FX-139發酵液及菌絲體提取物對人參愈傷組織生長及防御酶系的影響

郭雙雙 史冊 韓梅 楊利民

（吉林農業大學中藥材學院　吉林農業大學省部共建生態恢復與生態系統管理國家重點實驗室，長春　130118）

FX-139發酵液及菌絲體提取物對人參愈傷組織生長及防御酶系的影響

郭雙雙 史冊 韓梅 楊利民

（吉林農業大學中藥材學院吉林農業大學省部共建生態恢復與生態系統管理國家重點實驗室，長春130118）

以人參栽培土壤中分離純化的生防菌株放線菌FX-139的發酵液和菌絲體提取物為供體，研究了其對人參愈傷組織生長的影響，及誘導受體防御酶的能力。結果表明：（1）FX-139發酵液和菌絲體提取物濃度為20 mg/L的處理條件對人參愈傷組織生長促進作用最強，比對照增加了68.96%、51.60%，差異顯著。（2）發酵液水飽和正丁醇提取物處理下PAL、POD、PPO酶活峰值分別出現在第21天、第14天、第28天，比CK依次提高了1.29倍、2.5倍、2.12倍。菌絲體丙酮提取物處理下PAL、POD、PPO酶活峰值分別出現在第21天、第14天、第14天，比CK依次提高了1.9倍、2.6倍、1.4倍。（3）通過對人參愈傷組織防御酶活性研究表明，發酵液和菌絲體提取物處理下PAL、POD、PPO酶活性均有明顯變化?？傮w來說，放線菌FX-139發酵液和菌絲體提取物可以誘導人參愈傷組織防御反應的表達，發酵液提取物對POD、PPO有良好的誘導作用，菌絲體提取物對PAL、POD和PPO均有較好的誘導效果。

放線菌；人參愈傷組織；PAL；POD；PPO

誘導抗病性是植物抗病防御反應的一種重要表現形式，具有非特異性［1，2］。近年來研究發現一些生防微生物可以作為誘導因子，促使植物體內防御酶活性發生變化，從而提高自身的免疫力，增強抗病性，最終使植物獲得抵御病害的能力。因此，防御酶被認為是植物抗病機制的關鍵之一［3，4］，當植物受到環境脅迫時，體內會大量合成一系列重要的防御酶，主要包括苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL），過氧化物酶（Peroxidase，POD），多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）等。

在植物抗病反應中，PAL是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶和限速酶，它能催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸，可促進產生植保素類物質，如類黃酮、木質素和水楊酸（Salicylic acid，SA）（植物抗病反應的重要信號分子）的形成，所以PAL酶活性可作為植物抗逆境能力的一個生理指標［5］。一般研究認為其活性升高，植物抗病性增強，活性降低，抗病性減弱［6］。POD是植物抗病反應中的關鍵性酶，是植物所產生的一類氧化還原酶，能水解多余的細胞毒性物質H2O2和OH-，同時POD也是木質素生物合成中最后一步的關鍵酶［7］，木質素具有限制病原菌酶和毒素向寄主擴散、控制水和營養物由寄主向病原菌擴散、抑制病原菌生長和增殖的作用。PPO可以把酚類物質氧化為相應的醌類物質，醌類物質對病原微生物起著抑制作用或殺傷作用，具有一定的抗病能力［8］。PPO同時還參與木質素的合成，使細胞壁增厚來抵御病菌的侵入和擴展，從而抑制發病。

放線菌FX-139為本實驗從吉林省撫松縣萬良鎮人參栽培基地土壤分離得到，為酒紅土褐鏈霉菌（Streptomyces vinaceus-drappus），濾紙片法顯示其對7種人參病原菌具有良好的拮抗性。此外，還發現其發酵液的正丁醇提取物和菌絲體丙酮提取物對人參常見病病原菌均有抑制作用（結果另文報道）。但對人參植株的生長狀況和是否可以作為誘導因子，引起植物體內防御酶發生變化，提高植物的抗病性的研究并不明確。本研究以此為切入點，研究放線菌FX-139對人參愈傷組織生長量和相關防御酶活性變化的影響，旨在初步探討FX-139的抗性誘導機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌 放線菌FX-139為酒紅土褐鏈霉菌（Streptomyces vinaceus-drappus）由吉林農業大學中藥材學院生態恢復與生態系統管理重點實驗分離、保存。

