沙冬青AmHsa32基因超表達提高轉基因煙草抗熱性

賀茜 王艷萍 陳玉珍 盧存福

（北京林業大學生物科學與技術學院　林木育種國家工程實驗室，北京　100083）

沙冬青AmHsa32基因超表達提高轉基因煙草抗熱性

賀茜 王艷萍 陳玉珍 盧存福

（北京林業大學生物科學與技術學院林木育種國家工程實驗室，北京100083）

Hsa32是一類新型的熱激蛋白，主要發現于陸地植物中，對植物抗逆性的獲得起關鍵作用。AmHsa32是Hsa32的同源蛋白之一，是從沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）克隆得到的耐熱性相關基因。成功構建了Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS植物表達載體，經農桿菌介導轉入到本生煙中。經PCR和Western boltting檢測證明AmHsa32已經被轉入到本生煙基因組中。對轉基因和野生型本生煙在高溫脅迫下種子的萌發率、幼苗生長耐熱性進行檢測發現，轉基因植物的抗熱得到了明顯提高。研究結果表明，AmHsa32可作為植物耐熱基因育種的重要基因資源。

沙冬青；AmHsa32；轉基因；耐熱性

溫度是影響植物正常生長發育的主要環境因子之一。溫度過高或過低均能抑制植物生長發育，限制植物分布，同時也會造成植株無法恢復的傷害，甚至會導致死亡。植物體可以響應非致死高低溫，這使其能夠抵御極端溫度從而存活［1］，高溫能破壞植物的正常生理和代謝過程，如光系統Ⅱ活性［2］、花粉和種子發育［3］、乙炔還原［4］、內質網完整性［5］及葉生長［6］等。同樣，非致死性高溫也能使植物基因的表達模式發生改變。熱脅迫使植物正常生長發育所需蛋白質合成受到抑制，同時誘導產生大量的熱激蛋白，提高植物耐熱性。熱脅迫相關蛋白Hsa32（heat stress associated protein32，Hsa32）是一種小分子熱激蛋白，分子量為32 kD，在植物抵御熱脅迫及植物耐熱性獲得方面具有關鍵作用；另外，Hsa32也能夠響應低溫、干旱、鹽等非生物脅迫［7，8］。目前，對Hsa32蛋白的研究主要集中在擬南芥、小麥、番茄等［9］，還未見對木本植物Hsa32的報道。

沙冬青是我國西北荒漠地區的常綠灌木，是亞熱帶地區第三紀殘遺物種［10，11］，具有很強的抵抗干旱、寒冷、高溫、鹽堿等特性。與楊樹等已測序木本植物相比［12］，沙冬青抗逆基因功能研究比較滯后，目前主要集中在抗逆基因的挖掘和功能驗證［13-26］。Chen等［26］克隆了沙冬青的CBL1，將其轉入到煙草中，轉基因煙草相較于對照組具有較強的抗逆性。李曉東等［27］將沙冬青脫水素基因AmDHN 轉入到甜菜中，抗性實驗表明轉基因甜菜的抗旱性要高于非轉基因。智冠華等［28］初步證明了沙冬青基因AmZFPG 能提高植物的耐寒性。因此，沙冬青是研究木本植物抗逆基因資源的理想材料［29］。

我們先前的研究［29］表明，沙冬青AmHsa32基因ORF區域為858 bp，共編碼286個氨基酸，與擬南芥、玉米、水稻、番茄、小麥中Hsa32都有較高的同源性。在40℃脅迫下，AmHsa32 在沙冬青幼苗中表達量迅速提高，1 h后達到對照的25倍。除此以外，轉入AmHsa32基因的大腸桿菌也具有一定的耐熱性［13］。本研究構建Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS植物表達載體，經農桿菌介導轉入到模式植物本生煙中，驗證了AmHsa32具有提高植物耐熱性的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

