桿菌肽產生菌的分離鑒定及其發酵條件初步研究

張玉明倪志華李寶庫

（1.河北大學生命科學學院，保定　071002；2.河北大學藥學院，保定　071002）

桿菌肽產生菌的分離鑒定及其發酵條件初步研究

張玉明1倪志華1李寶庫2

（1.河北大學生命科學學院，保定071002；2.河北大學藥學院，保定071002）

桿菌肽在畜牧養殖業中應用廣泛，開展菌種篩選工作十分必要。以低濃度桿菌肽為篩選方法，分離得到一株桿菌肽產生菌，鑒定并命名為地衣芽孢桿菌Y822（Bacillus licheninformis Y822）。該菌株發酵生產桿菌肽時，最適pH為7.0，溶氧能夠促進產物肽積累。將B. licheninformis Y822傳代5次，分別進行發酵試驗，可得到（783.51±7.34）U/mL桿菌肽，其中A組分占（75.04±0.83）%。B. licheniformis Y822桿菌肽產量較高，生產能力穩定，并且產物中桿菌肽A組分含量高，具有較高的工業應用價值。

地衣芽孢桿菌；桿菌肽；分離；鑒定

桿菌肽是由地衣芽孢桿菌（Bacillus lichnifarimis）或枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵產生的一種多肽類廣譜抗菌素，具有抗菌譜廣、不產生耐藥性、安全性評估良好等優良特性。并且，桿菌肽在動物保健中具有促進動物生長、提高機體免疫力的作用，是一種在畜牧養殖業廣泛應用的飼料添加劑［1］。從分子結構而言，桿菌肽為一類多肽復合體，包括桿菌肽A、A1、B、C、D、E、F1、F2等多種組分，其中桿菌肽A為主要成分，且生物活性最高［2］。

美國雅來藥廠（2011年已經并入美國輝瑞公司）是世界上桿菌肽最大的生產企業，目前國內生產企業主要有浦城綠康生化有限公司、華北制藥集團華勝公司和天津新星獸藥廠。隨著我國畜牧業及水產養殖業的迅猛發展，桿菌肽的需求與日俱增，桿菌肽的發酵生產研究得到廣泛關注。胡尚勤等［3］通過細胞融合技術得到一株桿菌肽生產菌，使用檸檬酸為碳源發酵，桿菌肽產量可以高達985 U/mL。徐加兵等［4］以一株地衣芽孢桿菌（B. licheniformis SIN-669-3）為出發菌株，經過復合誘變選育和發酵培養基優化，桿菌肽產量優化前提高14.5%。有報道［5］使用固態發酵工藝生產桿菌肽，降低發酵產物中水分，得到了高濃度桿菌肽產品。目前，關于桿菌肽的研究報道多集中于菌種誘變及發酵條件優化方面。而發酵生產時，菌種是技術關鍵。開展菌種篩選工作，可豐富桿菌肽生產菌種資源，有助于桿菌肽的工業生產，具有重要理論意義和巨大經濟效益前景。

本研究首次以低濃度桿菌肽為篩選手段，從自然界中分離桿菌肽抗性菌株，并從中篩選桿菌肽生產菌種，重點選育桿菌肽A組分高產菌株源。對分離得到的優良菌株進行發酵條件初步優化，旨在為其工業開發利用提供必要的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 藤黃微球菌（Micrococcus luteus）為本實驗室保存，地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）Y822為本實驗室分離得到。

1.1.2 主要儀器與試劑 722型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；恒溫培養振蕩器（哈爾濱東聯電子技術開發有限公司）；北京創通P3000型高效液相色譜儀；Sigma 3K30型高速離心機；KLUP-UV-10型純水機（成都康寧實驗專用純水設備廠）；桿菌肽鋅標準品（華北制藥華勝有限公司）；掃描電子顯微鏡（Hitachi SU8010型）。

1.1.3 培養基 藤黃微球菌培養基：牛肉膏0.15%，蛋白胨0.6%，酵母膏0.6%，葡萄糖0.1%，pH7.0。Luria-Bertani（LB）培養基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH7.0。桿菌肽篩選培養基：將桿菌肽鋅標準品使用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解，添加到滅菌后LB固體培養基內，使桿菌肽鋅終濃度為10 U/mL，培養基傾倒平板備用。

