煙草胞質6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因的克隆及表達分析

林世鋒 付強 余婧 趙杰宏 任學良 王仁剛

（貴州省煙草科學研究院　煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴陽　550081）

煙草胞質6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因的克隆及表達分析

林世鋒 付強 余婧 趙杰宏 任學良 王仁剛

（貴州省煙草科學研究院煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴陽550081）

采用電子克隆的方法，結合RT-PCR和SMART RACE技術，首次從煙草（Nicotiana tabacum）中克隆到1個胞質6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）基因的cDNA序列，命名為Nt6PGDH（GenBank登錄號：KM211534）。該基因cDNA全長1 932 bp，開放閱讀框1 455 bp，編碼484個氨基酸，與番茄（Solanum lycopersicum）和馬鈴薯（Solanum tuberosum）的6PGDH氨基酸序列一致性最高，為95%。生物信息學分析表明，Nt6PGDH氨基酸序列不存在信號肽和轉運肽，無跨膜結構域，定位于細胞質。對煙草不同發育時期Nt6PGDH基因的表達情況分析發現，Nt6PGDH基因在煙草旺長期根、莖、葉中的表達量均高于苗期，并且在同一發育時期，煙草根中表達量最強，莖次之，葉片最弱。

煙草；胞質6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；基因克隆；表達分析

戊糖磷酸途徑（Pentose phosphate pathway，PPP）是植物體中糖代謝的重要途徑，其主要生理功能是產生供還原性生物合成需要的NADPH以及可供核酸代謝的磷酸戊糖［1-4］，一些中間產物則可參與氨基酸和脂肪酸合成等［5，6］。已有研究表明，磷酸戊糖途徑與植物的生長發育、各類環境脅迫密切相關［6-12］。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphaogluconate dehydrogenase，6PGDH）是磷酸戊糖途徑的兩個關鍵酶，廣泛分布于高等植物的胞質和質體中［6］。由于G6PDH和6PGDH是PPP的限速酶而受到人們更多的研究，人們也常常通過對這兩個酶的研究來研究磷酸戊糖途徑。據報道煙草葉片受到馬鈴薯Y病毒侵染時，植物體內G6PDH與6PGDH的活性顯著增強，而且質體中的G6PDH與6PGDH酶活性的增幅遠大于胞質中兩個酶活性的增強，研究者認為G6PDH活性的增強可能受到某種粗調節機制的調節［13］。目前，研究者已從煙草中克隆到G6PDH基因的全長cDNA序列［14］，并進行了相應的功能研究［15］，但對煙草中6PGDH cDNA序列的克隆與分析還未見報道。為此，本研究利用生物信息學方法，結合RT-PCR和SMART RACE技術，對編碼煙草6PGDH的cDNA全序列進行克隆；并運用實時熒光定量PCR技術，對其在煙草組織中的表達情況進行研究，以期為煙草6PGDH基因功能的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

分別采集煙草栽培品種K326（Nicotiana tabacum L. K326）生根期幼苗的根、莖、葉和芽組織，液氮迅速冷凍，于-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 所有植物材料RNA采用Trizol Reagent（Invitrogen公司）法提取總RNA，并參照TaKaRa公司反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.2 Nt6PGDH全長cDNA的克隆 以黃瓜6PGDH全長cDNA序列（登錄號：FJ610345）為信息探針，在NCBI煙草EST數據庫中進行BLAST檢索，將檢索到的來自煙草品種K326的全部EST序列利用DNAMAN6.0軟件進行拼接，獲得1個重疊群（Contig）。根據獲得的重疊群設計合成1對PCR 引物P-iF和P-iR，見表1。以煙草品種K326 cDNA為模板，進行PCR擴增，驗證拼接結果。

表1 引物序列及預期片段大小

根據驗證得到的基因片段設計基因3'RACE嵌套引物和5'RACE嵌套引物，使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa公司），按照說明書進行操作，RACE擴增后分別獲得基因的3'端序列和5'端序列。利用DNAMAN軟件組裝以上序列，獲得全長cDNA序列信息，設計合成1對基因全長引物P-F和P-R，以合成的煙草品種K326 cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增，獲得煙草6PGDH的全長cDNA序列。

1.2.3 Nt6PGDH基因的生物信息學分析 應用ORF Finder（http：//www. ncb.i nlm. nih.gov/gorf/gor.f html）程序確定正確的開放閱讀框（ORF）；通過NCBI 上的 BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行序列相似性檢索；利用 ExPASy（http：//web. expasy.org/compute_pi/）預測蛋白的分子質量計算值和理論等電點；利用Smart（http：//smart.emblheidelberg.de/）分析蛋白質結構域；信號肽、轉運肽和跨膜結構域分析分別由SignalP 4.1、TargetP 1.1和TMHMM Server v.2.0在線程序（http：//www.cbs. dtu.dk/services/）進行預測；亞細胞定位采用PSORT II Prediction（http：//psort.hgc.jp/form.html）進行分析；用ClustalX 2.0和MEGA4.0軟件-鄰位相連法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹。