含AmHsa32基因的菌液、真核表達載體Pcambia2300-35S-OCS、農桿菌LBA4404以及野生型本生煙（Nicotiana benthamiana）均由本實驗室保存提供。內切酶Kpn I、BamH I、pMD-18T Vector、DNA marker均購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表達載體構建 以AMSP（5'-AggTACCATgTCAgCATACAgATggAAAAgC-3'，下劃線為Kpn I酶切點）為上游引物，AMSR（5'-AggATCCATgCAACACCAgCTATgA gACAAC-3'，下劃線為BamH I酶切點）為下游引物，含有AmHsa32的菌液為模板，進行PCR擴增。PCR擴增參數：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，40 個循環；終延伸 72℃10 min。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將AmHsa32目的片段切膠回收后與pMD18-T載體16℃連接3 h，轉入大腸桿菌感受態細胞。挑取陽性克隆測序驗證。對正確序列的陽性克隆提質粒，用Kpn I和BamH I雙酶切，同時雙酶切載體Pcambia-2300，均37℃酶切3 h，產物回收后，用T4連接酶16℃連接3 h，獲得重組載體，測序驗證。提取重組載體質粒轉化農桿菌LBA4404感受態細胞。

1.2.2 野生型煙草侵染，T1代轉基因煙草鑒定 用農桿菌介導的葉盤侵染法將重組載體AmHsa32-2300轉化到野生型煙草中，將T1代煙草種子播種在含150 mg/L卡那霉素的MS培養基上，篩選轉基因陽性苗。選擇轉基因植株煉苗，之后轉移至營養土中培養。用CTAB法提取T1代不同種系轉基因煙草DNA，進行PCR驗證。

1.2.3 Western boltting檢測 AmHsa32抗血清是用我們先前獲得的重組蛋白AmHsa32-N［30］注射免疫兔子得到。液氮研磨不同株系轉基因煙草，將葉片粉末分裝于無菌2 mL EP管，加入200 μL預冷過的磷酸緩沖液（pH＞7.0），將Ep管置于4℃冰箱30 min溶解水溶性蛋白。12 000 r/min低溫離心10 min，取5 mL上清并加入5 μL loading buffer，混勻后上樣，進行SDS-PAGE電泳分離AmHsa32。隨后利用水溶式電轉移轉膜，進行免疫印跡反應。

1.2.4 脅迫條件下轉基因煙草種子的萌發率的測定 將AmHsa32轉基因T1代煙草種子和野生型種子在MS培養基中培養12 h（25℃，16 h光照 /8 h黑暗）。熱處理：37℃處理2 h，42℃再處理2 h后，轉入正常培養條件，恢復培養10 d統計發芽率，實驗重復3次。

1.2.5 轉基因煙草T1代幼苗耐熱性分析 將AmHsa32轉基因煙草T1代種子及野生型煙草播種于MS培養基上，至幼苗長出4葉片時進行熱脅迫處理。脅迫結束后，轉入25℃控溫箱（16 h光照 /8 h黑暗）培養15 d，觀察轉基因煙草及野生型株系的表型變化，統計存活率，實驗重復3次。

分別將轉基因煙草和野生型種子播種于營養缽中，培養6周。選擇長勢一致的植株進行熱處理觀察表型變化。熱脅迫過程：將土培苗在37℃熱馴化1 h后，室溫恢復生長2 h，45℃再次熱激3 h后，在25℃恒溫培養箱中繼續培養7 d，觀察表型變化，統計植株存活率。實驗重復3次。

2 結果

2.1 真核表達載體的構建

2.1.1 2300-Hsa 真核表達載體的構建 克隆沙冬青AmHsa32基因，與pMD18-T載體連接后測序。選擇測序正確的單克隆菌液提質粒，與Pcambia-35s-ocs真核表達載體構建重組質粒，具體構建見圖1。

圖1 2300-HAS 真核表達載體構建圖

2.1.2 克隆AmHsa32基因片段 以含有測序正確的AmHsa32的菌液為模板，AMSP、AMSR為引物擴增目的基因編碼序列。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得大小約為850 bp的目的條帶（圖2）。將目的條帶切膠回收后，與pMD18-T載體16℃連接5 h，將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞。將上述連接產物涂在氨芐霉素抗性LB平板上篩選，挑取菌落，37℃震蕩培養后，PCR鑒定陽性克隆。