1.2 方法

1.2.1 發酵方法 桿菌肽發酵方法采用徐加兵等［4］描述的培養基。種子培養基：黃豆餅粉2.2%，淀粉0.8%，碳酸鈣0.5%。發酵培養基：淀粉2.5%；豆粕粉7.0%，硫酸銨0.06%，碳酸鈣0.6%。上述培養基均在121℃滅菌30 min。種子培養條件為：37℃、150 r/min、pH自然，發酵培養溫度為37℃。

1.2.2 桿菌肽含量的測定 以藤黃微球菌為敏感菌株，使用雙碟法［3］測定發酵液中桿菌肽效價。使用高效液相色譜法測定發酵液中桿菌肽A的含量［6］。

1.2.3 桿菌肽產生菌的分離篩選 將果園土樣、活性污泥、畜牧場周邊土樣和泡菜汁等樣品90℃處理15 min，冷卻至室溫，取0.2 mL涂布于桿菌肽篩選培養基平板，37℃恒溫培養。培養24 h后，挑取在培養基上生長大而飽滿菌落斜面保存。制備藤黃微球菌平板，將篩選得到的菌株接種于藤黃微球菌平板，37℃培養24 h，測量抑菌圈直徑（H）和菌落直徑（C），選取H/C比值大的菌株保存斜面，以備復篩。然后，將上述篩選得到菌株接種于發酵培養基中，37℃ 200 r/min振蕩培養48 h，測定發酵液中桿菌肽含量。

1.2.4 菌種的鑒定 將篩選得到的桿菌肽產生菌進行生理生化鑒定，并對其16S rRNA序列擴增測序，測序結果比對分析，并提交至GenBank數據庫。

1.2.5 發酵條件的初步研究 使用1.2.1描述的桿菌肽種子培養基和發酵培養基，分別考察種子培養條件（種齡、接種量）和發酵培養條件（pH、裝液量）對生產桿菌肽的影響。

2 結果

2.1 桿菌肽產生菌的分離、篩選及鑒定

經平板初篩、藤黃微球菌抑菌試驗和發酵培養復篩，共篩選到12株桿菌肽產生菌。其中一株產芽孢細菌Y822，不僅具有較高的桿菌肽生產能力，且桿菌肽產物中A組分含量高。因此，選此菌株進行深入研究。菌株Y822在LB 培養基上菌落呈圓形，邊緣不齊，較薄，表面粗糙，不透明，顯灰白色。顯微鏡鏡檢發現，該菌呈桿狀，有中生芽孢，菌體長1.5-3.0 μm，寬0.6-0.8 μm。菌株Y822革蘭氏染色呈陽性，其生理生化試驗結果如表1所示。進而對菌株Y822的16S rRNA進行測序，測序結果提交GenBank（登錄號HQ005269）。根據生理生化試驗結果和16S rRNA測序分析結果，菌株Y822鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），命名為Bacillus licheniformis Y822，圖1為其掃描電鏡圖。

2.2 種子培養條件對發酵生產桿菌肽的影響

將斜面培養的B. licheniformis Y822接種入液體種子培養基，選擇6個時間點（圖2-A）的種子培養液接種發酵（接種量5%），考察種子液種齡對發酵的影響。發酵培養條件設定為37℃、pH6.0，500 mL三角瓶裝液量100 mL，搖床轉速200 r/min，發酵48 h后測定桿菌肽含量。

表1 菌株Y822的生理生化特征

圖1 B. licheniformis Y822的掃描電鏡圖

圖2-A顯示，種子培養10 h后接種發酵，得到268.44 U/mL的桿菌肽。隨著種子培養時間的延長，桿菌肽產量不斷提高。當種子培養25 h時接種發酵，可以得到最大桿菌肽產量524.54 U/mL。圖2-B為接種量對發酵生產桿菌肽的影響，此時，種子培養時間固定為25 h，發酵培養條件同上，發酵48 h后測定桿菌肽產量。本試驗共考察了6個不同的接種體積（3%-13%），試驗顯示9%接種量為最佳值，發酵可得到624.55 U/mL桿菌肽。

