來源于瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶在畢赤酵母中的表達

汪艷李曉，陳勇武運

（1.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊　830052；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊　830052）

來源于瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶在畢赤酵母中的表達

汪艷1李曉1，2陳勇1武運2

（1.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊830052；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊830052）

厭氧真菌Neocallimastix frontalis是瘤胃中降解木聚糖和纖維素的主要微生物之一，其木聚糖酶具有潛在的應用價值。對來源于Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B進行密碼子優化；通過全基因合成優化后的木聚糖酶基因Xyn11Bm，構建該基因的酵母表達載體pPIC9K-Xyn11Bm，并在畢赤酵母GS115中誘導表達。搖瓶水平時，重組Xyn11Bm酶活性最高為4 874.8 U/mL。在10 L發酵罐中誘導96 h后，重組Xyn11Bm的酶活性為5 139.7 U/mL，菌體濕重和干重達到216.7 g/L和117.3 g/L。酶學性質分析表明，重組Xyn11Bm的最適反應溫度為50℃，最適反應pH為5.0。在pH5.0-8.0時該酶具有較好的穩定性，但溫度穩定性較差。底物特異性分析表明，重組Xyn11Bm可水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，但不降解地衣多糖和大麥β-葡聚糖。結果表明重組Xyn11Bm具有潛在的應用價值。

Neocallimastix frontalis；木聚糖酶；畢赤酵母；密碼子優化；酶學性質

反芻動物瘤胃是一個降解植物纖維的高效厭氧發酵罐，微生物包括細菌、真菌和原蟲等［1］。對瘤胃厭氧真菌的研究發現瘤胃厭氧真菌的纖維素酶和木聚糖酶活性比瘤胃纖維素分解細菌、原蟲以及工業用產酶微生物木霉菌等分泌的酶活性都高，如其纖維素分解酶活性是瘤胃纖維素分解細菌產生的酶活性的5倍［2］。基因工程技術為利用瘤胃微生物基因資源提供了可能。通過構建真核和原核工程菌，一些瘤胃微生物木聚糖酶基因實現了異源表達。如厭氧真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶基因XynA在大腸桿菌中表達的水平最高為672 U/mg；經截短表達后，其中的一個克隆表達的木聚糖酶活性達到1 229 U/mg［3］。另一個來源于N. patriciarum的木聚糖酶基因Xynsk1-9在大腸桿菌中表達后，純化的木聚糖酶比活性達到10 371.04 U/mg［4］。來源于Orpinomyces sp. PC6的Xyn1基因在畢赤酵母、鏈霉菌和芽孢桿菌均獲得了表達，最大反應速度達到1 770 μmol/（min·mg）［5］。Neocallimastix frontalis與Neocallimastix patriciarum相似，均為單中心菌體厭氧真菌，由其產生的木聚糖酶在植物細胞壁的降解中起著重要作用［6］。Xyn11B是Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因簇中的一員，屬于糖苷水解酶第11家族成員。研究發現，糖苷水解酶第11家族中的木聚糖酶較其它家族木聚糖酶活力更高［7］。Xyn11B是否是值得開發的一種基因資源，目前還不確定。

密碼子優化是提高蛋白質異源表達水平的重要途徑。有關源于Neocallimastix frontalis的Xyn11B基因優化及其在畢赤酵母中的表達還未見報道。本研究以瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B為基礎，在不改變氨基酸序列的情況下，根據密碼子的偏愛性等對該基因進行密碼子優化，構建畢赤酵母表達載體并在畢赤酵母GS115中進行誘導表達，對重組木聚糖酶的酶學性質進行研究，以期獲得具有工業應用價值的重組木聚糖酶的基因工程菌。

1 材料與方法

1.1 材料

分泌型表達載體pPIC9K及其宿主菌畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115購自Invitrogen 公司；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶Xyn11B基因的優化與合成 在GenBank中檢索出厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶Xyn11B基因序列（登錄號：AY131336.1），根據酵母密碼子偏愛性對Xyn11B的密碼子進行初步替換；為便于后續基因克隆和重組質粒線性化，采用Oligo 6.0分析替換后基因序列中的限制性內切酶切割位點，通過密碼子調整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、EcoR I和Not I的切割位點；為提高mRNA的穩定性和表達水平，采用BioEdit 7.0分析調整后基因序列中mRNA隱蔽剪接位點，并再次對密碼子進行調整，以消除其中的隱蔽剪接位點GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、PolyT和PolyA。采用RNA Structure 3.2對mRNA二級結構的自由能進行分析，篩選獲得自由能最低的序列，并命名為Xyn11Bm。以JCat程序計算優化前后的相對優化度值（CAI）。將優化后的核苷酸序列送交上海生工生物工程有限公司進行全基因合成。

