擬南芥SPX1蛋白原核表達及純化分析

胡濤安艷呂群丹徐英武

（1.　浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，臨安　311300；2.　浙江大學生命科學學院，杭州　310058）

擬南芥SPX1蛋白原核表達及純化分析

胡濤1安艷1呂群丹2徐英武1

（1.浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，臨安311300；2.浙江大學生命科學學院，杭州310058）

包含SPX結構域的蛋白在高等真核生物中廣泛存在，這類蛋白的功能多數(shù)還不太清晰，但發(fā)現(xiàn)有些與磷信號相關，有些與鐵信號相關。擬南芥中含有SPX結構域的蛋白可分為4個家族，本研究中的擬南芥SPX1（AtSPX1）屬于一個只含有SPX結構域的蛋白組成的家族，其它家族成員還包含額外的基因序列。進化樹分析表明，AtSPX1編碼的氨基酸序列與雙子葉植物具有較高的一致性，與單子葉植物進化距離較遠。為了揭示AtSPX1蛋白的結構形態(tài)與其生物學功能之間的聯(lián)系，開展了AtSPX1蛋白質體外可溶性表達實驗，構建了原核體外表達載體，在大腸桿菌（E.coli）細胞中獲得了該蛋白可溶性高表達。表達的蛋白包含有His標簽方便了蛋白純化，插入的SUMO融合蛋白標簽可以通過蛋白酶切除，而目標蛋白通過硫酸銨沉淀實現(xiàn)了純化。進一步分子篩層析分析表明AtSPX1以單體形式存在。實驗結果提供了一套表達純化AtSPX1蛋白的有效方案。

SPX結構域；原核表達；蛋白純化；擬南芥

SPX結構域是由最早發(fā)現(xiàn)的3個蛋白名稱的首個字母縮寫來命名的，這3個蛋白分別是酵母的SYGI［1］和Pho81［2］以及人類的XPRI［3］，它們的氨基端都含有一個相對保守共同結構域。目前在動物和植物以及很多高等真核生物中都發(fā)現(xiàn)了含SPX保守結構域的蛋白，根據(jù)所含結構域差異的分類，擬南芥和水稻基因組中所有編碼含SPX結構域蛋白可以分成4個基因家族：SPX家族、SPX-RING家族、SPX-MFS家族及SPX-EXS家族［4，5］。

酵母體內(nèi)存在著一個被稱為PHO體系的磷反應通路，該通路多個成員含有SPX結構域。在磷饑餓脅迫下的轉錄調(diào)控機制中，PHO通路研究最為詳細，研究表明，植物缺磷時會產(chǎn)生類似于酵母PHO操縱子的多基因協(xié)同表達，組成一個高度協(xié)作的分子網(wǎng)絡來適應磷脅迫［6-8］。植物中許多含有SPX結構域的基因參與對缺磷脅迫的反應，一些基因參與植物特異的磷高效吸收和利用機制，而其它基因則參與調(diào)控缺磷誘導的多基因表達［9，10-13］。植物中對磷饑餓響應的許多基因都已被克隆，如AtSPX1、AtSPX3，并對其表達調(diào)控做了深入研究［14-16］。在植物的根、葉、莖中存在著SPX蛋白家庭成員大量的表達［4］。MYB家族的轉錄因子PHR2是植物磷信號通路中心因子，研究表明在水稻中SPX4蛋白作為PHR2的負調(diào)控因子參與了植物磷信號轉導和磷平衡［17］。在擬南芥和水稻中，SPX1蛋白具有同樣的負調(diào)控PHR2的功能［10，13，16，18］，同時SPX1與SPX4蛋白均通過與PHR2蛋白結合抑制PHR2的功能［16-18］。

綜上所述，SPX在植物磷信號通路中發(fā)揮了重要功能，但是SPX蛋白如何與PHR2結合并抑制后者的功能還未闡明清楚。對蛋白結構進行研究有助于闡明其中原因。本研究嘗試通過克隆擬南芥AtSPX1基因，在原核細胞內(nèi)過量表達AtSPX1蛋白，使用親和層析和分子篩層析技術進行蛋白純化，旨在為進一步解析SPX1的蛋白結構奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

