擬南芥GCR2參與感應N-丁酰基高絲氨酸內酯過程的初步研究

艾秋實張哲屈凌波劉方趙芊宋水山

（1.河北農業大學生命科學學院，保定　071001；2.河北省科學院生物研究所　河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心，石家莊050081；3.河南工業大學化學化工學院，鄭州　450001）

擬南芥GCR2參與感應N-丁酰基高絲氨酸內酯過程的初步研究

艾秋實1，2張哲2屈凌波3劉方2趙芊2宋水山2

（1.河北農業大學生命科學學院，保定071001；2.河北省科學院生物研究所河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心，石家莊050081；3.河南工業大學化學化工學院，鄭州450001）

N-丁酰基高絲氨酸內酯（C4-HSL）是革蘭氏陰性菌主要的群體感應信號，其能促進植物生長發育，激活細胞膜表面的Ca2+通道，從而參與調控植物的生理代謝。然而，植物感應C4-HSL的分子機制并不清楚。擬南芥GCR2作為ABA的受體，對植物的生理代謝十分重要。旨在探尋GCR2是否參與擬南芥感應C4-HSL的過程。qRT-PCR結果表明，C4-HSL處理后1 h，GCR2基因表達量出現明顯上調并在6 h后達到最大值，說明C4-HSL可調節GCR2。ELISA結果顯示，GCR2蛋白表達量也在6 h達到最大值。對體外表達的GCR2進行純化和濃縮，使其達到0.6 mg/mL后進行微量熱泳動（MST）檢測。MST測得C4-HSL與GCR2的解離常數（Kd）為166 nmol/L，顯示出較強的結合能力。用BSA作為陰性對照，表明C4-HSL與GCR2的結合具有一定的特異性。這些結果表明GCR2可能參與了擬南芥感應C4-HSL的過程。

群體感應；N-酰基高絲氨酸內酯；擬南芥；微量熱泳動

群體感應（quorum sensing，QS）信號是細菌自身誘導物，它廣泛存在于革蘭氏陽性菌和陰性菌中。群體感應信號通過調節特定基因表達進而調控細菌群體行為，這種調控需依賴菌體數量［1］。N-酰基高絲氨酸內酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）是革蘭氏陰性菌分泌的一類自身誘導物，其具有一個保守的高絲氨酸內酯環和一個長度在4-18個碳原子的酰基側鏈。側鏈含4-8個碳原子的AHLs為短鏈AHLs；含10-18個碳原子的為長鏈AHLs。酰基側鏈的長度、飽和度及C3位的取代基決定著AHLs在菌群通訊中的特異性［2-6］。例如，銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中存在兩套完整的QS系統，它可產生N-丁酰基高絲氨酸內酯（C4-HSL）和N-3-羰基十二酰基高絲氨酸內酯（3OC12-HSL）［7］。AHLs有兩種構型，L型AHLs具有較強的生物學活性，D型AHLs活性較低［8］。對大麥和西印度地薯的研究發現L型AHLs被較多的利用［9］。

AHLs能被真核生物識別，從而影響真核細胞的基因表達、信號轉導等［10］。植物可感知根際菌分泌到土壤中的AHLs已經得到廣泛研究。共生細菌和腐生細菌產生的AHLs可引起蒺藜苜蓿體內150種蛋白改變，表明植物能感知AHLs［11］。本實驗室證實N-3-羰基辛酰基高絲氨酸內酯（3OC8-HSL）能廣泛引起擬南芥體內蛋白的變化，發現53個變化明顯的蛋白點，其中2/3上調。經質譜分析發現這些蛋白參與多種生理過程，例如，糖代謝、能量代謝、防衛反應、信號轉導和細胞骨架重構等［12］。