1.2.2 重組Xyn11Bm畢赤酵母工程菌的構建與篩選

合成的Xyn11Bm用EcoR I和Not I（大連TaKaRa公司）雙酶切，并重組至經同樣限制性內切酶酶切的畢赤酵母表達載體pPIC9K（美國Invitrogen 公司）上，轉化大腸桿菌DH5α，經DNA測序鑒定無誤的重組載體命名為pPIC9K-Xyn11Bm。用Sal I對pPIC9K-Xyn11Bm線性化，以ECM399電轉化儀（美國BTX公司）電擊轉化畢赤酵母GS115（美國Invitrogen 公司）感受態細胞，將轉化后的菌液涂布在最小葡萄糖培養基（Minimal dextrose medium，MD）平板上，于30℃培養約48 h至出現克隆子。挑選生長正常的菌落進行甲醇利用表型鑒定，對甲醇利用表型正確的克隆通過遺傳霉素G418硫酸鹽篩選獲得含高拷貝目的基因的重組酵母工程菌。

1.2.3 重組Xyn11Bm畢赤酵母木聚糖酶活性初篩 將篩選獲得的抗4 mg/mL遺傳霉素G418的7個菌株分別接種于含有5 mL 緩沖復合甘油培養基（Buffered minimal glycerol-complex medium，BMGY）的50 mL試管中，29℃振蕩培養24 h后離心用緩沖復合甲醇培養基（Buffered minimal methanol-complex medium，BMMY）重懸，每隔24 h加入甲醇，共培養48 h，甲醇最終濃度為0.5%。培養結束后離心收集上清，以燕麥木聚糖為底物測定酶活性。活性最高的菌株送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。

1.2.4 重組Xyn11Bm畢赤酵母的PCR鑒定 取1 mL菌液參考唐天樂等［8］的方法提取酵母染色體DNA。以 5'AOX1（5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'）/3'AOX1（5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'）為上下游引物進行PCR鑒定。PCR體系為dNTP 2.0 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、5'AOX1 2 μL、3'AOX1 2 μL、Taq酶1.0 μL、DNA 2.0 μL、ddH2O 13.5 μL，總體積25.0 μL。PCR反應條件為：95℃預變性5 min；94℃ 45 s，65℃ 45 s，72℃ 45 s，共30個循環；72℃延伸5 min。取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 重組Xyn11Bm酶活性的測定 采用二硝基水楊酸法測定木聚糖酶活性［9］。取適當稀釋的酶液200 μL，1.0%的樺木木聚糖400 μL，于50℃反應5-10 min，立即加入1 mL二硝基水楊酸溶液，振蕩混勻后于95℃水浴5 min顯色。冷卻后加入3.4 mL去離子水，振蕩混勻后于540 nm處測定吸光度。

1.2.6 Xyn11Bm-12在搖瓶水平條件下的表達 選取在初篩時酶活性最高的重組菌Xyn11Bm-12，按照pPIC9K產品說明在250 mL三角瓶中誘導表達。分別取誘導培養前和誘導培養后12、24、36、48、60、72、84和96 h的樣品進行SDS-PAGE電泳。取96 h的樣品上清用平板剛果紅法定性判斷木聚糖酶的活性［10］。

1.2.7 Xyn11Bm-12在10 L發酵罐中的高效表達 參考楊玉霞等［11］的方法利用10 L自動發酵罐進行液體深層發酵，持續誘導144 h。每12 h取樣10 mL用于測定酶活性、上清蛋白質濃度、菌體濕重和干重。

1.2.8 重組Xyn11Bm的純化 發酵產物經離心后取6 mL上清以Vivaspin 6（美國Millipore公司）超濾濃縮至1 mL，濃縮后的上清用G-75葡聚糖凝膠（美國Bio-Rad公司）進行層析純化，每管收集1 mL。以GeneQuant核酸蛋白檢測儀（美國Anersham Biosciences公司）測定層析液OD280，根據OD280值將處于同一吸收峰的樣品等量混合，并測定合并樣品的酶活性。