圖2 PCR擴增AmHsa32電泳檢測圖

2.2 侵染本生煙及轉基因植株T1代的鑒定

在25℃恒溫（16 h光照/8 h黑暗）條件下，培養野生型煙草6周后，用農桿菌介導的葉盤侵染法將重組載體AmHsa32-2300轉化野生型煙草。在誘導分化培養基中暗培養侵染葉片5 d，轉入分化及抑菌培養基形成愈傷組織，培養愈傷組織4-5周后形成不定芽，將不定芽轉移至抑菌生根培養基中，得到T0代轉基因煙草。

將滅菌后的T1代轉基因株系種子播種到MS培養基（含卡那霉素）中進行抗性篩選。培養4周后，轉基因種子正常生長，葉片較綠，根系較為發達，無抗性的種子葉片發黃，根系短小，最終葉片白化死亡。在T1代種子中出現卡那霉素抗性分離，抗性苗與白化苗分離比約為3∶1。選擇生長6周大小的組培苗進行煉苗，3 d后轉移至營養土中生長2周，提取T1代轉基因煙草葉片DNA進行PCR檢驗，條帶位置在850 bp，即T1代轉基因株系與陽性對照在相同位置存在目的條帶（圖3）。證明AmHsa32已整合到煙草基因組中，獲得含卡那霉素抗性的T1代轉基因煙草。

圖3 T1代轉基因本生煙的PCR檢測

2.3 Western blotting檢測

為研究轉基因煙草中AmHsa32的表達情況，分別提取T1代不同株系轉基因煙草葉片中的可溶性蛋白，以野生型煙草可溶性蛋白作為對照，進行Western blotting。結果（圖4）顯示，T1代不同轉基因株系（H1-1，H2-1，H3-1）均有免疫印跡信號，而野生型煙草無信號，證明AmHsa32基因已在轉基因株系中表達。

圖4 轉AmHsa32的Western blotting檢測

2.4 熱脅迫下煙草萌發率

將野生型煙草種子及AmHsa32轉基因株系T1代種子，分別播種于MS培養基，在25℃控溫培養箱（16 h光照/8 h黑暗）中培養12 h，分組進行熱脅迫。熱脅迫37℃處理2 h后，42℃處理2 h轉入25℃控溫培養箱，10 d后統計發芽率。結果（圖5）顯示，AmHsa32轉基因株系98%全部萌發，野生型僅有36%萌發，結果表明，轉AmHsa32基因煙草高溫脅迫抗性明顯提高。

圖5 轉AmHsa32和野生型本生煙種子在不同溫度處理下的萌發率

2.5 T1代轉基因煙草幼苗的耐熱性

將野生型煙草播種在MS培養基，T1代轉基因煙草播種在含抗生素的MS培養基中，25℃控溫培養箱（16 h光照/8 h黑暗）培養幼苗長出4葉片時，進行熱脅迫處理，具體處理條件如表1。37℃處理幼苗1 h，42℃處理3 h，轉入25℃控溫培養箱回復培養15 d，觀察轉基因株系及野生型表型，野生型煙草約有20%葉片發白干枯，而轉基因株系正常生長。37℃處理幼苗1 h，42℃處理3 h，45℃進一步處理3 h，轉入25℃控溫培養箱，恢復培養15 d，觀察表型，野生型煙草幼苗全部死亡（圖6-A），而AmHsa32轉基因幼苗約有60%存活（圖6-B）。

表1 轉基因和野生型本生煙幼苗對熱脅迫反應的比較

圖6 轉基因及野生型本生煙熱處理后恢復15 d后的表型

培養缽中生長6周后的幼苗，經42℃處理后，恒溫箱25℃恢復培養7 d，轉基因煙草與野生型植株的表型變化差異明顯。經過熱脅迫，與轉基因植株相比，野生型株系葉片變黃，逐漸白化，受害明顯（圖7-D），轉基因株系80%葉片保持綠色（圖7-C），表明AmHsa32的表達能夠有效減輕熱脅迫對植株的傷害。