1.1.2 人參愈傷組織 人參愈傷組織由吉林農業大學中藥材學院植物生態學與化學實驗室提供。

1.1.3 主要培養基 高氏一號培養基；ISP2液體培養基；改良MS培養基。

1.2 方法

1.2.1 FX-139發酵液提取物的收集 FX-139在高氏一號平板培養基上進行活化后，將菌餅接入發酵液體培養基中，28℃下在搖床中培養48 h（180 r/min），得到種子液。種子液以10%的接種量接入液體培養基中進行二次發酵，振蕩培養7 d后，在10 000 r/min下離心20 min后取上清。上清液以水飽和正丁醇反復萃取3次，比例為1∶1，收集萃取液，減壓濃縮至浸膏，計算得率后，放入4℃冰箱中備用。

1.2.2 FX-139菌絲體提取物的收集 將1.2.1離心得到的菌絲體以2倍體積的80%丙酮浸泡，超聲破碎（70 Hz，35℃，30 min）。重復3次后收集丙酮提取液，減壓濃縮至浸膏，即得菌絲體提取液，計算得率后，放入4℃冰箱中備用。

1.2.3 供試培養基的制備 將1.2.1和1.2.2中收集到的發酵液提取物及菌絲體提取物配制成1 g/L的母液，無菌條件下微孔濾膜（0.22 μm）過濾除菌，將無菌濾液加入MS培養基中，使培養基的終濃度分別為10、20、50、100、200 及500 mg/L，對照為蒸餾水，待培養基凝固即得供試培養基。

1.2.4 愈傷組織生長情況測定 先稱取制備好的空培養基重量，然后在無菌條件下接入愈傷組織后稱取總重量，接種后總重量與空培養基重量之差即為接種量，控制每瓶接種量盡量一致，每個處理3次重復。接種后置于21℃的培養箱中，暗環境下培養28 d，然后取出愈傷組織稱量其重量，得出愈傷組織生長量，愈傷組織增長量=收獲量-接種量；愈傷組織增長率（%）=愈傷組織增長量/接種量×100%［9］。

1.2.5 愈傷組織防御酶的測定 直接在無菌條件下接種人參愈傷組織，置于培養箱中在21℃、暗環境下培養28 d。其中，每隔7 d從培養瓶中取出適量的愈傷組織，液氮迅速冷卻，置于-80℃的超低溫冰箱中，用于愈傷組織的酶活性測定。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定：參考文獻［10，11］，過氧化物酶（POD）活性的測定：采用愈創木酚法［10］，多酚氧化酶（PPO）活性的測定：采用紫外分光光度法［12］。

1.2.6 數據處理 用 DPSv7.05對試驗數據進行統計分析。采用Williamson的方法評價FX-139發酵液提取物和菌絲體提取物對愈傷組織生長量的影響［13］，即：RI=（T1/T0-1）。其中，RI為發酵液提取物和菌絲體提取物對愈傷組織生長量的效應指數，T1為兩種提取物處理下人參愈傷組織的生長量，T0為對照人參愈傷組織的生長量。當RI＞ 0為促進，RI＜ 0為抑制，絕對值的大小與作用強度成正比［14］。

2 結果

2.1 FX-139發酵液提取物和菌絲體提取物對愈傷

組織生長量的影響

由表1可見，FX-139發酵液提取物和菌絲體提取物對愈傷組織生長量的影響程度與濃度密切相關，呈典型的“低促高抑”的濃度效應。兩者對人參愈傷組織增長促進作用最大的均為20 mg/L的處理，分別增加68.96%（發酵液）、51.60%（菌絲體），與CK差異顯著。其次，隨處理濃度不斷增加，抑制作用不斷增強，與CK相比，發酵液50-500 mg/L處理下開始對受體具有顯著的抑制作用，抑制率分別為18.1%、19.2%、28.1%和47.9%，平均抑制率為28.3%，化感效應值分別為-0.192、-0.53、-0.281、-0.479；平均化感效應為-0.283。菌絲體提取物從100 mg/L開始對愈傷的生長出現抑制作用，抑制率為28.06%。100-500 mg/L處理下抑制率分別為9.7%，25.2%和32.3%，平均抑制率為22.4%，化感效應值分別為-0.097、-0.252、-0.323；平均化感效應為-0.224。