1.2.9 重組Xyn11Bm的酶學性質

1.2.9.1 最適反應溫度及熱穩定性 最適反應溫度的測定：取純化酶液分別在20、30、37、40、50、60、70、80和90℃條件下測定酶活性。熱穩定性的測定：取純化酶液分別在30、37、40、50、60、70和80℃條件下保持30 min，在最適溫度及pH值條件下測定其剩余酶活性。

1.2.9.2 最適反應pH值及pH值的穩定性 最適反應pH值的測定：取純化酶液分別在pH為2.2、3、4、5、6、7、8、9、10和10.6下在最適溫度條件下測定酶活性。pH值穩定性的測定：取純化酶液分別在pH為2.2、3、4、5、6、7、8、9、10和10.6下保持30 min，在最適溫度及pH值條件下測定其剩余酶活性。

1.2.9.3 底物特異性 取適量純化后酶液，分別以大麥β-葡聚糖、地衣多糖、燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono-D-xylan（美國Sigma公司）為底物在最適溫度及pH值條件下測定酶活性。

2 結果

2.1 瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶

Xyn11B基因的優化

優化前后序列比對如圖1所示。經Jcat軟件計算，優化后的核苷酸序列CAI由0.31提高到0.90，G+C含量由44.1%下降到42.2%。優化后序列與優化前序列的相似性為85.07%。與優化前序列相比，優化后序列中共對121個氨基酸殘基的密碼子進行了優化，有151個核苷酸被替換。利用RNA Structure 5.3軟件對優化前后的最低自由能進行分析表明，優化對mRNA的最低自由能影響不大，優化前最低自由能為-286.60 KJ/mol，優化后為-277.90 KJ/mol。

2.2 重組Xyn11Bm畢赤酵母工程菌的篩選、活性

測定和PCR鑒定

通過G418硫酸的篩選，共獲得抗4 mg/mL的菌株7個。酶活性（圖2）顯示，7個菌株都具有木聚糖酶活力，其中最高的是12號（命名為Xyn11Bm-12），為2 541 U/mL。該菌株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心后獲得保藏號為CGMCC No.9398。圖3顯示，Xyn11Bm-12工程菌在2 000 bp處出現兩條DNA條帶，其中分子量大的為AOX1基因的PCR產物，分子量小的為目的基因相關產物。這表明Xyn11Bm基因已插入畢赤酵母GS115染色體DNA中。

圖1 瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶Xyn11B基因的原始序列和優化序列的比較

2.3 重組Xyn11Bm基因在畢赤酵母中的表達

2.3.1 Xyn11Bm-12在搖瓶水平條件下的表達 如圖4所示，隨著誘導時間的延長，木聚糖酶活性逐漸提高，到誘導后84 h時，酶活性達到最大值，為4 874.8 U/mL。圖5顯示，酵母菌GS115和轉化空表達載體pPIC9K的酵母菌在培養96 h后沒有產生透明圈，說明其培養上清液無木聚糖酶活性。而Xyn11Bm-12在誘導96 h后的培養上清液產生了清晰可見的透明圈，進一步表明Xyn11Bm基因在畢赤酵母GS115中獲得了表達，并且具有木聚糖酶活性。SDS-PAGE分析（圖6）表明，隨著誘導時間的延長培養上清液中出現了一條分子量約為44.3 kD的蛋白質條帶。在本試驗中，該酶蛋白由339個氨基酸組成，理論分子量為37.02 kD。從SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，在畢赤酵母中表達的瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶的分子量比理論分子量稍微大一些，可能是因為蛋白質糖基化的結果。

圖2 7個重組Xyn11Bm酵母菌株酶活性的比較

圖5 平板剛果紅法鑒定重組木葡聚糖酶Xyn11Bm的活性

圖6 Xyn11Bm-12培養上清的SDS-PAGE電泳圖譜

圖7 Xyn11Bm-12在10 L發酵罐中菌體濕重和干重含量的變化

2.3.2 Xyn11Bm-12在10 L發酵罐中的高效表達

圖7顯示，隨著誘導時間的延長，發酵物濕重和干重含量逐漸增加，在誘導96 h時菌體濕重和干重達到最大值，分別為216.7 g/L和117.3 g/L，之后逐漸下降。到發酵結束時，菌體濕重和干重為160.7 g/L和67.5 g/L。圖8顯示，木聚糖酶活性和比活性呈相似的變化規律。隨著誘導時間的延長，木聚糖酶活性不斷增加，在誘導第96 h時發酵液的酶活性最高為5 139.7 U/mL，之后逐漸下降。在誘導144 h結束時僅為3 577.2 U/mL。