1.2.4 Nt6PGDH的DNA序列克隆 采用CTAB法從新鮮幼嫩的煙草葉片中提取基因組DNA。利用基因全長引物進行擴增、克隆和測序。

1.2.5 實時熒光定量PCR 根據Nt6PGDH的cDNA序列設計特異引物P-rF和P-rR。選用煙草Actin基因（NTU60495）為內參基因，并設計引物Actin-rF和Actin-rR。利用Taqman探針試劑盒（TaKaRa公司）在ABI Stepone Plus實時熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR實驗，分析Nt6PGDH在煙草不同組織中的相對表達情況。

2 結果

2.1 Nt6PGDH基因的克隆

以煙草品種K326 cDNA為模板，用P-iF和P-iR為引物，進行煙草6PGDH基因中間片段的PCR擴增和克隆測序（圖1）。由此設計合成RACE引物進行擴增，獲得該基因的3'端和5'端。通過測序拼接，獲得該基因的全長序列信息。經ORF搜索以及其他植物來源6PGDH基因比對分析，確定該基因具有完整的ORF。根據全長基因拼接序列設計引物，用RT-PCR方法，獲得全長cDNA序列，將其命名為Nt6PGDH，GenBank登錄號為KM211534（圖2）；同時以煙草基因組DNA為模板擴增獲得與RT-PCR擴增相同大小的序列，說明該基因內部無內含子。

圖1 煙草Nt6PGDH基因的PCR擴增結果

2.2 Nt6PGDH基因的序列分析

Nt6PGDH基因cDNA全長1 932 bp（不包括polyA尾上31個連續的堿基A），由174 bp的5'端非翻譯區（5'-UTR）、1 455 bp編碼區和303 bp的3'端非翻譯區（3'-UTR）組成（圖2）。該序列可編碼484個氨基酸的蛋白質，預測蛋白分子質量約為53.30 kD，等電點為5.70。SMART分析表明，該蛋白質4-178氨基酸位形成6PGDH的NADP結合結 構 域（NAD binding domain of 6-phosphogluconate dehydrogenase），其中氨基酸序列GMGVSGGEEG符合高度保守的NADP結合位點序列GXGXXGXXXG（圖2）；182-476氨基酸位為6PGDH的C-末端結構 域（6-phosphogluconate dehydrogenase，C-terminal domain），其中氨基酸序列VLDKTGMKGTGKW與已知的細菌、哺乳動物的6PGDH高度保守的底物結合位點序列V/I/L/M-X-D-X-X-G/A-N/Q/S-K-G-T-G-X-W相符，只是第263位氨基酸M替代了N，這一變化在植物界普遍發生。

2.3 信號肽、跨膜區及亞細胞定位預測分析

利用SignalP 4.1 Server預測Nt6PGDH蛋白不具有信號肽。利用TargetP 1.1 Server預測，結果顯示葉綠體轉運肽（chloroplast transit peptide，cTP）為 0.023、線粒體信號肽（mitochondrial targeting peptide，mTP）為0.189、分泌通路信號肽（secretory pathway signal peptide，SP）為0.449、其他為0.286。利用TMHMM Server v.2.0預測跨膜區，結果（圖3）顯示Nt6PGDH蛋白沒有跨膜區域。在線工具PSORT II Prediction預測該蛋白的亞細胞定位情況，結果顯示Nt6PGDH蛋白定位于細胞質中的概率達52.2%，k值達到23。因此，Nt6PGDH蛋白最可能定位于細胞質中。

圖2 煙草Nt6PGDH基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸

圖3 預測的Nt6PGDH蛋白的跨膜區

2.4 煙草與其他植物的6PGDH蛋白的同源性比較經氨基酸序列同源檢索，發現Nt6PGDH與已知其他高等植物胞質6PGDH氨基酸序列一致性為76%-95%，其中與番茄（XP_004237068）和馬鈴薯（XP_006363551）基因一致性最高為95%。進一步利用ClustalX 2.0軟件進行多重序列比對，并采用MEGA 4.1軟件構建系統進化樹。結果（圖4）顯示，6PGDH蛋白是一個比較古老的蛋白，在單子葉植物和雙子葉植物分化之前已經出現，并在單子葉植物與雙子葉植物形成過程中發生了分化。此外，6PGDH蛋白在番茄、馬鈴薯、黃瓜等植物中均以多種形式存在，其中菠菜質體6PGDH（AF295670）在進化樹中并未形成一個獨立的分支，而與黃瓜、番茄、馬鈴薯等胞質6PGDH聚在一起，這支持胞質和質體6PGDH并非獨立起源的觀點。

圖4 植物胞質6PGDH的系統進化樹

2.5 Nt6PGDH基因的時空表達模式分析

采用熒光定量RT-PCR法，對Nt6PGDH基因在煙草不同發育時期的根、莖、葉中的表達進行相對定量分析。圖5顯示，Nt6PGDH在苗期和旺長期的各組織中均有表達，以根的表達量為最高，旺長期各組織的表達量均比苗期相同組織的表達量高。

