新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP檢測方法的建立

于可響馬秀麗韓宏宇，2劉存霞李玉峰黃兵宋敏訓(xùn)

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所　山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南　250023；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安　271018）

新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP檢測方法的建立

于可響1馬秀麗1韓宏宇1，2劉存霞1李玉峰1黃兵1宋敏訓(xùn)1

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250023；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安271018）

建立適于基層實(shí)驗(yàn)室快速檢測新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）的一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）方法。基于新型鴨呼腸孤病毒S3基因的6個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)了4條LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒溫保持45 min即可完成反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，由此建立了RT-LAMP檢測方法。該方法具有良好的特異性，除NDRV外對其他6種常見鴨病的檢測結(jié)果均為陰性。該方法對病毒RNA的最低檢出量為0.1 pg，是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，該方法與病毒分離鑒定方法的符合率為98%，而且對儀器的要求低，適于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測。

新型鴨呼腸孤病毒；S3基因；一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

新型鴨呼腸孤病毒感染是近幾年發(fā)生的一種對我國養(yǎng)鴨業(yè)產(chǎn)生較大危害的新型疾病。該病一年四季均能發(fā)生，并且不同品種的鴨均可發(fā)病，如櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨、半番鴨等。發(fā)病日齡一般為3-25日齡，其中以5-10日齡居多，病程5-7 d，發(fā)病率5%-32.5%，死亡率2%-20%，一般發(fā)病鴨日齡愈小，發(fā)病率和死亡率愈高［1，2］。新型鴨呼腸孤病毒與禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）以及傳統(tǒng)的番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）在基因序列、生物學(xué)特性、抗原相關(guān)性等方面均存在較大差異［3］。

Notomi等［4］報(bào)道了一種新的體外擴(kuò)增特異性基因的方法，稱為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)。該技術(shù)針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下（65℃）作用60 min，即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測快速、儀器要求低、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場進(jìn)行快速診斷［5，6］。本研究正是根據(jù)LAMP技術(shù)的原理，建立快速檢測新型鴨呼腸孤病毒的一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RTLAMP）方法，并進(jìn)行初步的臨床應(yīng)用，以期達(dá)到臨床快速診斷新型鴨呼腸孤病毒的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）、A型鴨甲肝病毒（DHAV-A）、C型鴨甲肝病毒（DHAV-C）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、鴨瘟病毒（DPV）和鴨坦布蘇病毒（DTMUV）均由山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.1.2 試劑與材料 RNAiso Reagent、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP購自TaKaRa（大連）公司；Bst DNA聚合酶（大片段）購自NEB公司；甜菜堿（Betaine）購自Sigma公司；SYBR Green I購自Invitrogen公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

SPF雞胚、SPF鴨胚由山東省農(nóng)科院家禽研究所昊泰實(shí)驗(yàn)動物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖與純化 按照常規(guī)方法制備雞胚成纖維（CEF）細(xì)胞，加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取長滿單層的細(xì)胞，傾棄營養(yǎng)液，并用Hanks液洗滌3次后，接種100倍稀釋的種毒，1 mL/瓶，37℃孵育1 h，PBS洗滌后加入含3%新生牛血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收集，然后利用蔗糖密度梯度離心的方法進(jìn)行濃縮純化，純化后的病毒于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank已發(fā)表的新型鴨呼腸孤病毒的S3基因序列（登錄號：JX478258），利用Primer5.0軟件，設(shè)計(jì)針對6個(gè)區(qū)域的4條LAMP引物，包括2條外引物（NDR-F3和NDR-B3）、2條內(nèi)引物（NDR-FIP和NDR-BIP），引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化 反應(yīng)在25 μL，體系中進(jìn)行。參考已報(bào)道的RT-LAMP實(shí)驗(yàn)條件［7，8］，首先通過調(diào)整甜菜堿（Betaine）濃度、MgSO4濃度、擴(kuò)增溫度和擴(kuò)增時(shí)間對反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，具體梯度如下：Betaine終濃度分別為0.2、0.4、0.8和1.6 mol/L；MgSO4終濃度分別為1、3、5和7 mmol/L；反應(yīng)溫度分別為61、62、63、64和65℃；反應(yīng)時(shí)間分別為30、45和60 min。在確立初步反應(yīng)體系和條件的基礎(chǔ)上，對引物濃度進(jìn)行深度優(yōu)化，內(nèi)外引物濃度比例分別按6倍、8倍和10倍的組合進(jìn)行，具體見表2。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察，出現(xiàn)特征性階梯狀條帶可判斷為陽性。

