甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP檢測方法的建立

呂沁風 羅鵬 何蕾 楊永耀 鄭偉 李莉 吳忠華

（浙江國際旅行衛生保健中心，杭州　310003）

甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP檢測方法的建立

呂沁風 羅鵬 何蕾 楊永耀 鄭偉 李莉 吳忠華

（浙江國際旅行衛生保健中心，杭州310003）

建立一種新型等溫擴增檢測方法，用于提高等溫擴增反應的檢測速度，應用于甲型H1N1流感病毒檢測。根據HA基因設計一組引物，包括外引物、內引物、環引物及套內引物，套內引物的加入增加了引物與模板的接觸位點，提高擴增效率，縮短檢測時間。結果顯示，FAST-LAMP檢測法比普通LAMP檢測法時間縮短45 min左右，比加入環引物的LAMP檢測方法縮短20 min，大大縮短了反應的檢測時間。檢測靈敏度可達到1×102拷貝。FAST-LAMP是一種高效、更快的檢測方法。

FAST-LAMP；甲型H1N1流感病毒；檢測

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴增技術，該方法針對靶基因的6個區域設計4種引物，在等溫60-65℃條件下利用Bst聚合酶即可進行109-1010倍的核酸擴增［1，2］。LAMP產物通過濁度或者熒光變化可用肉眼觀察，具有操作簡便、特異性強、靈敏度高等優點［3，4］。自2000年環介導等溫擴增技術問世以來，該方法在病原體檢測、疾病診斷等領域廣泛應用［5-8］。如何在現有的LAMP技術基礎上，發掘更高效快速的等溫擴增方法，成為重要的研究方向，目前最快速的LAMP反應方法是加入環引物［9，10］。本研究設計一種新型快速的等溫擴增方法，改變其現有的引物設計方法，使環介導等溫反應擴增完成的時間比加入環引物所用的時間更短。

流行性感冒病毒，屬于正黏液病毒科，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，它會造成急性上呼吸道感染，并在空氣中迅速傳播，在世界各地常會有周期性的大流行［11，12］。人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感病毒是變異最為頻繁的一個類型［13］。2009年起源于墨西哥的的甲型H1N1流感病毒爆發流行造成全球數千萬人大流行，死亡人數達到1 800多人［14，15］。在大流行后期，該病毒仍在流行，實驗室檢測證實該病毒在2013年仍為歐洲、亞洲等地流感的流行株［16-23］。2013年美國、中國內地仍有死亡病例報道［24-27］。本試驗以甲型H1N1流感為例研究新型快速等溫擴增檢測，旨在為了建立新型等溫擴增方法，提高檢測速度提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購用QIAGEN公司，AMV逆轉錄酶購自Promega公司，Bst-DNA polymerase購自NEB公司。TaKaRa Ex Taq酶和dNTP購自TaKaRa公司，RNase Inhibitor購自Fermentas公司，MgSO4和Betain為Sigma-Aldrich公司產品，EVA Green購自Biotium公司、DNA Marker DL2000和瓊脂糖Agrose 購自TaKaRa公司。甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、水痘病毒、副流感病毒、人偏肺病毒等為本室保存。

1.1.2 儀器 2720型PCR儀和7500型熒光定量PCR儀購置購自ABI公司，電泳儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 常規LAMP技術含有一對外引物，一對內引物，選擇加入一對環引物，可在等溫條件下進行核酸擴增。本研究根據甲型H1N1流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）基因保守區設計一組引物族［20，27］，引物的設計是在帶有環引物的外FIP1和外BIP1的擴增產物區域再次設計內FIP2和內BIP2引物，使得FIP1和BIP1的產物能再次成為FIP2和BIP2的LAMP擴增模板，FIP1和BIP2、FIP2和BIP1也同時形成正常的LAMP擴增系統。即本套引物同時形成了4套獨立的LAMP擴增系統，從而使擴增速率增加。引物序列，見表1。

表1 甲型H1N1流感病毒核酸FAST-LAMP擴增引物

1.2.2 病毒RNA的提取 嚴格按QIAGEN RNA抽提試劑盒說明書提取病毒RNA，溶于100 μL無RNase水中，-70℃保存。

1.2.3 反應體系及反應條件 FAST-LAMP反應體系如下：10×buffer 2.5 μL，引物混合物1 μL（引物混合物中各引物濃度分別如下：F3、B3各1 μmol/L，FIP、BIP各15 μmol/L，Loop-f、Loop-r各5 μmol/L， FNP、BNP各15 μmol/L），模板RNA 1 μL，8 U Bst-DNA聚合酶1 μL，10 U AMV逆轉錄酶1 μL，甜菜堿（8 mol/L）2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.2 μL，1.25 μL 20× 的 Eva green加入DEPC-H2O補足25 μL。普通RT-LAMP反應體系除引物混合物為（引物混合物中各引物濃度分別如下：F3、B3各 1 μmol/L，FIP、BIP各 15 μmol/L），加入環引物的引物混合物為（F3、B3各1 μmol/L，FIP、BIP各15 μmol/L，Loop-f、Loop-r各5 μmol/L），其他與FAST-LAMP一致，反應條件為：63℃，55 s，熒光采集5 s，100個循環在熒光定量PCR儀（Chromo4-Bio-Rad公司）中進行。引物混合物中各引物濃度，見表2。

