高產武夷菌素wysR基因過表達菌株的篩選及菌株生物特性研究

王家旺 葛蓓孛 劉艷 劉彥彥 張克誠

（中國農業科學院植物保護研究所　農業部作物有害生物綜合治理重點實驗室，北京　100193）

高產武夷菌素wysR基因過表達菌株的篩選及菌株生物特性研究

王家旺 葛蓓孛 劉艷 劉彥彥 張克誠

（中國農業科學院植物保護研究所農業部作物有害生物綜合治理重點實驗室，北京100193）

以武夷菌素生物合成正調控基因wysR過表達菌株為初選材料，通過瓊脂塊法對2 060個過表達菌株單菌落進行初篩，得到35個優選菌株，再采用搖瓶發酵復篩的方法篩選出9個高產菌株，并通過菌株遺傳穩定性分析，最終確定W-273菌株為最優菌株。研究武夷菌素wysR基因過表達菌株W-273的生理生化特征，發現與原始菌株CK-15相比，W-273菌株生長迅速，產孢量增加且產孢時間提前，W-273菌株生長3-4 d即可完成產孢，較菌株CK-15產孢時間提前了3-4 d；電子顯微鏡觀察W-273菌株和CK-15菌株孢子形態不同，W-273菌株孢子呈橢圓形或桿狀，CK-15菌株孢子呈圓形；通過搖瓶發酵表明W-273菌株較CK-15菌株代謝旺盛，抗生素產量提高79%-289%，且最佳發酵時間縮短4-8 h。

武夷菌素；過表達菌株；wysR基因；篩選

武夷菌素（Wuyiencin）是不吸水式鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis）產生的農用抗生素，主要用于防治作物真菌病害［1］，如黃瓜白粉病，番茄葉霉、灰霉病等，具有廣譜、高效、低毒的特點，在現代化生態農業和綠色食品生產中具有廣闊的應用前景。目前，菌株效價較低已經成為限制武夷菌素產業化發展的障礙之一，因此，選育高產菌株、降低生產成本是武夷菌素研究的核心內容。

在武夷菌素育種方面，曾采用了原生質體融合［2］以及誘變育種的方法包括NTG、紫外誘變、低能碳離子注入和亞硝基胍誘變［3］及60Coγ-射線誘變［4］。雖然采用傳統的育種方法已經使原始菌株效價提高了近1倍多，但由于傳統的育種工作量大，具有不定向性，且菌株經過多次傳代培養后易發生回復突變。因此，采用基因工程手段進行育種，克服傳統育種的隨機性和盲目性，因其具有目標明確、效率高、菌株穩定等優點，成為近年來研究的熱點。

實驗室前期從原始菌株CK-15中得到一個武夷菌素生物合成正調控基因wysR，將該基因克隆至具有強啟動子psf的載體PSF14上，接合轉移至原始菌株 CK-15中，構建了過表達菌株ooR［5］。通過比較發現，該菌株較原始菌株的效價有顯著提升。構建過表達菌株使用的質粒是一種整合型穿梭質粒載體，其轉入鏈霉菌之后與基因組整合的位點是隨機的，得到的轉化子并不全都使抑菌活性得到大幅提高。因此，要想獲得高效、優良的菌株必須有一個進一步的篩選過程。通過平皿瓊脂塊法初篩，搖瓶發酵復篩的方法從菌株單菌落中篩選高產菌株的方法簡單可行且比較直觀，廖曉珣等［6］從井岡霉素的吸水鏈霉菌井崗變種J1單菌落中經過平皿初篩、搖瓶復篩獲得菌株J1-U-D，效價達25 874×10-6g/mL，比出發菌株提高29%。

本研究以武夷菌素wysR過表達菌株ooR為基礎，通過瓊脂塊法初篩、搖瓶發酵復篩，以期得到高產、穩定的武夷菌素wysR基因過表達菌株；同時觀察高產菌株在MS培養基平板不同時間菌絲孢子生長情況，檢測菌株發酵過程中不同發酵時間菌絲體干重、發酵液糖含量和發酵液效價的變化情況，旨為改進武夷菌素發酵工藝和基因工程育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株武夷菌素原始菌株CK-15（Streptomyces anhygroscopicus var. wuyiensis CK-15）；武夷菌素wysR基因過表達菌株ooR（St. wuyiensis ooR），該菌株是將原始菌株CK-15中得到的武夷菌素生物合成正調控基因wysR克隆至具有強啟動子psf的載體PSF14上，重新接合轉移至菌株 CK-15中，構建的過表達菌株ooR，前期研究表明菌株ooR在MS培養基上長勢良好［7］；生物測定指示菌用紅酵母（Rhodoiorula rubra），以上菌株均由中國農業科學院植物保護研究所農用抗生素組提供。

1.1.2 供試培養基 菌種培養采用MS培養基：20 g黃豆餅粉放入蒸餾水中煮30 min，用4層紗布過濾定容至1 000 mL，每100 mL分裝入盛有2 g甘露醇和1.7 g瓊脂粉的250 mL三角瓶中，121℃高溫濕熱滅菌30 min；生物測定用PDA培養基：配置見參考文獻［8］；56#發酵培養基（g/L）：玉米粉30、黃豆餅粉20、葡萄糖20、硫酸銨4、碳酸鈣3；可溶性發酵培養基（g/L）：葡萄糖 20、酵母粉20、氯化銨4、硫酸鎂 0.4 。