表1 RT-LAMP檢測引物

表2 引物濃度優(yōu)化組合

1.2.4 RT-LAMP產(chǎn)物酶切鑒定 利用SeqBuilder軟件分析RT-LAMP擴(kuò)增片段中的酶切位點(diǎn)，篩選出單一的Msp I位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物理論值為278 bp和168 bp。20 μL反應(yīng)體系中添加10×buffer 2 μL、0.01% BSA 2 μL、Msp I 10 U和RT-LAMP產(chǎn)物5 μL。在37℃水浴中反應(yīng)2 h，取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分析。

1.2.5 特異性檢測試驗(yàn) 分別提取新型鴨呼腸孤病毒、A型鴨甲肝病毒、C型鴨甲肝病毒、番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒和禽呼腸孤病毒的RNA，利用上述優(yōu)化的方法進(jìn)行RT-LAMP檢測，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察，出現(xiàn)特征性階梯狀條帶判斷為陽性。

1.2.6 敏感性檢測試驗(yàn) 提取新型鴨呼腸孤病毒的RNA，利用分光光度計(jì)測定RNA的含量，并將這些RNA稀釋至2 ng/μL、200 pg/μL、20 pg/μL、2 pg/μL、0.2 pg/μL、0.02 pg/μL和0.002 pg/μL等7個(gè)濃度（即RT-LAMP檢測體系中RNA含量分別為10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pg和 0.01 pg，然后進(jìn)行RT-LAMP檢測，每個(gè)樣品重復(fù)兩管。反應(yīng)結(jié)束后，一管取5 μL產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察，出現(xiàn)特征性階梯狀條帶可判斷為陽性，另一管加入1 μL 10倍稀釋的SYBR GreenⅠ，混勻后在紫外線下觀察，若有綠色熒光，可判斷為陽性。同時(shí)以上述不同含量的RNA為模板，以NDR-F3/NDR-B3為引物進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系（25 μL）如下：10×PCR buffer 2.5 μL，引物NDR-F3 0.16 μmol/L，引物NDR-B3 0.16 μmol/L，RNA酶抑制劑20 U，AMV反轉(zhuǎn)錄酶10 U，rTaq酶10 U，模板2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 30 min；95℃3 min；94℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后電泳觀察，出現(xiàn)大小約為337 bp的單一條帶判為陽性。將這兩種方法的敏感性進(jìn)行比較。

1.2.7 臨床應(yīng)用 從不同鴨場收集疑似病例的脾臟組織50份，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的RT-LAMP方法檢測，同時(shí)將樣品處理后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF鴨胚進(jìn)行分離，盲傳3代后，利用陽性血清通過中和試驗(yàn)鑒定分離物，并比較兩種方法的符合性。

2 結(jié)果

2.1 RT-LAMP反應(yīng)體系與條件優(yōu)化

優(yōu)化后的反應(yīng)體系（25 μL）為：10×Bst buffer 2.5 μL、dNTP混合液1 mmol/L、MgCl23 mmol/L、betaine 0.4 mmol/L、TritonX-100 0.1%、外引物（NDR-F3和NDR-B3）各0.16 μmol/L、內(nèi)引物（NDR-FIP和NDR-BIP）各1.6 μmol/L、RNA酶抑制劑20 U、反轉(zhuǎn)錄酶AMV 10 U、Bst DNA 聚合酶8 U、RNA模板2 μL。優(yōu)化后反應(yīng)條件：63℃ 45 min，85℃ 2 min。