2.3 發酵條件對生產桿菌肽的影響

將發酵培養基pH分別調整為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，培養基滅菌后，接種種子培養液進行桿菌肽發酵試驗，接種量9%。發酵液置于500 mL三角瓶裝中，裝液量100 mL，37℃恒溫震蕩（200 r/min）培養48 h后測定桿菌肽產量。如圖3-A所示，培養基初始pH為6.0時，得到桿菌肽620.56 U/mL。當pH值由6.0上升至7.0時，桿菌肽產量逐漸上升。發酵液中桿菌肽濃度在培養基初始pH7.0時達到最大值（712.36 U/mL）。發酵培養基pH高于7.0后，桿菌肽產量反而呈現下降趨勢。結果表明，中性環境更適宜菌株B. licheniformis Y822積累桿菌肽。

圖2 培養條件對B. licheniformis Y822生產桿菌肽的影響

進一步考察通氣量對發酵生產桿菌肽的影響。搖床震蕩培養時，在相同轉速下裝液量的大小直接關系到發酵時的通氣量。本研究在500 mL三角瓶中分別裝入40、60、80、100和120 mL發酵培養基，37℃，搖床200 r/min振蕩培養48 h后測定桿菌肽產量，結果（圖3-B）顯示，當培養基裝液量為40 mL時，B. licheniformis Y822發酵得到的桿菌肽濃度最高（779.54 U/mL）。

圖3 發酵條件對B. licheniformis Y822生產桿菌肽的影響

2.4 發酵生產桿菌肽穩定性試驗

將斜面培養的B. licheniformis Y822菌株連續傳代培養，共傳5代。將每一傳代得到的菌株進行桿菌肽發酵試驗，以驗證菌株的發酵產量和穩定性。結果（表2）顯示，B. licheniformis Y822傳代5次的平均產量為（783.51±7.34）U/mL，其中桿菌肽A占（75.04±0.83）%。

表2 B. licheniformis Y822發酵生產桿菌肽的穩定性試驗

3 討論

從自然界樣品中分離篩選菌種時，選擇合適的篩選方式十分重要。有研究報道［7，8］，桿菌肽在細胞內合成后，需要通過位于細胞膜上的轉運蛋白將其分泌到胞外。如果胞外桿菌肽濃度超過一定限度，位于細胞膜上的信號蛋白會阻止桿菌肽合成，從而避免桿菌肽產生自身毒害。一般而言，對桿菌肽耐受能力越強的菌株，其自身越有可能具備強大的桿菌肽合成能力。

桿菌肽生產菌株大多分布于芽孢桿菌屬［3］，本研究對樣品90℃處理15 min，目的是為了殺死樣品中雜菌（不產芽孢細菌和霉菌）。隨后，以低濃度桿菌肽為篩選手段進一步優選桿菌肽生產菌株。本試驗共篩選得到了12株桿菌肽產生菌，經過初步鑒定，分別屬于地衣芽孢桿菌（Bacillus licheninformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。其中，分離并鑒定得到的B. licheniformis Y822生長速度快，對指示菌（藤黃微球菌）抑菌效果最佳，因此主要對其進行深入研究。

發酵前進行種子培養可以達到活化菌種、獲得高濃度細胞的目的。并且，種子培養還可誘導微生物產生適用于發酵生產的多種酶類，可提高后續發酵效率。試驗發現，當接種培養10 h后，種子培養基開始出現明顯液化，即黃豆餅粉和淀粉被酶解利用。因此，從10 h開始考察種子培養基培養時間對發酵生產桿菌肽的影響。種子液培養時間低于25 h時，菌體雖然開始產生淀粉酶和蛋白酶液化培養基，但是還僅限于細胞增殖，與桿菌肽合成相關酶系沒有得到誘導表達。此時接種發酵，會導致菌體利用發酵培養基中碳源和氮源大量增殖，導致后期合成桿菌肽時營養不足。種子液培養25 h時，菌體正處于對數生長末期，此時菌體已經開始合成桿菌肽。接種發酵后，菌體利用發酵培養基繼續合成桿菌肽，達到了最高產量。種子培養超過25 h后，由于種子培養基中營養匱乏和桿菌肽積累，微生物鏡檢發現菌體開始產生芽孢，不利于繼續接種發酵培養基。工業發酵生產過程中，發酵接種量一般控制在5%-10%之間。接種量過低，發酵培養時沒有足夠的菌體細胞，會導致延滯期過長，降低發酵產率。接種量過高會導致引入發酵培養基的細胞過多，過度消耗培養基中營養，不利于發酵產物積累。本研究中，過高的接種量還會導致B. licheniformis Y822在種子培養液中積累的桿菌肽引入發酵培養基中，不利于后續發酵過程，因此最佳接種量為9%。