1.2 方法

1.2.1 發酵液制備及生物活性測定

1.2.1.1 發酵液制備 采用MS培養基28℃恒溫培養武夷菌素產生菌，培養5-7 d后用滅菌牙簽將培養基劃成1 cm2菌塊至裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，28℃、220 r/min搖床震蕩培養，濾紙過濾即得發酵液。

1.2.1.2 生物活性測定 采用PDA培養基以紅酵母為指示菌，管碟法［9］測定武夷菌素效價，武夷菌素效價標準曲線方程為：y=7.6932x-106.33，R2=0.977（x代表抑菌圈直徑，y代表標準液濃度）。

1.2.2 武夷菌素高產菌株篩選

1.2.2.1 單孢子懸浮液的制備 在武夷菌素wysR基因過表達菌株的MS培養基表面加入10 mL無菌水，用滅菌牙簽刮取培養基表面孢子，滅菌紗布過濾，將菌絲體和單個孢子分開，過濾液即為單孢子懸浮液。

1.2.2.2 瓊脂塊法初篩 單孢子懸浮液稀釋后均勻涂布于MS培養基平板上，28℃恒溫培養箱倒置培養3 d。用滅菌打孔器打出直徑為5 mm的單菌落瓊脂塊，接種針挑取單菌落瓊脂塊置于含3%紅酵母菌的PDA培養基表面，間隔一定距離擺放，帶菌面朝上，28℃培養24 h，挑選抑菌圈直徑較大的菌株轉接到MS培養基，28℃恒溫培養7 d。

1.2.2.3 搖瓶發酵復篩 待初篩獲得的菌株在MS表面產生大量孢子，接種到發酵培養基，搖瓶發酵60 h，管碟法測效價。每個菌株重復3瓶，取平均值，以原始菌株為對照，篩選出幾株較優菌株。

1.2.2.4 遺傳穩定性實驗 將經復篩選出的菌株，接種于MS平板培養基上進行傳代培養5代，觀察各代菌株生長狀況，并對各代菌株進行搖瓶發酵實驗，管碟法測效價，分析比較傳代前后菌株產素能力的變化。

1.2.3 高產菌株生物特性研究

1.2.3.1 高產菌株形態特征和培養特征的觀察 在MS培養基上培養過表達菌株W-273和原始菌株CK-15，每天觀察記錄菌株在MS培養基平板上的生長情況。并采用插片培養法［10］分別在光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察菌絲和孢子生長情況及形態特征，光學顯微鏡鏡檢時用鑷子小心拔出蓋玻片，有菌的一面朝下放在載玻片上直接觀察即可；電子顯微鏡鏡檢時先將蓋玻片放入2%-4%戊二醛固定液中固定1-2 d，0.1 mol/L pH7.2 PBS緩沖液洗，用1% OsO4后固定1-2 h用重蒸水沖洗30 min，隨后用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇梯度脫水，每級15-20 min，樣品脫水后用醋酸異戊酯處理，CO2臨界點干燥，干燥好的樣品粘貼在樣品臺上，用離子濺射儀表面噴金，噴金后樣品在掃描電鏡下掃描，拍照并記錄。每天取蓋玻片在光學顯微鏡下觀察菌絲和孢子生長情況，待產生大量孢子后在電子顯微鏡下觀察孢子形態。

1.2.3.2 菌絲體干重測量 將過表達菌株W-273和原始菌株CK-15接種到純液體發酵培養基，發酵培養8、16、24、32、40、48、56、64、72和80 h后，發酵液用事先稱好重量的濾紙過濾，過濾完在80℃烘箱烘4 h后稱重，稱重重量減去濾紙重量即為菌絲體干重。

1.2.3.3 發酵液總糖含量 在56#發酵培養基中接種過表達菌株W-273和原始菌株CK-15，發酵培養 8、16、24、32、40、48、56、64、72和 80 h后采用DNS法［11］測定發酵液中總糖含量，以葡萄糖為標準品制定的標準曲線方程為y=0.642x+ 0.0406，R2=0.9966（x代表520 nm吸光值，y代表葡萄糖含量）。

1.2.3.4 武夷菌素效價 在56#發酵培養基中接種過表達菌株W-273和原始菌株CK-15，發酵培養24、32、40、48、56、64、72和80 h后管碟法檢測武夷菌素效價。

2 結果

2.1 武夷菌素高產菌株篩選

2.1.1 高產菌株篩選 將單孢子懸浮液涂布于MS培養基28℃培養3 d后，產生的單菌落經瓊脂塊法初篩，從2 060株菌株中選育出35株抑菌圈直徑相對較大菌株，搖瓶發酵復篩后管碟法測效價，結果見表1，其中菌株W-20、W-141、W-273、W-306、W-381、W-443、W-602、W-802、W-995的效價最高，較菌株CK-15效價提高195%-258%，選定這9株菌株作為第一代菌株進行遺傳穩定性測定。