2.2 RT-LAMP產(chǎn)物酶切鑒定

RT-LAMP產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果（圖1）顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物被Msp I完全切開，出現(xiàn)278 bp和168 bp兩條條帶，與理論值相符，說明RT-LAMP擴(kuò)增的條帶是NDRV的S3基因。

圖1 RT-LAMP產(chǎn)物酶切鑒定

2.3 特異性檢測試驗(yàn)

利用優(yōu)化的RT-LAMP方法對新型鴨呼腸孤病毒和其他常見的鴨病病原進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖2）顯示，僅新型鴨呼腸孤病毒檢測結(jié)果為陽性。

圖2 RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

2.4 敏感性檢測實(shí)驗(yàn)

提取濃縮純化的新型鴨呼腸孤病毒的RNA，利用分光光度計(jì)測定RNA的含量為276 ng/μL，將RNA稀釋成7個(gè)不同的濃度，分別利用RT-LAMP方法和常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測。凝膠電泳和SYBR GreenⅠ染色的結(jié)果是一致的，兩者均顯示該RT-LAMP方法對病毒RNA的最低檢出量為0.1 pg，其敏感度是常規(guī)RT-PCR方法的100倍（圖3）。

圖3 RT-LAMP的敏感性試驗(yàn)

2.5 臨床應(yīng)用

利用RT-LAMP方法從50份臨床樣品中檢出陽性樣品5份，陽性檢出率為10%，而病毒分離鑒定檢出陽性樣品4份，陽性檢出率為8%，兩種方法的符合率為98%（表3）。

表3 RT-LAMP臨床應(yīng)用

3 討論

近幾年，新型鴨呼腸孤病毒病的流行區(qū)域已從南方擴(kuò)散到北方，發(fā)病率也在不斷上升，已成為影響我國養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。目前對于新型鴨呼腸孤病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷，可以采取傳統(tǒng)的血清中和實(shí)驗(yàn)，但該方法存在耗時(shí)長、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)。也可以采取快速、靈敏、特異的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如常規(guī)RT-PCR、熒光RT-PCR等方法，但這些方法需要PCR儀、電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)等較為復(fù)雜的儀器設(shè)備，不適合在廣大基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。本研究建立的新型鴨呼腸孤病毒一步RT-LAMP具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，特別是對儀器設(shè)備要求低，基因擴(kuò)增和結(jié)果判斷只需要1臺水浴鍋、1臺紫外分析儀或電泳系統(tǒng)，因此非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場進(jìn)行快速診斷。利用該方法檢測時(shí)，從收到病料到獲得結(jié)果最快只需2.9 h：病料處理1 h、核酸提取1 h、核酸擴(kuò)增0.8 h、染色觀察0.1 h。而常規(guī)RT-PCR檢測大約需要5.3 h：病料處理1 h、核酸提取1 h、反轉(zhuǎn)錄0.8 h、核酸擴(kuò)增2 h、電泳0.5 h；熒光RT-PCR檢測大約需要4.8 h：病料處理1 h、核酸提取1 h、反轉(zhuǎn)錄0.8 h、核酸擴(kuò)增2 h。為了更好地確定RT-LAMP檢測方法的靈敏度，我們先對病毒進(jìn)行了純化，然后提取其RNA進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法對病毒RNA的最低檢出量為0.1 pg，其敏感度是利用相同的外引物建立的常規(guī)RT-PCR方法的100倍。這與Chen等［9］利用RT-LAMP方法檢測豬瘟病毒以及王永江等［10］利用RT-LAMP方法檢測柑橘衰退病毒的研究結(jié)果一致。該檢測方法的敏感度是王劭等［11］建立的新型鴨呼腸孤病毒RT-PCR檢測方法的20倍。在本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們參照本實(shí)驗(yàn)室先前建立的禽流感病毒LAMP診斷方法中的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒RNA的最低檢出量為1 pg，僅為常規(guī)RT-PCR方法敏感度的10倍。由于LAMP檢測方法的靈敏度除了與引物設(shè)計(jì)有關(guān)外，還與反應(yīng)體系和條件有較大的關(guān)系，并且檢測引物不同，其最佳的反應(yīng)體系和條件也不盡相同［12，13］。為此我們對本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系與條件進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化過程中，我們發(fā)現(xiàn)，Mg2+濃度、內(nèi)外引物的濃度與比例以及反應(yīng)溫度與時(shí)間對擴(kuò)增效率影響較大。當(dāng)Mg2+終濃度為1 mmol/L或7 mmol/L時(shí)對擴(kuò)增效率有明顯的抑制作用。通常LAMP的反應(yīng)溫度在60-65℃之間［8］，本研究中當(dāng)溫度為65℃時(shí)階梯狀條帶很淡，而61-64℃條帶亮度幾乎無差別。反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為45 min和60 min時(shí)，條帶亮度差別不大，而30 min時(shí)條帶明顯減弱。