哥倫比亞野生型擬南芥由浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地實驗室栽培。E. coli DH5α感受態(tài)細胞，E. coli 表達菌株BL21（DE3）以及表達質粒pE-SUMO為本實驗室保存；RNA提取試劑盒購自北京鼎國昌盛有限公司；反轉錄試劑盒、DNA聚合酶、各種DNA限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程有限公司（大連）；DNA連接酶購自New England Biolabs公司；DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司（北京）；引物由生工生物工程股份有限公司（上海）合成；其余各試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 AtSPX1基因克隆 用Trizol法提取擬南芥葉片組織RNA，反轉錄得到cDNA。根據(jù)擬南芥SPX1基因的cDNA保守序列以及該蛋白的二級結構預測進行引物設計進行AtSPX1基因全長克隆，上游引物A：5'-CGGGATCCATGAAGTTTGGTAAGAGTCTC AG-3'和下游引物B：5'-CCGCTCGAGCTATTTGGCT TCTTGCTCCAACA-3'（下劃線為Bam HI和Xho I酶切位點），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。聚合酶鏈式反應得到的產(chǎn)物連接到pMD-18T并轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)過菌檢和雙酶切實驗后進行測序。將測序正確的菌株擴大提取質粒后，用Bam H I和Xho I雙酶切重組質粒和pESUMO、pET-HTT和pET-GTT載體，切膠回收目的片段。回收產(chǎn)物連接到含有同樣黏性末端載體上，連接反應在16℃過夜。反應混合物轉化到DH5α感受態(tài)細胞并涂布于抗性的LB平板上，挑菌培養(yǎng)后菌液PCR檢測，并將檢測正確的菌液進行測序，由此克隆得到了pE-SUMO-AtSPX1、pET-HTT-AtSPX1和pET-GTT-AtSPX1重組質粒。

1.2.2 AtSPX1理化性質分析 用DNASTAR5.0軟件分析cDNA序列和開放閱讀框；利用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy）提供的生物信息學工具Protparam，分析預測蛋白質的氨基酸殘基性質、分子量及理論等電點。采用Signal IP 3.0 Server分析信號肽序列。

1.2.3 AtSPX1的原核表達 重組表達質粒分別轉化表達菌株RosettaTM（DE3）和BL21（DE3），從抗氨芐霉素和卡那霉素平板上挑取單克隆，接入2 mL LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，當菌體OD600達到0.6時，其中一部分加入0.3 mmol/L IPTG誘導，在37℃搖床上誘導5 h，收集菌體。另一部分加入0.3 mmol/L IPTG誘導，在20℃搖床上誘導14 h，收集菌體。超聲（工作5 s間歇6 s，總時間1 min，功率20%）破碎，SDS-PAGE檢測蛋白表達及可溶性情況。

1.2.4 重組AtSPX1蛋白的純化與SUMO標簽酶切 8 000×g離心收集誘導后的1 L菌液細胞，加入20 mL裂解液（1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tirs-HCl pH 8.0，10% glycerol）冰水下功率為200 W，工作6 s間歇8 s超聲20 min，靜置15 min后，在4℃條件下轉速17 000 r/min離心35 min。收集上清液，將上清液加入已經(jīng)平衡好的Ni-NTA柱，放入冰浴搖床緩慢搖動結合30 min后，將純化柱置于支架上，收集未特異性結合瓊脂糖樹脂上的雜蛋白液，用20個柱體積Wash Buffer（1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10% glycerol，100 mmol/L Imidazole）洗脫非特異性結合的雜蛋白，最后用15倍樹脂體積的 Elution Buffer（1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，10% glycerol，250 mmol/L Imidazole）收集目的蛋白。向蛋白洗脫液中加入ULP1蛋白酶，低溫4℃酶切過夜。

1.2.5 硫酸銨沉淀純化AtSPX1蛋白 將上述酶切反應液用超濾濃縮柱進行濃縮，在目的蛋白的濃度達到0.3 mg/mL時，測量濃縮液體積并查表確定硫酸銨的用量。將硫酸銨分4次加入濃縮液中，每次加入硫酸銨后都輕微搖晃離心管，最后將離心管冰上靜置10 min，12 000 r/min離心5 min后棄上清，加入3 mL裂解液（1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tirs-HCl pH8.0，10% glycerol）將離心管底部沉淀懸浮。

1.2.6 分子篩層析分析目的蛋白與質譜鑒定 將硫酸銨沉淀法所獲的目的蛋白懸浮液用超濾濃縮柱進行濃縮，4 000×g離心濃縮至500 μL體積后上樣，使用分子篩SuperdexTM12 10/300 GL分離純化目的蛋白，以緩沖液（1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tirs-HCl pH 8.0）0.5 mL/min流速分離純化目的蛋白，取10 μL fraction蛋白樣品加入2 μL蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，點樣于12%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），完成電泳后觀察目的蛋白的純化情況。將切取的目的蛋白SDS-PAGE膠點轉入離心管中，樣品質譜鑒定由上海博苑生物技術有限公司進行。