圖8 Xyn11Bm-12在10 L發酵罐中酶活性的變化

2.4 重組Xyn11Bm的酶學性質

2.4.1 重組Xyn11Bm的最適溫度和熱穩定性 圖9顯示，在20-50℃之間，隨著溫度的升高，相對酶活性逐漸提高，超過50℃后，酶活性逐漸下降，表明該酶的最適反應溫度為50℃。熱穩定性試驗表明，重組木聚糖酶Xyn11Bm在20-40℃左右的條件下具有較好的穩定性。但是當溫度超過40℃后，酶活性迅速下降，升到70℃時已基本無活性，表明重組Xyn11Bm不耐受高溫。

圖9 重組Xyn11Bm的最適溫度和熱穩定性

2.4.2 重組Xyn11Bm的最適pH和pH穩定性 如圖10所示，重組Xyn11Bm的最適反應pH為5.0，并且在pH6.0-10.6條件下也有較高活力，在pH10.6時相對酶活性為96.95%。Xyn11Bm酶在pH5.0-8.0的條件下具有較好的穩定性，剩余的活力在80%以上，表明重組Xyn11Bm具有一定的耐酸堿性。

2.5 重組木聚糖酶的底物特異性

圖11顯示，重組木聚糖酶Xyn11Bm可水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖，相對活性分別為15%、100%和175%；但該酶不降解地衣多糖和大麥β-葡聚糖。

圖10 重組Xyn11Bm的最適pH和pH穩定性

圖11 重組Xyn11Bm的的底物特異性

3 討論

木聚糖水解酶系主要包括主鏈上的水解酶β-D-1，4內切木聚糖酶（EC 3.2.1.8，簡稱木聚糖酶）、β-D-1，4外切木糖苷酶和側鏈上的水解酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶等。在這些酶中，β-D-1，4內切木聚糖酶對木聚糖降解起主要作用［12］。厭氧真菌Neocallimastix frontalis是瘤胃中降解木聚糖和纖維素的主要微生物之一，研究者先后從中分離獲得了Xyn11A、Xyn11B、Xynsk等多個木聚糖酶基因并在大腸桿菌中獲得表達，并且Xyn11B的比酶活性最高，達到3 794 U/mg［13］。雖然大腸桿菌表達系統由于其培養成本廉價以及操作過程簡單，常被作為外源基因表達的首選。但是，木聚糖酶在大腸桿菌中表達后往往表達水平較低甚至沒有活性。這主要是因為稀有密碼子的存在和翻譯后需后續進一步加工的緣故，如形成二硫鍵和糖基化。木聚糖酶通常需要N-糖基化，而大腸桿菌對表達的外源蛋白只具有O-糖基化作用［5］。與大腸桿菌相比，酵母表達系統更具優勢：具有翻譯后的修飾、可高密度發酵、將外源蛋白分泌到培養基便于純化、不含大腸桿菌毒素更易于在食品中應用等［14］。因此，本研究首選利用畢赤酵母GS115表達Xyn11B基因。

提高外源基因在宿主中的表達的途徑之一是對外源基因的密碼子進行優化。當外源基因中含有稀有密碼子時將嚴重制約其在宿主中的表達［15］。在對外源基因密碼子優化時，主要應考慮稀有密碼子的替換、消除AT富集區和G+C含量的調整。除此以外，本研究還考慮了mRNA隱蔽剪接位點和自由能。通過對外源基因密碼子優化后，大量外源基因在畢赤酵母中得到了高水平表達。如纖維素酶基因優化后酶活性提高1.24倍［15］，外切葡聚糖酶基因優化后表達水平提高了25%［11］。Tsai等［16］利用釀酒酵母和畢赤酵母分別表達了源于瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis的一個木聚糖酶基因，在誘導10 d后木聚糖酶活性分別達到5 400 U/mL和6 200 U/mL。在本試驗中，優化后的Xyn11Bm基因在畢赤酵母中誘導表達96 h時酶活性最高達到5 139.7 U/mL。這說明，該基因工程菌具有一定的應用價值。

