點(diǎn)屬于分泌蛋白，3-4根據(jù)其存在位置確定為膜蛋白。蛋白點(diǎn)3為蛋白質(zhì)跨膜通道蛋白，其功能包括參與將特異性蛋白整合進(jìn)細(xì)胞膜或者將其完全分泌細(xì)胞外。

表2 質(zhì)譜分析與信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

在真核細(xì)胞中分泌蛋白合成于與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖體上，核糖體合成出的多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中得到修飾，最后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。其中發(fā)生的修飾中最主要的為糖基化，對(duì)于某些蛋白質(zhì)來說，只有經(jīng)過糖基化修飾后蛋白質(zhì)分子才能正確折疊。正是由于這些修飾的存在給蛋白質(zhì)的分離分析帶來難度。同時(shí)分泌類蛋白質(zhì)本身在發(fā)酵液中含量很低，常規(guī)的分離方法很難達(dá)到后續(xù)分析的要求。本試驗(yàn)用3種不同的濃縮分離方法，以雙向電泳圖譜為依據(jù)確定了胞外蛋白的最適提取方式。

硫銨沉淀法是利用高濃度的鹽離子破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜使蛋白質(zhì)溶解度降低，從而使蛋白質(zhì)在溶液中析出與水溶性雜質(zhì)分離。此方法提取蛋白得到的電泳圖譜斑點(diǎn)模糊，因?yàn)榱蜾@沉淀法對(duì)胞外蛋白的提取步驟多、周期長(zhǎng)（1-2 d），在此過程中蛋白質(zhì)很容易被修飾或者降解。其通過對(duì)發(fā)酵液總蛋白質(zhì)以及裂解液中蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析得出提取率在48%-52%之間，在提取高豐度蛋白時(shí)宜使用此方法。酵母發(fā)酵液中多糖含量高，采用硫銨沉淀法提取蛋白過程中不能達(dá)到預(yù)期除糖效果，增加了蛋白質(zhì)在提取過程中被修飾的可能。如果蛋白質(zhì)經(jīng)過不同程度的糖基化和磷酸化修飾，其不再能反映原有蛋白的等電點(diǎn)與分子量，在雙向電泳圖譜中會(huì)形成彌散的條帶與大面積的拖尾。要想解決此問題可以對(duì)提取到的蛋白進(jìn)行去糖基化和去磷酸化，但此過程中會(huì)帶進(jìn)新的雜質(zhì)和提高提取成本。

超濾法提取蛋白操作簡(jiǎn)便，整個(gè)過程中不加入任何的試劑，不經(jīng)過劇烈的相變化，條件最為溫和。其提取率比硫銨沉淀法高，低豐度蛋白也被更好地保留下來。從圖譜上可以看到大部分的蛋白點(diǎn)都能被很好地顯示出來。但在A、B處出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的拖尾，A、B處的拖尾在經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化后仍不能被很好地除去，原因是蛋白質(zhì)被不同程度地糖基化或磷酸化修飾。由于B處的蛋白點(diǎn)在超濾法中非常清晰，可以說明這種蛋白質(zhì)修飾發(fā)生在提取的過程中。

凍干在操作過程中作為將發(fā)酵液濃縮的一種方式將發(fā)酵液濃縮至60 mL，在濃縮發(fā)酵液的同時(shí)溶液中含有大量的多糖也得到濃縮，導(dǎo)致發(fā)酵液的凝固點(diǎn)降低到-15℃以下，固體表面黏稠，嚴(yán)重影響凍干效率。凍干后的平衡酚—醋酸銨/甲醇沉淀操作是蛋白質(zhì)損失的主要原因，平衡酚提取的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)在與有機(jī)試劑作用后變性不溶于水的特點(diǎn)，同時(shí)平衡酚也是提取核酸的方法。在分離過程中蛋白質(zhì)停留在中間相及酚相中，多糖和核酸等易造成蛋白點(diǎn)拖尾的雜質(zhì)存在于水相中。凍干法與超濾法的譜圖類似，可以很好地相互識(shí)別。雖然在A處依然出現(xiàn)拖尾的條帶，但在圖上可以清晰地看到蛋白點(diǎn)說明凍干-平衡酚法能有效解決硫銨沉淀與超濾方法中蛋白點(diǎn)拖尾的問題。相比于前兩種方法，凍干-酚提方法不但提取率高、識(shí)別的蛋白點(diǎn)多而且圖譜質(zhì)量最好，是分離制備分泌蛋白樣品的理想方法。

質(zhì)譜結(jié)果表明胞外環(huán)境中存在少量細(xì)胞壁上脫落的蛋白亦或是由酵母分泌小泡排出的非活性蛋白，這些蛋白是如何從酵母細(xì)胞上脫落的，以及是否還有其他新的分泌方式需要人們進(jìn)一步解決驗(yàn)證。酵母胞外蛋白質(zhì)組學(xué)的開展可以極大地豐富人們對(duì)細(xì)胞代謝通路的了解，也可以與生物信息學(xué)相結(jié)合為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供一個(gè)新的思路。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)選取了硫銨沉淀、超濾、凍干-平衡酚等3種不同的濃縮除雜方法提取Saccraomyces cerevsiae FFC2144胞外蛋白。用雙向電泳得出3種提取條件下胞外蛋白圖譜，選取5個(gè)點(diǎn)做質(zhì)譜鑒定。其中凍干-平衡酚-丙酮沉淀法具有提取率高、圖譜清晰、較低豐度蛋白可以被保留等優(yōu)點(diǎn)，可以很好地與雙向電泳、LC-MS等下游技術(shù)相結(jié)合，適于作為胞外蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的提取方法。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Procedure to Prepare Samples for Two-dimensional Electrophoresis of Secreted Proteins from Saccharomyces cerevisiae

Du Wei1Piao Yongzhe2Huang Wei1Gu Yue1Zhao Changxin1
（1. School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian116034；2. Dalian Nationalities University，Dalian116600）

Saccraomyces cerevsiae FFC2144 was cultured in nitrogen base medium without protein. The secretory proteins of yeasts were extracted by ammonium sulfate precipitation， ultrafiltration and lyophilization-phenol extraction respectively. Extraction rates by 3 methods were calculated and the proteins were separated by two-dimensional electrophoresis. The proteins isolated were confirmed by MALDI-TOF-MS. The extraction rate by lyophilization-phenol method was 73.67% and 114 protein spots were obtained with the most protein spotsand clearest electrophoretogram. Lyophilization-phenol method could be an ideal separation method for studying secretory proteomics.

Saccharomyces cerevisiae；secretory protein；two-dimensional electrophoresis；extraction method

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.012

2014-09-12

杜維，男，碩士，研究方向：酵母蛋白質(zhì)組學(xué)；E-mail：foredu119@hotmail.com

趙長(zhǎng)新，男，教授，研究方向：啤酒酵母生理代謝、啤酒大麥制備工藝及生理；E-mail：zhaocx@dlpu.edu.cn