不同的AHLs可引起植物不同的生理反應。本實驗室研究表明，中短鏈AHLs能顯著促進擬南芥（Col-0）主根生長，如C4-HSL、N-己酰基高絲氨酸內酯（C6-HSL）、N-3-羰基己酰基高絲氨酸內酯（3OC6-HSL）和3OC8-HSL，而長鏈AHLs對主根有明顯抑制作用，如N-十二酰基高絲氨酸內酯（C12-HSL）和N-十四酰基高絲氨酸內酯（C14-HSL）［13］。但N-癸酰基高絲氨酸內酯（C10-HSL）、C12-HSL能促進根毛發育，低濃度C10-HSL促進根細胞的分裂與分化，高濃度C10-HSL促進根毛和側根形成，而且C10-HSL對根系結構的調節作用與生長素相似，但它對主根、側根的調節作用并不依賴生長素信號途徑［14］。長鏈AHLs可增加植物在逆境脅迫中的抗性，特別是抗病方面。N-3-羰基十四酰基高絲氨酸內酯（3OC14-HSL）預處理擬南芥后，再用flg22侵染擬南芥發現60 min后MPK3和MPK6依然處于活化狀態，植物防衛相關基因WRKY22和WRKY29以及PR1表達明顯增強［15］。但是，植物如何識別、接受及轉導AHLs的分子機制尚不清楚。

G蛋白偶聯受體（GPCRs）在細胞信號轉導過程中發揮重要作用。本實驗室證實擬南芥中GCR1和G蛋白α亞基（GPA1）參與植物感應3OC6-HSL和3OC8-HSL的過程［13］。此外，Cand2（At3g05010）和Cand7（At5g18520）是擬南芥中待定的GPCRs，經酵母雙雜交證實二者可與GPA1結合［16］。本實驗室證實二者也參與植物感應3OC6-HSL和3OC8-HSL的過程，表明GPCRs可能在植物感應AHLs過程中發揮重要作用［17］。GCR2（At1g52920）是近年來深入研究的GPCRs。研究表明GCR2是擬南芥細胞膜上脫落酸（ABA）的受體，當GCR2結合ABA后，GPA1可解離。gcr2種子不能進入休眠狀態，并對ABA抑制種子萌發和幼苗生長的作用不敏感，表明GCR2調控ABA介導的信號通路［18］。然而，Johnston等［19］認為GCR2不是跨膜蛋白，也不是GPCRs。Ca2+是信號轉導過程中細胞內重要的第二信使，本實驗室證實C4-HSL和3OC8-HSL能升高擬南芥根細胞質中Ca2+離子濃度，而且增加的Ca2+來自胞外，表明這兩種AHLs可能激活了細胞膜上的鈣離子通道［20，21］。依據之前的研究，本研究通過qRT-PCR和ELISA方法研究C4-HSL對GCR2基因轉錄和蛋白表達的影響；并利用微量熱泳動（MST）技術［22-24］研究體外純化的GCR2蛋白與C4-HSL的結合特征，旨為GCR2參與植物感應細菌QS信號——C4-HSL提供證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 擬南芥 野生型擬南芥（Col-0）由本實驗室保存。

1.1.2 菌株與質粒 大腸桿菌DH5α和BL21及含pET28a質粒的BL21由本實驗室保存，其感受態由本實驗室制備。pMD18-T載體試劑盒購自TaKaRa公司。

1.1.3 主要試劑和材料 Ex Taq和r Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶、Bam HⅠ和XhoⅠ限制性內切酶、RNAiso Plus、質粒提取、膠回收、反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；NTA-Ni2+-瓊脂糖購自QIAGEN公司；自裝填料柱購自Bio-Rad公司；咪唑購自MP Biomedicals公司；兔源His-tag一抗，偶聯辣根過氧化物酶（HRP）山羊抗兔二抗購自Bioworld公司；兔源GCR2一抗由河北省科學院生物研究所細胞工程室制備；超濾離心管購自Millipore公司；N-丁酰基高絲氨酸內酯（N-Butyryl-DL-homoserine lactone）購自Sigma公司；Kit RED NHS染料試劑盒購自Nano Temper公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。克隆的GCR2片段送Life Technologies公司測序。