培養基是影響酵母生長的重要因素之一。在利用畢赤酵母GS115進行高密度發酵時，Invitrogen推薦基礎鹽培養基（Basal salts medium，BSM）和PMT1微量元素溶液搭配使用［17］。但近期的研究發現，畢赤酵母在BSM中生長時延滯期較長，因此宿主菌要達到對數生長期所需的時間也較長［18］。畢赤酵母在高密度發酵時菌體干重一般在75-100 g/L［19］。菌體濕重和干重是反映高密度發酵的重要指標，提高受體酵母菌的生長速度有利于外源基因的表達。本研究采用了FM22/PMT4培養基，在誘導培養96 h時發酵液中菌體濕重和干重分別達到了274.6 g/L和123.6 g/L。本研究結果表明，FM22/PMT4培養基更有利于畢赤酵母的生長，因此，可能也更有利外源基因的表達。

范志恒［20］報道，以不同底物評價黑曲霉木聚糖酶活性時，以小麥木聚糖為底物時的酶活最高，其次是燕麥木聚糖，再次是山毛櫸木聚糖，以樺木木聚糖為底物時的酶活最低。本研究中表達的重組木聚糖酶可以水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖，并且酶活性有較大差別。燕麥木聚糖屬于水不溶性木聚糖，樺木木聚糖屬于部分水不溶性木聚糖，木聚糖酶通過內切方式作用于木聚糖主鏈內部的β-1，4木糖苷鍵，降低木聚糖的聚合度［21］。溶解率大的聚糖，其結構支鏈多或聚合度小，因此更易于分解。此外，不同來源的木聚糖在分子結構，尤其在側鏈構成上存在差異，并影響木聚糖酶的結合與水解［22］。這可能是導致不同底物表現出不同酶活性的原因之一。

4 結論

本研究實現了Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11Bm在畢赤酵母中的高密度發酵，最高酶活性為5 139.7 U/mL，最適反應溫度為50℃，最適反應pH為5.0。該酶在pH5.0-8.0之間具有較好的穩定性，可水解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和可溶性木聚糖，但不降解地衣多糖和大麥β-葡聚糖。

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（責任編輯 馬鑫）

Expression of a Xylanase Gene Originated from Rumen Anaerobic Fungi Neocallimastix frontalis in Pichia pastoris

Wang Yan1Li Xiao1，2Chen Yong1Wu Yun2
（1. College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052；2. College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052）

The anaerobic fungus Neocallimastix frontalis is one of main microorganisms in the rumen degrading xylan and cellulose and its xylanase has the potential application value. In this study， a xylanase gene Xyn11B originated from N. frontalis was codon optimized， and the optimized gene Xyn11Bm was synthesized. Based on the gene engineering technology， the yeast expression vector pPIC9K-Xyn11Bm was constructed， and the xylanase was induced and expressed in Pichia pastoris GS115. In shake flask level， enzyme activity of the recombinant Xyn11Bm reached the maximum up to 4874.8 U/mL. In 10 L fermentor， at 96 h after induction， the activity of recombinant enzyme was 5139.7 U/mL， cell wet weight and dry weight were 216.7 g/L and 117.3 g/L. Enzymatic properties analysis showed that the optimum reaction temperature and pH of Xyn11Bm were 50℃ and 5.0. In pH5.0-8.0， the enzyme had sound stability， but poor temperature stability. Substrate specificity analysis showed that recombinant Xyn11Bm could hydrolyze oat spelt xylan， birch xylan and soluble xylan 4-O-Me-D-glucurono-D-xylan， but not degrade lichenin and barley β-glucan. This indicated that the recombinant Xyn11Bm had potential application value.

Neocallimastix frontalis；xylanase；Pichia pastoris；codon optimization；enzymatic properties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.029

2014-09-01

新疆維吾爾自治區高技術研究發展項目（201211104），新疆研究生科研創新項目（XJGRI2013112）

汪艷，女，碩士研究生，研究方向：酶的基因工程；E-mail：312577269@qq.com；李曉為共同第一作者

陳勇，男，教授，研究方向：飼用酶制劑；E-mail：xjaucy@hotmail.com