表1 FX-139發酵液和菌絲體提取物對人參愈傷組織生長量的影響

2.2 發酵液及菌絲體提取物對人參愈傷組織防御酶系誘導抗性的影響

2.2.1 FX-139發酵液提取物對人愈傷組織防御酶系的誘導抗性影響 發酵液提取物處理下人參愈傷組織PAL酶活性變化，如圖1-A所示。CK處理下PAL總體看來活性變化在7-14 d略有下降，14 d后酶活性變化平穩，表明接種7 d后愈傷組織逐漸適應了繼代培養基，逐漸趨于穩定生長。10-50 mg/L濃度范圍內，酶活性變化趨勢與CK一致但始終低于CK，且隨著培養時間的延長，酶活性逐漸降低；100-500 mg/L處理下酶活性變化呈“單峰型”。各濃度處理下在14 d后PAL酶活值均低于CK，平均降低了24.81%。100-500 mg/L處理在培養21-28 d時出現活性增大的情況，其中500 mg/L處理與CK差異顯著，比CK提高了1.29倍。表明發酵液100-500 mg/L處理可促使人參愈傷組織PAL酶活性增強。

發酵液提取物處理下人參愈傷組織POD酶活性變化，如圖1-B所示。培養周期內，CK處理下POD活性較穩定，主要在28.4-41.2 U/mg范圍內變化，21 d有微弱增加，10 mg/L處理下在愈傷組織整個生長周期均與CK保持一致。在愈傷組織生長前期，20-100 mg/L處理下酶活性的變化趨勢與CK一致，但隨著處理濃度增加，第21天20-100 mg/L處理下活性大幅度提高，達到活性峰值，最大值比CK提高1.60倍，差異顯著，而隨濃度的增加，處理200-500 mg/L活性高峰提前至第14天出現，最大值比CK提高2.50倍，差異顯著。由此可見，發酵液可顯著影響POD酶的活性，提高其活力或改變其變化趨勢。

發酵液提取物處理下人參愈傷組織PPO活性變化，如圖1-C所示。各濃度處理下PPO酶活性變化為“單峰型”。CK最高值出現在21 d，總體看來活性變化平穩。接種愈傷7 d后10-100 mg/L處理下酶活性低于CK，平均降低了15.63%。200-500 mg/L處理下均高于CK。第14天 200-500 mg/L處理下酶活性下降，但始終高于CK，10-100 mg/L處理下酶活性卻提高來完成對愈傷組織的保護作用，其中100 mg/L處理下酶活性變化較為明顯，酶活性為CK的2.12倍，差異顯著。14 d后各處理下酶活性均高于CK，表現為隨著時間和濃度的升高，酶活性提高，愈傷組織誘導抗性增強，10-100 mg/L處理下酶活性達到峰值，最大值為CK的1.66倍，但21 d后隨著培養時間的延長，酶活性逐漸下降，但始終高于CK。而濃度為200-500 mg/L處理下酶活性依然呈上升趨勢，第28天達到峰值，最大值為CK的2.05倍。表現為高濃度處理可以延長PPO活性表達的時間。

圖1 FX-139 發酵液提取物對防御酶活性的影響

2.2.2 FX-139菌絲體提取物對人愈傷組織防御酶系的誘導抗性影響 菌絲體提取物處理下人參愈傷組織PAL活性變化，如圖2-A所示。各濃度處理下PAL活性變化為“單峰型”，200-500 mg/L處理下酶活性與CK變化趨勢始終一致。接種愈傷7 d后菌絲體提取物各濃度處理下的酶活性均高于CK，最大值為CK的1.27倍。7-14 d在200-500 mg/L處理下PAL活性都有不同程度的下降，但始終高于CK，最大值為CK的1.90倍。第21天各處理條件下酶活性均達到峰值，最大值為CK的1.69倍，隨著培養時間的延長21 d后各處理條件下酶活性均有不同程度的下降，但始終高于CK。

菌絲體提取物處理下人參愈傷組織POD活性變化，如圖2-B所示。各濃度處理下PAL活性變化為“單峰型”。接種愈傷7 d后各處理下酶活性均高于CK。14 d時除10-20 mg/L處理外所有處理酶活性均提高，達到峰值，其中以100 mg/L處理最為明顯，最大值為CK的2.60倍。10-20 mg/L處理下在第21天達到峰值，最大值為CK的1.70倍。21 d后隨著培養時間的延長，POD活性均有不同程度的下降。綜上所述，隨濃度的增加，POD的活性高峰期提前。由14 d提前到7 d，20-500 mg/L對人參愈傷組織POD有良好的誘導作用。