培養條件是發酵過程中的關鍵因素，本研究考察培養基pH和通氣量（裝液量）對發酵生產桿菌肽的影響。研究顯示，B. licheniformis Y822在中性條件下生產桿菌肽能力最強。雷波［9］研究了pH對B. licheniformis的影響，結果顯示7.0和7.4是菌體最佳生長pH和最優抑菌條件，其結果與本研究相一致。本研究中，菌株B. licheniformis Y822發酵產生的桿菌肽濃度與通氣量密切相關。鄧坤等［10］詳細研究了利用地衣芽孢桿菌發酵生產桿菌肽時，培養基中溶氧對產物積累的影響。其研究表明，發酵液中溶氧提高，會顯著提高菌體活力，強化菌體的糖酵解和三羧酸循環代謝。并且，高溶氧還會提高培養基中溶解氨基酸濃度，有利于合成桿菌肽［11］。

從自然界篩選得到菌株在多次傳代培養過程中容易產生遺傳性狀退化，影響其工業化應用價值。本研究將B. licheniformis Y822傳代5次，菌種生產桿菌肽的能力未發現明顯衰減，并且桿菌肽A含量始終保持在75%左右。桿菌肽是一類多肽混合物，其中A組分含量決定著其生物活性高低，篩選高產桿菌肽A組分的菌種更具應用價值［12］。本研究分離篩選得到桿菌肽生產菌（B. licheniformis Y822），菌株遺傳性好，產量穩定，并且產物中A組分含量高，具有較好的工業應用潛力。如果進一步對該菌進行深入研究（如優化培養基組分，使用發酵罐培養以提高溶解氧等），相信B. licheniformis Y822會有更好的發酵表現。

4 結論

本研究利用桿菌肽生產菌具備抗自身代謝產物抑制特點，使用低濃度桿菌肽為篩選手段，成功分離得到桿菌肽產生菌B. licheniformis Y822。B. licheniformis Y822發酵生產桿菌肽能力穩定，可得到生產（783.51±7.34）U/mL桿菌肽，其中桿菌肽A占（75.04±0.83）%。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation，Identification and Fermentation Characterization of a Bacitracin Producing Bacteria

Zhang Yuming1Ni Zhihua1Li Baoku2
（1. College of Life Science，Hebei University，Baoding071002；2. College of Pharmaceutical Science，Hebei University，Baoding071002）

Bacitracin has been widely utilized in livestock breeding and cultivation， and it is necessary to screen strains for improving bacitracin production. In this study， low concentration of bacitracin was used to screen bacitracin producer， and one strain was isolated and identified as Bacillus licheninformis strain Y822. The optimal culture condition for the strain was pH7.0， and the improvement of oxygen supply was favorable to the production of bacitracin. B. licheninformis Y822 was sub-cultured for 5 generations. Each generation of the strain was used to produce bacitracin using the optimized fermentation condition. The average value of the produced bacitracin from 5 generations of B. licheninformis Y822 was （783.51±7.34）U/mL， and the percentage of bacitracin A was about（75.04±0.83）%. The production of bacitracin by B. licheniformis Y822 was stable and efficient. Therefore， B. licheniformis Y822 was a potential candidate for producing bacitracin in industry.

Bacillus licheninformis；bacitracin；isolation；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.024

2014-09-19

河北省教育廳計劃（z2012206），保定市科技局計劃（12ZN012）

張玉明，博士，講師，研究方向：發酵工程、生物化工；E-mail：zhangyuming@hbu.edu.cn