1.2 方法

1.2.1 qPCR分析C4-HSL調控擬南芥GCR2基因表達情況 選用Hoagland培養液培養3周齡的擬南芥幼苗，用10 μmol/L C4-HSL處理并取0、1、3、6、12和24 h樣品。使用RNAiso Plus提取每份樣品的總RNA并反轉錄成cDNA。qPCR反應體系為20 μL，包括5 μL稀釋的cDNA、每條引物加0.4 μL，10 μL SYBR Premix Ex Taq。用Applied Biosystems公司7500 Real-Time PCR System進行檢測。所用引物GCR2（F）5'-TGTATGTGCTCTTGGT GCTGT-3'，GCR2（R）5'-TATTCCCGAGTTGTCTTCCTG-3'；ACTIN（F）5'-CCAGAAGGATGCA TATGTTGGTGA-3'，ACTIN（R）5'-GAGGAGCCTCGGTAAGAAGA-3'。兩對引物Tm值為61℃。

1.2.2 C4-HSL調控擬南芥GCR2表達情況 樣品處理與1.2.1相同。液氮研磨后每份樣品加入1 mL含有 pH7.5 40 mmol/L Tris/HCl、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EGTA、EDTA、PMSF和 DTT、10 mmol/L NaF和β-甘 油 磷 酸 鹽、20 mmol/L Na3VO4、0.5% NP-40和 Triton-100、2 mg/mL Leupeptin、Pepstatin和Aprotitin的蛋白提取液，以提取樣品總蛋白。待提取液融化后，將其吸入1.5 mL EP管中。4℃，14 000 r/min離心，15 min后取上清。上清經SDSPAGE檢測，并用考馬斯亮蘭G-250法確定濃度。每份樣品用包被液稀釋至10 μg/mL。酶標板每孔加入100 μL樣品，4℃過夜。然后每孔加入200 μL封閉液，37℃孵育1 h。洗板3次，用洗液將GCR2抗體稀釋，每孔加入100 μL，37℃孵育45 min。洗板3次，每孔加入100 μL HRP標記二抗，37℃孵育30 min。洗板3次，每孔加入100 μL顯色液，37℃孵育10 min，最后每孔加入50 μL終止液。用Thermo Multiskan GO全波長酶標儀在450 nm下檢測。

1.2.3 GCR2片段克隆與原核表達載體構建 從擬南芥中克隆GCR2片段，上游引物5'-CGCGGATCCATGGGAGAACGGTTTTTCCG-3'（下劃線為Bam HⅠ酶切位點），下游引物5'- CCGCTCGAGGAGTTCATAACCTGGAAACAGAGCT-3'（下劃線為XhoⅠ酶切位點）。Tm值為62℃，再將PCR產物切膠回收。得到GCR2片段與pMD18-T載體連接，轉到DH5α大腸桿菌中并在含氨芐青霉素的LB固體培養基中進行藍白斑篩選，挑取陽性菌落進行菌落PCR驗證，并送測序。提取序列正確的DH5α大腸桿菌中18-T載體，用Bam HⅠ和XhoⅠ將18-T載體中的GCR2片段切下，再與切開的pET28a載體連接。進行雙酶切及測序鑒定，并將pET28a-GCR2轉入BL21大腸桿菌中。

1.2.4 His-GCR2在大腸桿菌BL21中的誘導表達 挑GCR2單菌落，至含有1‰卡那霉素（100 mg/mL）的LB液體培養基，37℃搖床過夜。過夜菌液按2%接種到新培養基中。放入37℃搖床，當OD600至0.6-0.7之間時加入IPTG，其終濃度為0.5 mmol/L。隨后放入28℃搖床5 h后收集菌體。8 000 r/min離心20 min，棄上清。以未加入IPTG的菌體為陰性對照，對誘導后的菌體進行SDS-PAGE檢測。

1.2.5 His-GCR2的純化與濃縮 用10 mmol/L咪唑緩沖液重懸菌體并用其平衡鎳柱。超聲破碎菌體。超聲后，4℃ 8 000 r/min，離心20 min，取上清。將上清加入鎳柱中，4℃進行柱結合2 h。用80 mmol/L咪唑緩沖液洗雜蛋白，共洗3次。用250 mmol/L 咪唑緩沖液洗下目的蛋白，共洗5次。最后分別用250 mmol/L和10 mmol/L咪唑緩沖液清洗鎳柱。用SDS-PAGE和Western blot對純化出的His-GCR2進行檢測。將第3-5次洗脫下來的GCR2，加到預冷的超濾離心管里。用3 500×g，4℃離心約40 min，用考馬斯G-250法確定GCR2濃度達到0.6 mg/mL左右，將其吸出。用SDS-PAGE對濃縮后的GCR2進行檢測。

