農桿菌介導的蓖麻轉化體系優化

李偉 翟羽佳 李鵬程 王昌祿

（天津科技大學 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津　300457）

農桿菌介導的蓖麻轉化體系優化

李偉 翟羽佳 李鵬程 王昌祿

（天津科技大學 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

針對影響農桿菌侵染效率的主要因素進行條件優化，確立了以OD600為0.8的菌液侵染、預培養5 d后的外植體為最佳侵染條件；侵染外植體經過5 d的共培養并除菌后，轉到含有250 mg/L Kan的培養基中進行再生誘導，獲得了多株具有Kan抗性的再生植株；通過在共培培養基中添加20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3和152.4 mg/L DTT，有效地抑制了侵染后外植體的褐化現象，提高了篩選階段抗性芽的成活率；對具有Kan抗性的再生植株進行PCR和Southern blot驗證，共獲得18株包含外源基因的陽性轉化株。

蓖麻；農桿菌侵染；轉化體系

蓖麻是世界十大油料作物之一，具有極高的經濟價值和廣泛的工業用途，是一種十分重要的工業油料作物。人們對蓖麻產業的重視直接導致蓖麻油需求量劇增，使得蓖麻原料供求關系極不平衡，而傳統的育種方法又無法有效解決這一矛盾，于是越來越多的人開始將分子育種技術應用到蓖麻育種工作中［1］。

早期對蓖麻分子育種的研究主要包括蓖麻再生體系的構建，自1998年Sujatha Reddy［2］首次報道了更為穩定的再生體系后，以印度和美國為主的幾家科研機構先后報道了以不同外植體配以不同的誘導條件構建的再生體系，我國也有很多針對國內蓖麻品種進行的體外再生研究，這些都為蓖麻實施分子育種奠定了良好的基礎。但對蓖麻的轉化體系研究還處于初級階段，相關報道較少。2000年，Mckeon等［3］曾申請過蓖麻轉化的相關專利，這是世界上首次成功實施蓖麻轉化的報道，轉化率0.42%；2005年，Sujatha等［4］在以胚軸為外植體，成功構建了以農桿菌介導的蓖麻轉化體系，但轉化率極低；2008年，Sailaja等［5］構建了以萌發后的胚為外植體的基因槍轉化體系，轉化效率可達1.4%，這也為蓖麻轉化提供了新的思路；隨后Sujatha等［6］分別利用農桿菌介導和基因槍的轉化方法，均成功地將Cry1基因轉入了蓖麻組織中，獲得了帶有目的基因的轉化株，這也是第一例成功實施蓖麻分子育種的報道；我國的劉鵬等［7］也通過對蓖麻子葉節外植體實施農桿菌侵染，并成功獲得了轉化株。

盡管蓖麻分子育種研究取得了一定進展，但依然存在穩定性差、難以重復等問題。本研究擬在自主構建的胚尖外植體再生體系基礎上，進行農桿菌介導的蓖麻轉化研究，通過對侵染菌種、侵染時機、侵染強度等影響轉化效率的關鍵因素進行優化，構建更為穩定的蓖麻轉化體系，旨在為高效率進行蓖麻分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗用蓖麻品種稼祥2號，購于山東稼祥蓖麻有限公司。侵染農桿菌采用EHA105和GV3101兩株植物轉化常用根癌農桿菌，并以pBI121作為侵染質粒，實施農桿菌轉化，制備工程菌種。農桿菌及質粒均由中國農業科學作物科學研究所抗逆室惠贈。

1.1.2 試劑 實驗所用MS培養基購于Phytotech公司，6-芐基嘌呤（BA）、吲哚丁酸（IBA）、乙酰丁香酮（AS）、硫代硫酸鈉、二硫基蘇糖醇（DTT）、卡那霉素（Kan）、頭孢霉素（Cef）等植物激素及其他生化制劑均購于天津藍碧橙生物科技有限公司。

1.1.3 引物合成 試驗根據pBI121中的nptII基因序列設計了檢測引物，委托天津鼎國公司進行合成。引物序列：KanF：5'-TCGTCACCCTTTCTCGGTC-3'；KanR：5'-CTGGCGGAGAATCATACGCA-3'。