圖5 Nt6PGDH基因的時空表達特性

3 討論

本研究首次報道了煙草Nt6PGDH基因的克隆。通過氨基酸序列同源檢索，結果顯示煙草Nt6PGDH與已知其他高等植物6PGDH一致性都在76%以上；系統進化樹分析結果表明，煙草Nt6PGDH最先與番茄、馬鈴薯等茄科植物6PGDH聚類，其次與大豆、黃瓜等物種6PGDH聚類合并；用SMART軟件分析Nt6PGDH具有典型的6PGDH特征：含有一個NADP結合結構域和一個C-末端結構域。上述分析結果都表明Nt6PGDH為煙草6PGDH基因。植物中6PGDH存在兩種形式，一種為存在于胞質中的胞質6PGDH（cytosolic 6PGDH）；另一種為存在于質體基質中的質體6PGDH（plastidic 6PGDH），其中后者氨基酸的N端顯著長于前者，編碼一個轉運肽（transit peptide）序列［6，7］。本研究克隆的Nt6PGDH編碼的氨基酸序列與菠菜胞質6PGDH（AAK51690）、菠菜質體6PGDH（AF295670）的氨基酸一致性分別為90%和77%（資料未列出），而且與其他物種的胞質6PGDH相類似氨基酸N端都缺少一段長度約為40 aa的轉運肽［16，17］，因此推測本研究克隆的Nt6PGDH編碼的6PGDH為胞質6PGDH。

戊糖磷酸途徑是植物中重要的代謝途徑，在植物的生長發育中起著非常重要的作用，不僅為生物合成提供還原力NADPH，為核酸的合成提供五碳糖，還涉及到多種環境脅迫引起的植物應答反應，其中6PGDH的活性或基因表達水平與各種逆境脅迫以及淀粉的生物合成等過程有關［7-12］。Fahrendorf等［18］在苜蓿中比較了胞質6PGDH基因在各個組織中的表達，結果發現根中的表達量要高于葉，而且胞質6PGDH在葉中的表達幾乎無法檢測。在大豆根瘤中，存在高活性的6PGDH可能與嘧啶的合成、酰脲的產生和氮的固定有關［19，20］。因此，胞質6PGDH在根中的大量轉錄表達可能與氮的吸收利用有關。經表達譜分析發現，本實驗克隆的Nt6PGDH在旺長期根、莖、葉的表達量均比苗期相同組織的表達量高，其中在旺長期的根中表達量最高，這可能是因為旺長期牽涉到大量的細胞分裂與生物合成，而戊糖磷酸途徑正為生物合成提供必要的還原力NADPH和供DNA/RNA合成所必須的五碳糖；而根中的表達高于葉，也進一步驗證本研究克隆的Nt6PGDH編碼胞質6PGDH。

4 結論

從煙草中克隆到一個胞質6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因，命名為Nt6PGDH，基因登錄號為KM211534。基因全長1 932 bp，開放閱讀框為1 455 bp，編碼484個氨基酸。Nt6PGDH氨基酸序列不存在信號肽和轉運肽，無跨膜結構域，定位于細胞質。Nt6PGDH基因在煙草苗期和旺長期的根、莖、葉中均有表達，其中在旺長期各組織中的表達量均高于苗期，并且在同一發育時期，煙草根中表達量最強，莖次之，葉片最弱。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Cytosolic 6-phosphogluconate Dehydrogenase Gene in Tobacco（Nicotiana tabacum）

Lin Shifeng Fu Qiang Yu Jing Zhao Jiehong Ren Xueliang Wang Rengang
（Key Laboratory of Molecular Genetics，CNTC，Guizhou Academy of Tobacco Science，Guiyang550081）

A cDNA sequence of cytosolic 6-phosphogluconate dehydrogenase（6PGDH）gene was cloned from Nicotiana tabacum by in silico cloning combined with RT-PCR and SMART RACE technologies， and designated as Nt6PGDH（Accession number KM211534）. The full length of its cDNA sequence is 1 932 bp， with a 1 455 bp open reading frame， and the gene encoded a protein of 484 amino acids with the sequence of highest identity， 95% as 6PGDH from Solanum lycopersicum and Solanum tuberosum. Bioinformatics analysis indicated that Nt6PGDH had no signal peptide， no transit peptide and notrans-membrane domain， and it was located in cytoplasm. Gene expression analysis showed that the expression levels of Nt6PGDH in roots， stems and leaves were higher at fast-growirg stage than at seedling stage. Moreover， at the same developmental stage， the highest level of Nt6PGDH expression were in the roots， then in the stems， the lowest in the leaves.

Nicotiana tabacum；cytosolic glucose-6-phosphate dehydrogenase；gene cloning；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.018

2014-09-12

中國煙草總公司重點項目（110201302004），貴州省優秀青年科技人才培養對象專項資金（黔科合人字［2013］02 號），貴州省科學技術基金項目（黔科合J字［2012］2256號）

林世鋒，男，博士，副研究員，研究方向：煙草遺傳育種與分子生物學；E-mail：linshifeng1978@163.com

王仁剛，男，碩士，副研究員，研究方向：煙草遺傳育種與分子生物學；E-mail：rengangwang@126.com