1.2.6 體外結合試驗 用Monolith.NT115微量熱泳動生物分子互作分析儀對GCR2和C4-HSL的相互作用進行分析。反應體系為0.01 mol/L pH7.0 PBS。用Kit RED標記GCR2，在不同毛細管中其濃度一致。而C4-HSL經倍比稀釋后與GCR2混合并用毛細管吸取反應體系。MST分析儀通過檢測GCR2與不同濃度C4-HSL互作時熒光分子的熱泳動變化來分析二者互作情況，并計算出解離常數（Kd）。以BSA作為陰性對照。

2 結果

2.1 C4-HSL調控擬南芥GCR2的表達情況

為研究GCR2是否參與擬南芥感應C4-HSL過程，先通過qRT-PCR檢測GCR2響應C4-HSL表達情況（圖1）。C4-HSL處理1 h后GCR2出現明顯上調，并在6 h達到最大值，隨后在24 h降至與未處理時相近的水平，表明C4-HSL能增強GCR2的表達。

圖1 C4-HSL調控GCR2表達情況

2.2 C4-HSL調控擬南芥GCR2表達情況

為進一步確定GCR2是否緊密參與擬南芥感應C4-HSL過程，利用GCR2抗體檢測其在擬南芥中的表達情況。經ELISA檢測（圖2）發現GCR2的表達情況與GCR2的表達情況近似。C4-HSL處理后GCR2的表達量從0-6 h逐漸增加，6 h后GCR2的表達量是未處理時的3倍，且此時表達量最大。證明GCR2受C4-HSL調控。

圖2 C4-HSL調控GCR2表達情況

2.3 擬南芥GCR2的克隆及 pET28a-GCR2重組質粒的構建

利用GCR2特異引物從野生型擬南芥中擴增其片段，并對目的片段進行膠回收。膠回收產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預期位置（1 233 bp）有明顯條帶（圖3-A）。將GCR2片段連到pMD18-T載體并轉入DH5α。用Bam HⅠ和XhoⅠ從pMD18-T載體上切下GCR2，再用T4連接酶與pET28a連接。對DH5α中提取的pET28a-GCR2質粒進行雙酶切及測序驗證，出現與目的片段大小一致且序列一致的條帶（圖3-B），表明GCR2片段已插入pET28a載體，然后將該質粒轉入BL21。

圖3 GCR2的PCR產物膠回收瓊脂糖凝膠電泳結果（A）和雙酶切驗證重組質粒pET28a-GCR2（B）

2.4 His-GCR2融合蛋白的誘導及其可溶性檢測

GCR2相對分子量為46.45 kD。His-GCR2融合蛋白經ExPASy分析其相對分子量為51.06 kD。28℃下0.5 mmol/L IPTG誘導后，經SDS-PAGE驗證發現，在40-55 kD之間出現明顯蛋白條帶（圖4第1、2泳道），證明融合蛋白His-GCR2在大腸桿菌中表達。超聲破碎菌體后，分別取上清和沉淀進行SDSPAGE檢測。發現沉淀中His-GCR2多于上清（圖4第3、4泳道）。但沉淀中的包涵體失去蛋白自身的活性結構，所以取上清進行純化。

圖4 融合蛋白His-GCR2誘導表達及可溶性分析SDSPAGE檢測

2.5 His-GCR2融合蛋白的純化和濃縮

將超聲后菌液上清（上清）、結合鎳柱后流出液（流）、雜蛋白洗脫液（W1、W3）及目的蛋白洗脫液（E1-E5）分別進行SDS-PAGE（圖5-A）。并對上清液、流出液及目的蛋白洗脫液（E1-E5）進行Western blot檢測，其中Western blot分別用Histag一抗和GCR2一抗進行檢測（圖5-B，C）。檢測發現E3-E5蛋白洗脫液純度高，利用超慮離心管濃縮洗脫下的His-GCR2，濃縮后經考馬斯亮蘭G-250檢測濃度為0.635 mg/mL，并進行SDS-PAGE檢測（圖5-D）。結果表明，GCR2沒有在濃縮過程中降解，可用于MST檢測。