菌絲體提取物處理下人參愈傷組織PPO活性變化，如圖2-C所示。各濃度處理下PAL活性變化為“單峰型”。CK處理下PPO總體看來活性變化平穩。接種7 d后各濃度處理下PPO活性均接近CK。接種14 d后10-100 mg/L處理下PPO活性均有不同程度下降，但始終高于CK，最大值為CK的1.15倍，濃度200-500 mg/L處理下酶活性到達峰值，最大值為CK的1.40倍，接種14-28 d后各濃度處理下酶活性依然升高，10-100 mg/L處理下酶活性直線上升，與28 d到達活性高峰，最大值為CK的1.32倍。綜上所述，20-100 mg/L處理下酶活性平均為CK的1.25倍，誘導效果好于200-500 mg/L的處理。由此也可以看出，在菌絲體誘導抗性的過程中PPO響應滯后，在人參愈傷組織生長末期提高來保護愈傷組織。

圖2 FX-139菌絲體提取物對防御酶活性的影響

3 討論

在研究發酵液提取物和菌絲體提取物對愈傷組織生長量的影響過程中發現，相同濃度下發酵液的促進或抑制活性均強于菌絲體，推測可能與微生物釋放到培養液中的代謝物質的積累有關。

放線菌FX-139不同濃度發酵液和菌絲體提取物處理人參愈傷組織后，愈傷組織中防御酶PAL、PPO和POD的活性均發生明顯變化。在發酵液提取物誘導抗性的過程中，PAL、PPO、POD由于濃度不同導致變化趨勢各不相同，發酵液對PAL的影響主要表現為低濃度抑制，高濃度促進，PAL在濃度100-500 mg/L處理下在第21天活性達到高峰，而POD各個濃度處理下酶活性均高于CK，且差異顯著。POD是防御酶清除活性氧系統的第一道防線，植物遭遇病原菌入侵后POD首先發揮作用。隋麗等［15］將放線菌769發酵液處理水稻植株葉片，研究主要防御酶活性變化，發現769菌株發酵液提高過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。以發酵液原液的作用效果最為顯著，本研究與上述報道基本相符。

在菌絲體提取物誘導的抗性過程中，PAL在各濃度處理下活性均高于CK，且差異顯著，其中以20 mg/mL在第21天誘導能力最大，此濃度對人參愈傷組織的生長有明顯的促進作用。POD在接種愈傷組織7 d后各處理下酶活性均高于CK，其中濃度為20 mg/L處理下第21天酶活性達到峰值。說明菌絲體提取物對PAL、POD均有良好的誘導抗性作用。而在發酵液和菌絲體兩種處理下PPO活性均有不同程度提高，呈現先升后降的趨勢，這與王婧等［16］使用放線菌的發酵液灌根后測定白菜植株體內防御酶系的變化結果基本吻合。

本研究中PAL、PPO 和 POD受發酵液和菌絲體提取物誘導的影響各不相同，主要是在對這3種防御酶表達時間和活性的提高存在差異，這可能是FX-139發酵液和菌絲體提取物對人參愈傷組織生理生化代謝的影響不同所致。FX-139發酵液和菌絲體提取物不僅對人參常見病病原菌有明顯的抑制作用，還可通過誘導人參愈傷組織防御酶活性的變化而增強人參植株的抗病性。這表明放線菌FX-139所產生的活性物質在具有抑菌作用的同時還具有廣譜的誘導抗性，具體何種成分起關鍵作用還有待于進一步研究。

4 結論

本研究以人參土壤中分離純化的生防菌株放線菌FX-139的發酵液和菌絲體提取物為供體，研究了其對人參愈傷組織生長的影響，以及誘導受體抗逆酶活性的能力。低濃度的發酵液和菌絲體提取物對人參愈傷組織的生長均有促進作用，以20 mg/L的處理最好。發酵液提取物不同濃度處理下既提高了防御酶POD、PPO的活性，同時也保證了愈傷組織正常生長，說明發酵液提取物對POD、PPO有良好的誘導抗性作用。菌絲體提取物對PAL、POD和PPO均有良好的誘導抗性作用。

［1］ Boissy G， de la Fortelle E， Kahn R， et al. Crystal structure of a fungal elicitor secreted by Phytophthora crypdogea， a member of a novel class of plant necrotic proteins［J］. Structure， 1996（4）：1429-1439.

［2］ 余迪求， 岑川， 李寶健， 等. 植物系統獲得的抗病性和信號傳導［J］. 植物學報， 1999， 41（2）：115-124.

［3］ 紀明山. 殼聚糖浸種對玉米幼苗根系中幾種防御酶活性的影響［J］. 沈陽農業大學學報， 1999， 30（3）：200-203.