2 結果

2.1 AtSPX1蛋白理化性質及信號肽預測

利用ProtParam工具預測表明AtSPX1蛋白的相對分子質量為30.07 kD，理論等電點（p I值）7.76，含酸性氨基酸（DE）16.4%，堿性氨基酸（KR）16.8%，親水性氨基酸（AILFWV）、極性氨基酸（NCQSTY）和帶電氨基酸（RKHYCDE）的比例分別為35.6%、22.6%和30.9%。根據(jù)在線網(wǎng)站Signal IP 3.0 Server分析AtSPX1蛋白，結果顯示AtSPX1蛋白序列中預測到一個雙向核定位信號，位于該蛋白序列的第30-46位氨基酸的位置。

2.2 pE-SUMO-AtSPX1原核表達載體的構建

測序驗證表明成功構建重組AtSPX1質粒，轉化成功的菌株提取質粒進行PCR鑒定（圖1-A）和雙酶切（圖1-B）均得到目的片段，成功構建了pESUMO-AtSPX1原核表達載體。

圖1 AtSPX1基因PCR擴增結果（A）和pE-SUMOAtSPX1限制性酶切分析（B）

2.3 重組蛋白AtSPX1的表達檢測

誘導溫度、時間及載體對原核表達蛋白的可溶性有重要影響，高溫條件下菌株快速表達目的蛋白容易使蛋白形成不正確的構象折疊最后以包涵體的形式存在，不利于獲得可溶性蛋白。菌液濃度在OD600值0.4-0.6時，以37℃不加入IPTG培養(yǎng)5 h為對照組，以IPTG終濃度0.3 mmol/L的為誘導條件，分別在37℃，5 h 和20℃，14 h的誘導條件下進行誘導培養(yǎng)。SDS電泳結果（圖2）顯示，3種載體只有pE-SUMO-AtSPX1蛋白在20℃條件下上清有表達（圖2-C）。

2.4 Ni-NTA法純化重組AtSPX1蛋白

不同咪唑梯度洗脫蛋白后的SDS-PAGE檢測結果（圖3）顯示，從第7號孔道可以看出，在高濃度咪唑（1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，10% glycerol，250 mmol/L Imidazole）條件下，可洗脫出條帶單一目的蛋白。

圖2 分別含pET-HTT（A）、pET-GTT（B）和pE-SUMO（C）三種載體的AtSPX1融合蛋白的表達檢測

圖3 SDS-PAGE檢測AtSPX1 Ni-NTA親和層析純化

2.5 硫酸銨沉淀

在15 mL洗脫下的蛋白液中（1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tirs-HCl pH 8.0，250 mmol/L Imidazole，10% glycerol），加入0.1%（W/W）ULP1蛋白酶，低溫4℃酶切過夜，用硫酸銨沉淀的方法能夠將靶標蛋白和標簽分開（圖4）。生物信息學分析表明，AtSPX1蛋白N端存在一個17個氨基酸的雙向核定位信號，這個片段在純化過程中很容易降解掉，所以圖4中酶切過后出現(xiàn)兩條帶。

圖4 硫酸銨沉淀

圖5 AtSPX1的凝膠過濾層析圖（A）及SDS檢測（B）

2.6 分子篩層析分析

將硫酸銨沉淀法獲得的蛋白用10 kD超濾濃縮柱濃縮至體積500 μL，通過AKTA Purifier，上樣至凝膠過濾層析柱SuperoseTM12 10/300 GL作進一步純化。作為標準的牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin）、木瓜凝乳蛋白酶（Chymopapain）大小分別為67、43和25 kD，對比作為標準的3種蛋白的洗脫體積和分子量關系可知［19］，目的蛋白峰位置所對應的分子量大小在卵清蛋白（43 kD）位置之后和木瓜凝乳蛋白酶（25 kD）之前（圖5-A），初步確定其為單體（30 kD），并且重組蛋白只出現(xiàn)明顯的單峰，說明蛋白的均一性較好。分子篩層析后，分管收集的蛋白變性后用聚丙烯酰胺凝膠變性電泳檢測，結果（圖5-B）顯示蛋白分子量為30 kD，蛋白純度較高。

2.7 MALDI-TOT/TOF質譜鑒定重組蛋白

對SDS-PAGE考馬氏亮藍染色后的目的蛋白進行MALDI-TOT/TOF質譜。上海博苑生物技術有限公司提供的檢索結果顯示（檢索程序是Mascot：http：//www.matrixscience.com，數(shù)據(jù)庫為NCBInr），目的蛋白為gi|15241275，檢測結果中有21條肽段與目的蛋白AtSPX1序列相匹配。圖6-A紅色部分表示與目的蛋白所匹配的多肽片段，覆蓋率超過60%。圖6-B是Mascot Score直方圖，右邊紅色表示匹配的結果，得分為938分且有顯著性差異（P＜0.05）。左邊陰影區(qū)域為小片段相匹配的肽段，不具備顯著性差異，為不可信任結果。