1.2 方法

實驗所用基本培養基為Murashige & Skoog（MS）培養基，配以30 g/L蔗糖和6.4 g/L瓊脂粉，pH（5.8±0.1）。萌發培養基：MS +0.3 mg/L BA；預培養培養基：MS+0.2 mg/L BA；共培培養基：MS+0.35 mg/L BA+20 mg/L AS+ 124 mg/L Na2S2O3+152.4 mg/L DTT；恢復培養基：MS+ 0.35 mg/L BA+350 mg/L Cef，；篩選芽誘導培養基：MS+0.35 mg/L BA+0.25 mg/L IBA+350 mg/L Cef+250 mg/L Kan，pH（5.8±0.1）；篩選根誘導培養基：1/2MS+0.5 mg/L IBA+350 mg/L Cef+250 mg/L Kan，pH（5.8±0.1）。以上培養基滅菌條件為：121℃，20 min.

植物組培培養條件為光照強度2 000 Lx，光照周期16/8，28℃培養。

1.2.1 外植體的獲取 取完整飽滿的蓖麻種子去殼；用0.1%的KMnO4浸泡10 min消毒；用無菌水反復沖洗3-4次；將滅菌的種子胚乳撥開，用鑷子小心取出蓖麻胚，接種于萌發培養基中，28℃，暗培養5 d。

去除萌發胚頂端芽結構，取形態學上端3-5 mm的胚尖部位為外植體，接種于預培養培養基中，28℃，光照培養3-7 d。

1.2.2 侵染菌種的活化 挑取轉入pBI121質粒的農桿菌EHA105和GV3101單菌落，分別接種于含有50 mg/L Kan和50 mg/L Rif的LB液體培養基中，28℃，200 r/min，黑暗培養過夜；取培養后的農桿菌液1-2 mL，重新接種于有50 mg/L Kan和50 mg/L Rif的LB液體培養基中，28℃，200 r/min，培養4-6 h，進行二次活化；將活化好的農桿菌菌液進行5 000 r/min離心，收集菌體，用無菌水稀釋成特定濃度，備用。

1.2.3 侵染農桿菌的篩選及侵染強度的優化 將活化好的農桿菌用無菌水稀釋成OD600值為0.6、0.8和1.0三個濃度的侵染液；將準備好的外植體用手術刀輕輕在形態學上端制造數到劃痕，置于稀釋好的侵染液中，黑暗條件下，28℃侵染15 min；將侵染后的外植體取出，轉移到鋪有滅菌濾紙的培養皿中，吸去多余的菌液，接種于鋪有一張濾紙的共培培養基上，黑暗條件下，28℃進行共培培養3、5和7 d；共培后的外植體經多次沖洗除菌后，接種于篩選芽誘導培養基中培養21 d；通過統計篩選過程中誘導出的抗性外植體數目，確定最佳的侵染濃度及共培時間。根據侵染菌種、侵染濃度以及共培時間的不同設計實驗批次，每組實驗100個外植體，重復進行3次。

1.2.4 侵染時機的選擇 分別選取在含有0.2 mg/L BA的預培養培養基中培養3、5和7 d后的外植體，以OD600值為0.6、0.8和1.0三個濃度EHA105菌液實施侵染，經共培5 d后，轉入篩選培養基觀察外植體生長情況。每組實驗100個外植體，重復進行3次。

1.2.5 共培條件的優化 選取侵染后的外植體，分別接種于含有0、20、30和40 mg/L AS的共培培養基中培養，通過統計篩選過程中外植體的抗性芽數目，確認最佳AS濃度，同時對比添加124 mg/L Na2S2O3或152.4 mg/L DTT等還原劑對后期外植體生長狀況的影響，確立最佳的共培階段培養基配方。

1.2.6 植株再生 共培后的外植體，經除菌步驟后，轉接到不含篩選劑的恢復培養基中，28℃，光照培養5 d；選取正常生長的外植體，轉入到篩選芽誘導培養基中，進行芽誘導培養；待抗性芽伸長至3-5 cm時由基部切下，轉入生根培養基中誘導生根；將正常生根的再生植株經煉苗后移入土壤中進行培養。