圖5 融合蛋白His-GCR2純化的SDS-PAGE和W estern blot檢測及濃縮后的SDS-PAGE檢測

2.6 利用MST技術分析GCR2與C4-HSL體外結合特征

通過MST技術檢測GCR2與C4-HSL，以及BSA與C4-HSL結合情況。測得GCR2與C4-HSL的Kd值為166 nmol/L，顯示出較強的結合能力。BSA與100 μmol/L C4-HSL反應時仍不能達到飽和狀態，根據這條可能的結合曲線估算其Kd值約為18 600 nmol/L，遠遠大于GCR2與C4-HSL的Kd值（圖6-A， B）。通過兩組實驗對比，表明C4-HSL與GCR2的結合能力較強，且具有一定的特異性。

3 討論

植物是生物界中的重要成員，它可將地上和地下部分的生物群體聯系起來。植物需要調節、分配自身的各種資源以完成生長發育和抵抗外部不利因素。然而土壤中非致病的根瘤菌、根際真菌和細菌有助于植物的生長發育［25］。大量研究表明AHLs能促進植物的生長發育，還可提高植物的抗病能力［26］。但是植物如何識別、接受AHLs信號是目前研究的重點。2013年，Thomanek［27］合成了生物素標記的3OC14-HSL（biotin-3OC14-HSL），其能被在大腸桿菌中表達的AHLs受體識別。使用biotin-3OC14-HSL與包被有鏈霉親和素的磁珠進行pull-down實驗，證實其能夠與包被有鏈霉親和素的磁珠結合，這為尋找擬南芥中與3OC14-HSL相互作用的蛋白，乃至尋找3OC14-HSL的受體都至關重要［27］。

圖6 GCR2與C4-HSL結合特征分析（A）和BSA與C4-HSL結合特征分析（B）

AHLs對哺乳動物細胞生理生化的調控機制已有較為深入的研究。LuxR蛋白家族中大部分成員是革蘭氏陰性細菌中與AHLs相互作用的轉錄因子［28］。AHLs與LuxR結合后使其構象發生改變，從而使LuxR中的HTH（螺旋-轉角-螺旋）結構域與DNA上游的啟動子結合。LasR和RhlR是LuxR家族成員，C4-HSL和3OC12-HSL能夠進入猴子腎臟細胞，并激活在猴子腎臟COS-1細胞系中表達的LasR和RhIR轉錄因子［29］。3OC12-HSL在較高濃度下可顯著降低骨髓源巨噬細胞的活性，C4-HSL不能抑制其活性。通過細胞核斷裂及染色質凝聚情況的形態學分析，認為3OC12-HSL引起骨髓源巨噬細胞活性降低是由于其引起了細胞凋亡［30］。Rumbaugh對3OC12-HSL和C4-HSL處理后的小鼠成纖維細胞進行轉錄組表達芯片分析，發現其分別引起10%和8% mRNAs的改變。3OC12-HSL可增加小鼠成纖維細胞中胞質Ca2+水平［31］，這與本實驗室用C4-HSL和3OC8-HSL處理擬南芥根細胞的結果一致［20，21］。Shiner［31］證實3OC12-HSL使胞內鈣庫內質網中的Ca2+釋放到胞質中。認為3OC12-HSL激活了磷脂酶C（PLC），隨后IP3與內質網上IP3的受體結合，從而促進內質網中的Ca2+釋放出來。