圖7 轉基因及野生型本生煙的表型

3 討論

已有的研究表明熱脅迫相關蛋白Hsa32對植物耐熱性的獲得具有關鍵作用。Liu等［30］對Hsa32耐熱性方面的研究表明，缺少Hsa32基因的擬南芥在高溫處理下較野生型更為敏感。生物信息學分析發現Hsa32的氨基酸序列與2-磷酸3-磺基乳酸合成酶（參與硫脂合成）相似，但是實驗結果表明擬南芥Hsa32突變體對高溫的敏感性與硫脂的含量并無關聯，Hsa32也不參與硫脂的合成。Charng等［7］用插入突變的方法在Hsa32基因中插入T-DNA，該基因的突變并不影響植物在正常溫度下的生長和發育。耐熱性獲得實驗發現，突變株和野生型植株在經受高溫處理后，需要一段時間的恢復，再次經歷高溫時，野生型長勢良好，突變株則相反；但是如果恢復時間不夠，則突變株和野生型都會死亡。這說明Hsa32在植物中起作用不僅需要誘導，Hsa32在熱脅迫后起作用也需要一段時間的恢復期。Wu等［31］為了探索Hsa32無效突變株僅存在短暫的耐熱性，但不具備長期的耐熱性這一現象的內在機制，采用正向遺傳篩選的兩個錯義隱性等位基因（編碼熱激蛋白分子伴侶HSP101）的突變體，免疫印記和異位表達等的實驗結果都表明了HSP101 和HSA32在蛋白水平上互相調控，是一種正反饋機制，通過這種新型的機制能夠延長植物熱馴化的效力。

我們前期的研究表明，轉AmHsa32大腸桿菌（BL21）經50℃熱脅迫后存活率較野生型明顯提高。AmHsa32有可能結合了其他蛋白，共同維持大腸桿菌在逆境下的正常生存［29］。本研究中轉基因煙草種子在熱及低溫脅迫條件下仍能全部萌發，而野生型煙草種子在熱脅迫后僅有35%的萌發率，這說明AmHsa32提高了轉基因煙草的抗熱能力。幼苗的耐熱分析結果表明，AmHsa32轉基因植株抵御長時間的高溫脅迫后仍有60%存活，而野生型煙草全部死亡。在模式植物擬南芥的研究中也有類似報道，Hsa32突變體與野生型受到同樣的熱脅迫（44℃）處理60 min后，前者死亡［7］，這表明Hsa32的表達對植物響應熱脅迫有重要作用。

4 結論

構建沙冬青AmHsa32基因cDNA真核表達載體，侵染野生型煙草，經過PCR及Western blotting鑒定后，證實目的基因已轉入煙草。對轉基因煙草在高溫脅迫下的萌發率及幼苗生長分析證明，AmHsa32使轉基因植株的耐熱性明顯提高。

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（責任編輯 李楠）

Ectopic-overexpression of AmHsa32 from Ammopiptanthus mongolicus Promoted Heat Tolerance in Nicotiana benthamiana

He Qian Wang Yanping Chen Yuzhen Lu Cunfu
（College of Biological Sciences and Biotechnology，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing100083）

Hsa32 is a novel heat-shock protein（Hsp）and mainly found in land plants and essential for acquired thermo-tolerance. AmHsa32 as one orthologue of the Hsa32 gene， was isolated from a desert plant， Ammopiptanthus mongolicus（Leguminosae）. In order to verify the function of AmHsa32， we constructed the plant expression vector Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS， and transferred it into Nicotiana benthamiana through the medium of Agrobacterium strain. PCR and Western blotting demonstrated that AmHsa32 had been integrated into the genome of Nicotiana benthamiana. Seed germination and seedling growth analysis indicated that overexpressing AmHsa32 resulted in enhanced tolerance to heat stresse in transgenic Nicotiana benthamiana. Our work suggests that AmHsa32 might be a valuable gene for plant resistant breeding with transgene technology.

Ammopiptanthus mongolicus；AmHsa32；transgene；thermotolerance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.016

2014-11-09

國家自然科學基金項目（31270737），高等學校學科創新引智計劃資助項目（B13007），長江學者和創新團隊發展計劃資助項目（IRT13047），北京市自然科學基金項目（6112016）

賀茜，男，碩士，研究方向：植物分子生物學；E-mail：tree.hq@163.com

盧存福，男，博士，教授，研究方向：植物分子細胞生物學；E-mail ：lucunfu@bjfu.edu.cn