1.2.7 抗性再生植株的PCR驗證 取抗性再生植株的新鮮葉片200 mg進行DNA提取。采用康維試劑生產的PlantGen DNA試劑盒。以抗性植株DNA為待測模板，以KanF、KanR為引物，進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環30次；72℃延伸10 min。PCR檢測以pBI121質粒為陽性對照模板，以野生型蓖麻DNA為陰性對照模板。

1.2.8 Southern blot檢測 為進一步驗證抗性再生植株轉化成功與否，對PCR檢測呈陽性的轉化植株進行了Southern blot檢測。采用Roche公司生產的地高辛標記和檢測試劑盒II。檢測樣品為待測植物DNA的BamH I和Hind III酶切產物；以pBI121中nptII基因片段合成探針標記；具體雜交步驟參照該試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 菌種的選擇與侵染強度

使用兩種農桿菌配制不同濃度的侵染菌液進行了侵染，結果如表1所示。從篩選培養21 d外植體的成活數目來看，兩種根癌農桿菌的侵染效果相差不大，以EHA105效果較好。侵染菌液濃度對侵染效果有一定影響，以OD600為0.8侵染獲得的抗性外植體數較多。相比之下，共培時間對篩選過程中轉化效率影響較大，共培時間過長還會引起較為嚴重的外植體褐變現象，這說明共培時期是農桿菌進行侵染的主要階段。實驗數據顯示，共培培養5 d時，抗性外植體的成活率最高。

表1 侵染步驟的優化實驗

2.2 侵染時機的選擇

實施轉化過程中，首先需要將外源基因整合到植物細胞中表達，此外，還需要將帶有外源基因的細胞培育成完整的植株。但由于轉化針對的外植體是一個多細胞組織，其中真正具有發育成完整植株潛力的細胞畢竟只是少數，因此，需要對侵染時間進行研究，盡量選擇胚性細胞開始或已經形成的階段實施侵染，以此來提高侵染具有胚性細胞的可能性。試驗選擇預培養3-7 d后的外植體作為實驗材料進行侵染試驗，通過統計不同侵染時間對抗性芽生成數目的影響，確定最佳侵染時機。結果（表2）顯示，經過一定時間的預培養后，外植體的成活率有所提高，外植體的褐化現象也得到一定的抑制，而侵染菌液濃度影響不大。抗性芽數目統計結果顯示，預培養5 d后的外植體，在侵染后抗性芽的生成數目最多。原因可能是由于這個時間胚細胞的活躍程度與農桿菌的侵染效力最為匹配，使得通過侵染轉入外源基因并且具有再生潛力細胞數目更多。預培養7 d后的外植體生成的抗性芽數目明顯減少，這可能是由于錯過了最佳侵染時機所致。最終實驗選擇預培養5 d后的外植體作為侵染外植體。

表2 預培養對轉化效果的影響

2.3 共培培養基的優化

本實驗在共培培養基中添加具有強還原作用的物質，以期緩解和抑制侵染后的褐化現象。通過統計共培后恢復培養過程中的褐化率和抗性外植體生長情況（表3），發現適量的AS確實能提高抗性芽的生成數目，同時添加Na2S2O3、DTT也能明顯降低外植體褐化的幾率。最后，選擇在共培培養基中添加20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3和152.4 mg/L DTT作為最佳共培條件。

表3 共培培養基的優化結果

圖1 抗性植株PCR檢測電泳

2.4 抗性苗的PCR結果

通過Kan抗性篩選及再生誘導，實驗最終獲得了29株再生植株。對轉化質粒中的nptII基因進行PCR檢測，在18株再生植株中檢測到了外源基因，確定成功整合轉化質粒，為轉化陽性株。部分轉化株PCR檢測電泳結果如圖1所示。陽性對照及陰性對照顯示正常，證明檢測結果可靠。

2.5 Southern blot檢測結果

將PCR檢測呈陽性的轉化株，提取其基因組DNA，進行Southern blot檢測。分別提取待測植株葉片組織DNA經Hind III和BamH I消化酶切后，進行Southern blot檢測實驗，雜交結果如圖2所示。不同的轉化株，其外源基因插入的位點及拷貝數有一定的差異，但基本都具有外源基因的結合信號，證明轉化載體pBI121已經成功的整合到了蓖麻基因組中，但各轉化株中外源基因的拷貝數和插入位點可能有較大差異。