1.2.4 靈敏度試驗 利用反轉錄試劑盒中的隨機引物法將提取好的RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，用PCR引物進行擴增，將PCR產物純化回收試劑盒進行純化回收，對純化后的PCR產物測定OD值，根據產物長度和OD值進行copies數計算。將cDNA進行10倍遞進稀釋，取1 μL作為模板加入反應體系中，在63℃恒溫條件下，反應60 min。在熒光定量PCR儀上觀察實時熒光反應圖，并取2 μL反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 特異性試驗 利用FAST-LAMP反應體系，以H3N2、乙型流感、水痘病毒、人偏肺病毒、副流感病毒等核酸作為待測樣品進行檢測，觀察實時熒光反應，并將擴增產物進行電泳分析。

1.2.6 重復性試驗 根據靈敏度試驗結果選擇陰性、1×102copies/μL、1×104copies/μL和 1×106copies/μL濃度的cDNA模板分別進行FAST-LAMP，每份樣本各取1 μL重復3次，采用實時熒光定量PCR儀進行檢測，觀察反應的Ct值，根據Ct值計算變異系數，對該方法的重復性進行考核。

表2 各反應體系中的引物組成及引物濃度

1.2.7 擴增方法反應時間比較 將普通LAMP、加入環引物LAMP和FAST-LAMP反應采用同一樣本同時檢測，反應條件為63℃，55 s，熒光采集5 s，100個循環。

1.2.8 產物測序分析 將FAST-LAMP的擴增產物膠回收后進行序列分析，分別采用內引物和套內引物為測序引物。

1.2.9 樣本檢測 收集浙江口岸機場發熱人員鼻咽拭子35份，根據說明書提取RNA，采用FASTLAMP技術進行檢測。將檢測結果與熒光定量PCR結果進行比對。

2 結果

2.1 不同擴增方法反應時間的比較

根據實時熒光檢測的結果（圖1）可見，FASTLAMP的反應時間控制在40-45 min左右，加入環引物的LAMP反應時間為65 min左右，普通LAMP反應時間在90 min左右。

圖1 甲型H1N1流感病毒不同擴增方式實時熒光檢測

2.2 特異性試驗結果

采用甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP方法進行檢測，電泳反應結果（圖2）顯示，甲型H1N1流感病毒出現與普通LAMP反應相似的階梯狀條帶，且條帶比普通LAMP反應更多。此外，陰性對照、H3N2病毒、乙型流感病毒、水痘病毒、人偏肺病毒和副流感病毒核酸的檢測結果均為陰性，由此顯示了該方法具有較好的特異性。

2.3 靈敏度試驗結果

在熒光定量PCR儀上觀察實時熒光反應圖，結果見圖2；并取2 μL反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3，1-5泳道均出現細密的階梯狀條帶，表示出現有陽性擴增反應?？梢耘卸ū痉椒ǖ臋z測極限約為1×102copies/μL。

圖3 甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP靈敏度實時熒光曲線

圖4 甲型H1N1流感病毒Fast-LAMP靈敏度電泳結果

2.4 重復性試驗結果

根據實時熒光RT-LAMP的結果，記錄各次試驗的Ct值。根據Ct值計算SD值及變異系數（CV%），見表3。結果表明強陽性及臨界值樣本的CV值均小于5%，重復性良好。

2.5 產物測序結果

由于產物組成的復雜性，出現了個別堿基錯配，各引物檢測FAST-LAMP產物序列分析的整體結果表明，套內引物FNP和BNP、內引物FIP和套內引物BNP，套內引物FNP和內引物BIP組合均能擴增出相應的產物，環引物也能與FNP擴展出相應的產物。由此可證明本檢測方法中各引物之間確實能各自組合擴增。