圖6 AtSEP3蛋白質肽質量指紋圖譜鑒定（A）及M ascot Score直方圖（B）

3 討論

近年來，關于植物響應磷營養(yǎng)脅迫的生理生化機制和信號傳導途徑的研究已經(jīng)有了較大的進展，研究顯示一部分SPX蛋白參與了磷的吸收代謝過程。但也有研究結果表明，OsSPX1基因表達水平下降引起植物對冷脅迫的敏感性增強［11，12］。 AtSPX1基因和OsSPX1具有50.5%的相似性，表明AtSPX1和植物低溫耐受性也可能有關。同時SPX結構域在多個物種間有著較高的保守性，說明了SPX結構域對這些蛋白所行使的功能是不可缺少的。目前亞細胞定位的結果顯示了AtSPX1定位于細胞核中，這與生物信息學預測AtSPX1蛋白在氨基端含有一個17個氨基酸的雙向核定位信號相一致。這個片段在純化過程中容易被降解掉，也解釋了硫酸銨沉淀后出現(xiàn)兩條帶的結果，兩條帶經(jīng)過質譜實驗測定都是AtSPX1蛋白。在目前的原核表達過程中，20℃誘導發(fā)現(xiàn)有可溶性AtSPX1蛋白表達，而37℃誘導可溶性表達則明顯減少。進一步改變誘導溫度、時間以及IPTG濃度，發(fā)現(xiàn)可溶性沒有明顯增加，同時改變蛋白表達宿主細胞也沒有明顯效果。這個問題計劃在后期的實驗中通過重新構建不含核定位信號的表達載體來解決，這有可能提高蛋白的產(chǎn)量。

分子篩實驗表明純化的AtSPX1蛋白是以單體形式存在，同時這個蛋白只包含一個SPX結構域，表明SPX結構域自身并不傾向于形成同型二聚體。擬南芥的SPX2、SPX3、SPX4與SPX1相似性分別是66%、47%和44%，它們都只包含一個長度大約為150個氨基酸的SPX結構域。這個分析暗示擬南芥同源SPX家族成員也可能是單體。但是不同SPX蛋白的SPX結構域長度明顯不同，例如，水稻的OsSPX4的SPX結構域包含170個氨基酸，擬南芥11個PHO1蛋白都含有300-360個氨基酸不等的SPX結構域，不能排除這些蛋白形成多聚體的可能性。有實驗表明，擬南芥的AtSPX1蛋白的功能與鐵和磷營養(yǎng)有關聯(lián)［8］，可能是這兩種信號轉導途徑的交叉點之一，研究SPX結構域在其中的作用以及與它蛋白的互作是值得關注的方向。

4 結論

本研究成功構建了擬南芥SPX1基因原核表達載體pE-SUMO-AtSPX1，在大腸桿菌（E.coli）細胞中獲得了該蛋白可溶性高表達，經(jīng)過親和層析、硫酸銨沉淀、分子篩層析方法得到高純度的AtSPX1蛋白，分子篩層析分析表明AtSPX1以單體形式存在。

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（責任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression and Purification of AtSPX1 Protein in Arabidopsis thaliana

Hu Tao1An Yan1Lü Qundan2Xu Yingwu1
（1. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A & F University，Lin’an311300；2. College of Life Science，Zhejiang University，Hangzhou310058）

The proteins containing SPX domain exist widely in eukaryotes， and the functions of this kind of proteins are not clear yet，however some of them are involved in phosphorus signaling and some in iron signaling. SPX proteins in Arabidopsis thaliana can be divided into 4 families. AtSPX1 used in this paper belongs to the family containing only SPX domain， while other 3 families containing extra gene sequences. Phylogenetic analysis showed that amino acid encoded by AtSPX1 was close with dicots in sequence， but distant from monocots. In order to reveal the relationship between structural property and biological function， we carried out solubility expression experiments of the proteins in vitro，constructed prokaryotic expression vector in vitro， and had the high soluble expression of the protein in Escherichia coli’s cells. The expressed His-tag proteins allowed the purification more convenient， i.e， the inserted SUMO fusion protein tag could be digested by protease， and the target protein could be purified by ammonium sulfate precipitation. The further purification was completed using size exclusion chromatographic column， which yielded a profile corresponding to a monomeric AtSPX1 in solution. This work provided a strategy for the purification of AtSPX1 protein.

SPX domain；prokaryotic expression；protein purification；Arabidopsis thaliana

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.013

2014-12-12

國家自然科學基金項目（31270715），浙江農(nóng)林大學科研發(fā)展基金項目（2010FR072）

胡濤，男，碩士研究生，研究方向：生物物理；E-mail：462109237@qq.com

徐英武，男，博士，教授，研究方向：生物物理學；E-mail：yxu@zafu.edu.cn