GPCRs可結合多種激素及藥物，并通過PLC調節下游的信號通路。Rumbaugh［32］推測GPCRs很可能作為哺乳動物細胞膜上AHLs的受體。本研究qRT-PCR結果顯示擬南芥GCR2對C4-HSL應答迅速，6 h后上調至最大值，這與GCR1、Cand2和Cand7響應3OC6-HSL及3OC8-HSL的情況相似［13，17］。ELISA結果顯示C4-HSL處理后GCR2蛋白的表達情況與轉錄水平近似，也在6 h后達到最大值，證實擬南芥GCR2能夠響應C4-HSL。利用超濾離心管濃縮純化的GCR2用于MST檢測。經MST檢測發現GCR2與C4-HSL具有較強的結合能力。根據目前已有的報道，宋水山［10］提出了AHLs在真核細胞中信號轉導模型，即AHLs與細胞膜上的GPCRs結合，激活細胞膜表面的Ca2+通道，使胞外Ca2+進入細胞質中。或激活細胞膜上的PLC，使內質網中的Ca2+釋放到細胞質中。通過Ca2+信號的變化影響下游代謝途徑。另外，MST檢測BSA與C4-HSL是否結合時，出現了一條可能的結合曲線。這是因為BSA作為具有親水和疏水集團的運輸蛋白，可與非離子表面活性劑［33］、黃酮類［34］、酯類［35］等小分子結合。C4-HSL作為一種酯類小分子物質，極有可能與BSA發生某種非特異的結合，且經檢測發現這種可能的結合極其微弱。由此表明GCR2與C4-HSL的結合具有特異性。由于GCR2作為ABA通路的上游基因［18］，GCR2與C4-HSL具有明顯的結合特征，表明C4-HSL可能具有增強植物抗性作用。然而，擬南芥GCR2是否作為C4-HSL的受體還需使用多種受體動力學研究方法進一步研究。

4 結論

本研究通過qRT-PCR分析C4-HSL對擬南芥GCR2表達水平的調節情況，發現GCR2受C4-HSL調控，且C4-HSL處理后GCR2響應迅速，且上調時間較長。利用ELISA檢測C4-HSL處理后擬南芥中GCR2的含量，進一步證實GCR2受C4-HSL調控。濃縮體外表達的GCR2進行MST檢測，發現GCR2與C4-HSL具有較強的結合能力，并且具有一定的特異性。由此證明，擬南芥GCR2可能介導了擬南芥響應C4-HSL的信號轉導過程。

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（責任編輯 李楠）

Prelim inarily Research on Involvement of Arabidopsis GCR2 Responsing to N-Butyryl-DL-homoserine Lactone

Ai Qiushi1，2Zhang Zhe2Qu Lingbo3Liu Fang2Zhao Qian2Song Shuishan2
（1. College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding071001；2. Biology Institute，Hebei Academy of Sciences，Hebei Engineering and Technology Center of Microbiological Control on Main Crop Disease，Shijiazhuang 050081；3. School of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou450001）

N-Butyryl-DL-homoserine lactone（C4-HSL）is a main quorum sensing signal in gram-negative bacteria. It could significantly promote root elongation and activate Ca2+channel at cytomembrane. C4-HSL can regulate metabolization of plant. However， little is known about the molecular mechanism of plants responding to C4-HSL. Arabidopsis thaliana GCR2 is receptor of abscisic acid（ABA）. It is important for metabolization of plant. This research aimed to explore whether the GCR2 is involved in the process of Arabidopsis thaliana reacting to C4-HSL. qRT-PCR showed that C4-HSL could regulate expression of GCR2. Expression of GCR2 was significantly upregulated after 1 h treated by C4-HSL and maximaized at 6 h. ELISA also showed that expression of GCR2 maximaized at 6 h. GCR2 was purified and condensed to 0.6 mg/mL for Microscale Thermophoresis（MST）measurement. MST indicated that dissociation constant（Kd）of GCR2 and C4-HSL was 166 nmol/L，which meant that they had strong binding affinity. Taking BSA as negative control， this certified that binding of GCR2 and C4-HSL had special character. These results showed that Arabidopsis GCR2 maybe involved in the pathway of plant responding to C4-HSL.

quorum sensing；N-acyl-homoserine lactones；Arabidopsis thaliana；microscale thermophoresis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.014

2014-12-15

國家重點基礎研究發展計劃（“973”計劃）（2015CB150604），國家自然科學基金項目（31270880）

艾秋實，男，碩士研究生，研究方向：植物抗逆機理研究；E-mail：yingyangtt@163.com

宋水山，男，博士，研究員，研究方向：細胞信號傳導；E-mail：shuishans@hotmail.com