表3 甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP重復性實驗結果

2.6 臨床樣本檢測

采用FAST-LAMP技術進行檢測結果發現，35例機場口岸送檢本實驗室的鼻咽拭子樣本中有8例甲型H1N1流感病毒陽性，與熒光定量PCR檢測結果相符。

3 討論

環介導等溫擴增技術由于操作簡單，無需昂貴的實驗儀器，反應在1-1.5 h內完成，靈敏度高，吸引了大量的研究力量投入到了該領域的研究。目前環介導等溫擴增技術僅僅是在該方法建立基礎上，利用現有的引物設計方法檢測目的基因，或是在產物的檢測方式上有所改變，在擴增方式上沒有實質性的創新［1-7］。在實時熒光定量PCR擴增儀中觀察LAMP的擴增曲線從Ct值到平臺期的時間非常短，一般均在2 min之內［28］，即潛伏期的長短決定了整個反應時間的長短。LAMP反應是以產物的量為判斷依據，在普通LAMP中和模板接觸的是一對引物，4個位點決定了LAMP反應的內在擴增效率，除此之外，引物濃度等的條件優化、模板量和酶的量等決定了外在的擴增效率，本研究的創新點在于提高反應的內在擴增效率。在LAMP反應體系中加入環引物增加了兩個與核酸模板接觸的位點［9］，提高了擴增效率，但不改變產物的種類。如果把引物和模板的結合位置由4個變為8個，那么反應的產物將由1種變為4種，理論上能大幅增加擴增效率。

本研究的設計方案：在目的基因內兩端設計常規環介導等溫擴增引物（一對外引物F3、B3和一對內引物FIP、BIP），并留出設計套內引物FNP、BNP和環引物Loop-f、環引物Loop-r的足夠堿基；加入環引物Loop-f、環引物Loop-r，可使LAMP反應中引物和核酸模板接觸的位置增加兩個，提高了擴增效率。在外側內引物FIP和BIP之間設計一對套內引物FNP、BNP，此時等溫擴增反應不但能用套內引物FNP與BNP根據核酸模板進行擴增，同時也可以和外側常規LAMP引物擴增的產物結合并擴增，使與核酸模板接觸的位置又增加了4個。套內引物FNP 不但可以和套內引物的BNP聯合進行擴增反應，同時也能與外側的常規內引物BIP聯合進行擴增，增大了與核酸模板結合和擴增的機會；反之，套內引物BNP也可以與套內引物的FNP聯合進行擴增反應，同時也能與外側的常規內引物FIP聯合進行擴增反應。常規LAMP反應和加入環引物的LAMP的擴增產物只有1種產物的循環序列，加入環引物不改變產物的序列；在加入套內引物后，產物就是4種擴增產物的循環序列，即內引物FIP、BIP的擴增產物，套內引物FNP、BNP的擴增產物，內引物FIP和套內引物BNP的擴增產物，套內引物FNP和內引物BIP的擴增產物。

在本次試驗中FAST-LAMP的反應時間比普通LAMP反應時間縮短了45 min左右，比加入環引物的LAMP反應時間縮短了15 min左右，在相同條件的情況下大大提高了反應的擴增效率。本方法擴增出的LAMP產物為4種不同LAMP組合的混合物的倍數條帶，陽性條帶大小的差異很小，條帶分布比普通LAMP更加細密，故而梯度狀條帶不是很清晰。本方法的產物經電泳割膠回收后測序結果符合實驗預期，各引物之間能相互擴增。相比用傳統的LAMP檢測技術，該方法在檢測時間上大大縮短，普通LAMP用于檢測H1N1病毒仍需在1.5 h左右，且靈敏度與本研究建立的檢測方法相當［29，30］。由于受病毒基因的限制，該檢測方法的改進在細菌檢測、物種鑒定等檢測中具有更大的發展前景，可將反應時間控制更短。

4 結論

在相同的檢測條件下，本研究建立的改良的環介導等溫擴增方法應用于甲型H1N1流感病毒檢測，具有更快的擴增速度。檢測靈敏度可達到1×102拷貝，特異性與重復性良好；具有簡便、高效、準確的特點。

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（責任編輯 李楠）

The Establishment of FAST-LAMP Method for Detecting Influenza A（H1N1）Virus

Lü Qinfeng Luo Peng He Lei Yang Yongyao Zheng Wei Li Li Wu Zhonghua
（Zhejiang International Travel Healthcare Center，Hangzhou310003）

It was to establish a new loop-mediated isothermal amplification（FAST-LAMP）for rapidly detecting influenza A（H1N1）virus. A set of primers were designed according to HA gene， including the outer primers， internal primers， loop primers and nest internal primers. The nest internal primers increased the contact sites of primers and nucleic acid template， so that the amplification efficiency could be improved and detection time reduced. The FAST-LAMP method could be 45 less than LAMP method， and 20 minutes less than LAMP method with loop primers， i.e. detection time reduced significantly detecting sensitivity reached 1×102copies cDNA template/tube. It proved that the established FAST-LAMP method is an efficient and reliable method for detecting influenza A（H1N1）virus.

FAST-LAMP；H1N1 influenza virus；detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.013

2014-08-14

國家質檢公益性行業科研專項項目（201010043），國家質檢總局科技項目（2013IK245）

呂沁風，女，碩士，副主任技師，研究方向：傳染病檢測；E-mail：fionallll@163.com