［4］ 薛應龍. 植物生理學實驗手冊［M］. 上海：上?？茖W技術出版社，1985：191-192.

［5］ Mohan R， V ijayan P， Kolattukudy PE. Developmental and tissuespecific expression of a tomato an ionic peroxidase gene by a minimal promoter， with wound and pathogen induction by an additional 5'-flanking region［J］. Plant Molecular Biology， 1993， 22：475-490.

［6］ 李合生. 現代植物生理學［M］. 北京：高等教育出版社， 2002.

［7］ 余叔文， 湯章誠. 植物生理與分子生物學［M］第2版. 北京：科學出版社， 1998.

［8］ Lyneh JM， Wilson KL， Ousley MA. Response of lettuce to Trichodermatreatment［J］. Lett Appl Microbiol， 1991， 12（2）：59-61.

［9］ 上官新晨， 郭春蘭， 楊武英， 等. 培養基及培養條件對青錢柳愈傷組織生長和黃酮含量影響［J］. 福建農林大學學報， 2006，35（6）：587-592.

［10］ 張治安， 張美善， 蔚榮海. 植物生理學實驗指導［M］. 北京：中國農業科學技術出版社， 2004.

［11］ 中國科學院上海植物生理研究所， 上海市植物生理學會編.現代植物生理學實驗指南［M］. 北京：科學出版社， 1999.

［12］ 王婧， 黃云， 姚佳， 等. 兩株根腫病生防放線菌的鑒定及其防病效果［J］. 中國農業科學， 2011， 44（13）：2692-2700.

［13］ 駱世明， 林象聯， 曾任森， 等. 華南農區典型植物的他感作用研究［J］. 生態科學， 1995， 15（2）：114-128.

［14］ 許春媚， 楊莉， 韓梅， 楊利民. 加拿大蓬水浸液對植物幼苗生長的影響［J］. 安徽農業科學， 2010， 38（19）：10031-10033.

［15］ 隋麗， 徐文靜， 杜茜， 等. 放線菌 769 發酵液對水稻體內主要防御酶活性的影響［J］. 吉林農業大學學報， 2009， 31（4）：382-384.

［16］ 王靖. 十字花科作物根腫病生防放線菌研究［D］. 成都， 四川農業大學， 2011.

（責任編輯李楠）

The Effect of the Fermented Liquid and Mycelium Extract of FX-139 on the Growth and Defense Enzymes of Ginseng callus

Guo Shuangshuang Shi Ce Han Mei Yang Limin
（College of Herbal Medicine，Jilin Agricultural University，State Key Laboratory for Ecological Restoratipn and Ecosystem Management of JLPMOST Collective Construct-KLUER，Changchun130118）

Using the fermented liquid and mycelium extract of actinomycetes FX-139 isolated from ginseng rhizosphere as the donor，the effects of it on the growth and ability of inducing defense enzyme activity of ginseng callus were studied. The results showed that: （1）The treatment of FX-139 fermented liquid and mycelium extract at the concentration of 20 mg/L had the strongest promoting effect on Ginseng callus growth， increasing 68.96% and 51.60% higher than that in the control， i.e.， there was significant difference. （2）There was an active peak of PAL， POD and PPO in 21 d， 14 d and 28 d respectively under the treatment with water saturation n-butyl alcohol extract of fermented liquid， it raised 1.29 times， 2.5 times， and 2.12 times against the control group respectively. There was an active peak of PAL， POD and PPO in 21 d， 14 d and 14 d respectively under the treatment with acetone extract of mycelium， it raised 1.9 times， 2.6 times， and 1.4 times against the control group respectively. （3）The change of defense enzyme activities in ginseng callus was detected. PAL， POD and PPO enzyme activity were obviously changed with the treatment of fermented liquid and mycelium extract. Overall， Ginseng callus defense responses could be induced by fermented liquid and mycelium extract of FX-139. Fermented liquid extract could effectively induced POD and PPO， and mycelium extract could effectively induced PAL， POD and PPO.

actinomycetes；Ginseng callus；PAL；POD；PPO

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.020

2014-08-27

國家科技支撐計劃項目（2011BAI03B01-02），國家自然科學基金項目（31270371），吉林省科技發展計劃重點項目（20125068）

郭雙雙，男，碩士生研究生，研究方向：微生物及分子生物學；E-mail：1530811226@qq.com

楊利民，男，博士，教授，研究方向：中藥資源生態與藥材質量調控；E-mail：ylmh777@126.com