圖2 Southern blot檢測結果

2.6 農桿菌轉化全過程

本實驗轉化主要步驟如圖3所示，轉化周期約為3-5個月，平均轉化率為0.85%。

圖3 胚尖外植體轉化過程

3 討論

農桿菌的侵染是指農桿菌通過感染植物創傷部位的細胞而改變其表達基因的過程，是對植物細胞造成損害的過程。侵染強度主要由侵染時間和侵染菌液濃度兩個因素決定。侵染強度過大則可能會使本就造成創傷的細胞受到更大的損害，導致組織壞死；而侵染強度過小則可能會影響侵染效率。本研究在實驗過程中發現，共培后的外植體即使發芽后也很容易出現組織褐變壞死的現象，嚴重影響轉化植株的獲得，這可能與侵染強度過大有關。因此，選擇適宜的侵染強度對于防止組織在后續組培過程中壞死有重要意義，同時也是提高抗性芽誘導效率的重要因素。

除侵染強度之外，植物細胞的生長狀態也是影響其被侵染后成活效率的因素之一。截取外植體的過程是對植物細胞進行物理傷害的過程，這些細胞在被侵染后相當于受到雙重傷害，使其更容易產生嚴重的褐化反應［10］。將外植體先進行一段時間的預培養后再實施侵染，可緩解這些植物細胞因物理傷害對其正常生長的影響，不至于因連續受到損傷壞死。剛截取的外植體也需要一定時間的誘導才能開始形成具有胚性的細胞，這也可以最大限度的保證侵染后的細胞能夠發育成完整的植株。最終實驗選擇預培養5 d后的外植體作為侵染對象，同時優化了共培培養基成分，提高了獲得轉化植株的效率。

目前，大多數農作物的轉化體系都是由農桿菌介導，對于蓖麻的轉化研究，目前成功獲得轉化植株的幾篇報道也多是通過農桿菌侵染實現。農桿菌介導的植物轉化法，效果穩定，應用廣泛，但也存在一系列問題。由于基因轉入步驟完全依靠農桿菌本身的侵染能力，很多因素無法控制，如插入位點的不確定性、轉入基因的拷貝數不確定性等［11］，本實驗結果也出現了類似的情況。這說明在農桿菌侵染的過程中，還有很多值得繼續探索的內容，如具體整合作用基因、插入位點影響因素等，這些工作雖然基礎，但對于其更好的生產應用意義重大，值得科研工作者們進行深入探討。

4 結論

本研究通過對影響農桿菌侵染效率的關鍵因素進行試驗，進一步優化了農桿菌介導的蓖麻轉化體系，確定了以最佳侵染條件為以OD600為0.8的菌液侵染經預培養5 d后的外植體；最佳共培時間為5 d；共培培養基中添加20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3，和152.4 mg/L DTT可有效地提高轉化效率并緩解外植體的褐化現象；經分子驗證確認獲得了18株陽性轉化株，平均轉化率為0.85%。

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（責任編輯 李楠）

Optimization of Agrobacterium-mediated Transformation in Castor（Ricinus communis L.）

Li Wei Zhai Yujia Li Pengcheng Wang Changlu
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457）

The main factors affecting the efficiency of Agrobacterium infection were optimized， and the optimal infection conditions were 5-day-old pre-cultured explants cultured in bacteria solution with OD6000. 8. Infected explants after 5 d of co-culture were transferred to medium with 250 mg/L Kan for bud induction and many strains with Kan resistance ability were obtained. By adding 20 mg/L AS， 124mg/L Na2S2O3and 152. 4 mg/L DTT in the common culture medium， browning phenomenon was effectively inhibited and survival rate of resistant shoots was enhanced. Regenerated plants with resistance to Kan were verified by PCR and Southern blot test. Total 18 positive transformants were obtained.

Castor（Ricinus comunis L.）；Agrobacterium infection；transformation system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.022

2014-09-23

李偉，男，博士，研究方向：植物分子育種；E-mail：skyinmyhear@126.com

王昌祿，男，教授，博士生導師，研究方向：食品生物技術；E-mail：clw123@tust.edu.cn