LAMP擴(kuò)增結(jié)果一般可通過3種方式判斷：加入SYBR GreenⅠ肉眼觀察、加入SYBR GreenⅠ紫外線下觀察和電泳觀察［14，15］。肉眼觀察簡單方便，無需紫外分析儀，但弱陽性和陰性很難區(qū)分開；電泳觀察需要電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等儀器設(shè)備，不適合在基層實(shí)驗(yàn)室；而在紫外線下觀察結(jié)果，僅需要1臺簡單的紫外分析儀，并且結(jié)果判斷的準(zhǔn)確率大大提高。LAMP檢測技術(shù)的一個(gè)最大缺點(diǎn)是容易出現(xiàn)假陽性，這主要是由于空氣中存在陽性核酸氣溶膠污染所致。可以通過兩種途徑解決這個(gè)問題：一是將反應(yīng)液配制區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和結(jié)果觀察區(qū)嚴(yán)格隔離開；二是每次檢測設(shè)置空白對照。

4 結(jié)論

本研究基于NDRV的S3基因，通過反應(yīng)體系與條件的反復(fù)優(yōu)化，建立了快速檢測NDRV的RTLAMP方法。該方法具有良好的特異性，除NDRV外對其他常見鴨病的檢測結(jié)果均為陰性。該方法具有很高的靈敏度，對病毒RNA的最低檢出量為0.1 pg，是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，本研究建立的RT-LAMP檢測方法與經(jīng)典的病毒分離鑒定方法的符合率為98%，并且具有更高的靈敏度，特別對儀器要求低，可成為基層實(shí)驗(yàn)室的一種快速診斷NDRV的有效手段。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A RT-LAMP Assay for Detection of Novel Duck Reovirus

Yu Kexiang1Ma Xiuli1Han Hongyu1，2Liu Cunxia1Li Yufeng1Huang Bing1Song Minxun1
（1. Key Laboratory of Poultry Disease Diagnose and Immune of Shandong Province，Institute of Poultry，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji’nan250023；2. College of Animal Science &Veterinary Medicine，Shandong Agricultural University，Taian271018）

A one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） assay for detecting novel duck reovirus（NDRV） was established with 4 primers based on 6 conserved positions of the S3 gene. The process of assay was completed by using Bst DNA within 45 min at constant 63℃. RT-LAMP assay had solid specificity because no amplification was found with the samples of 6 other common duck diseases. The minimum detection limit of the RT-LAMP assay was 0.1 pg of viral RNA， which was 100 times of RT-PCR. The results of clinical application showed that the coincidence rate between the assay and the method of virus isolation and identification was 98%， and the requirement of instrument for the assay was relatively low. Therefore， the assay is a potential useful technique for NDRV detection in the field.

novel duck reovirus； S3 gene； one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification； low requirement for instrument

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.011

2014-12-10

山東省海外高層次人才（泰山學(xué)者）引進(jìn)計(jì)劃，山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（SDAIT-13-011-01），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003012）

于可響，男，博士，副研究員，研究方向：禽病診斷與免疫；E-mail：yukx1979@163.com

黃兵，男，研究員，E-mail：hbind@163.com；宋敏訓(xùn)，男，研究員，E-mail：mxsong@aliyun.com