2.1.2 高產菌株的遺傳穩定性 將篩選到的高產菌株再傳代4次，共5代菌株，觀察各代菌株生長狀況，菌株W-381和W-1001分別傳至第4代和第5代時菌株生長減慢、產孢時間推遲、產孢量減少，需培養7-8 d完成整個生長過程，其他菌株生長穩定。并分別對各代菌株進行搖瓶發酵，測定效價，結果見表2。篩選到的菌株第一代效價均值可達到8 309 μg/mL，從第一代傳到第二代后菌株效價下降明顯，再傳代后除菌株W-273和W-443外其他菌株效價均有不同程度的下降，菌株W-273和W-443傳代穩定性較好，且W-273菌株效價較W-443菌株高，最終確定W-273菌株為篩選到的最優菌株，已將該菌株保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心（保藏號為9604）。

2.2 高產菌株W-273生物特性

2.2.1 菌株生理形態特征 將高產菌株W-273和原始菌株CK-15接種到MS培養基平板，觀察生長狀況及用插片法觀察菌絲及孢子生長狀況，由圖1可知，高產菌株W-273較原始菌株CK-15菌絲生長較快產孢量增加且產孢時間提前，高產菌株W-273生長3-4 d即可完成產孢，較原始菌株CK-15提前3-4 d。菌株W-273孢子比菌株CK-15孢子稍大，且W-273菌株孢子呈橢圓形或桿狀，CK-15菌株孢子呈圓形（圖2）。

2.2.2 菌株的生理生化特征 將高產菌株W-273和原始菌株CK-15接種到可溶性發酵培養基56#發酵培養基發酵不同時間后，分別測量菌絲體干重、發酵液總糖含量以及武夷菌素效價。圖3顯示，菌株W-273在8-24 h時菌絲體生長量最多，而菌株CK-15在16-24 h時菌絲體生長量最多，菌株W-273較CK-15菌絲大量生長時間提前約4-8 h。對應不同發酵時間發酵液總糖含量，發酵過程中菌株W-273消耗糖含量最多的兩個時間段為發酵前期的8-16 h和24-32 h，菌株CK-15要推遲到16-24 h和32-40 h，這兩個時間段可能分別為菌絲體生長最迅速的時段以及菌株開始產生抗生素的時段，兩個時段W-273菌株較CK-15菌株約提前8 h。

表1 武夷菌素產生菌搖瓶復篩結果

表2 武夷菌素高產菌株的遺傳穩定性

如圖4所示，W-273發酵24 h后發酵液已經有較低的抑菌活性，對應的CK-15菌株發酵液要推遲至32 h，并且W-273菌株發酵最優時間為56 h，較CK-15菌株的64 h提前約8 h。過表達菌株W-273效價穩定在5 000-7 000 μg/mL，較野生菌株CK-15效價1 800-2 800 μg/mL提高79%-289%，W-273菌株發酵液抑菌活性明顯增強（圖5）。

3 討論

近年來，基因工程技術在抗生素的改造及菌種選育工作中的應用越來越多［12］，其中常用的方法包括改造代謝途徑、改造抗生素生物合成基因簇、改造核糖體和原生質體融化技術。

生物合成基因簇攜帶編碼調控因子的調控基因，調控因子是一類在轉錄水平調節基因表達的蛋白質，它們能特異性地結合到該基因簇中的核酸調控元件，激活或阻礙抗生素結構基因轉錄成mRNA。過量表達編碼激動子基因和失活編碼阻遏子的基因，是增加抗生素的最為快速有效的方法［13］。Anton等［14］通過增加納他鏈霉菌中編碼PAS/LuxR激動子pimM基因的拷貝數使匹馬霉素產量提高了2.4倍。Martinz-Costa等［15］通過將變鉛青鏈霉菌內編碼LysR-type 轉錄調節子的基因actVB-orf10失活，使放線菌紫素產量提高3.5-5倍。

圖1 高產菌株W-273菌絲孢子觀察結果

圖2 高產菌株W-273孢子電鏡掃描圖

圖3 不同發酵時間菌株W-273菌絲體生長情況及發酵液總糖含量變化

武夷菌素生物合成基因簇中的wysR基因包含功能保守的PAS-LuxR結構域，研究表明PAS-LuxR調控子在不同的多烯類鏈霉菌中有著相同的調控方式，這些基因負責聚酮化合物鏈的構建，糖基的脫水與鏈接，ABC轉運蛋白以及作為調控的靶基因［16］。Anton等［14］研究中報道了含有PAS-LuxR 結構域的調控因子PimM是匹馬霉素生物合成途徑中的正調控因子。魏杰等［17］將納他霉素生物合成基因簇中的基因PimM置于強啟動子PermE 之下進行整合性表達，構建過表達載體PBJPM，并接合轉移至金褐鏈霉菌SYAU0709中，通過搖瓶發酵和HPLC檢測分析發現，有些轉化子的金褐霉素產量比野生型菌株提高3-4倍，說明PimM基因在金褐鏈霉菌中有促進金褐霉素合成的作用，并且遺傳性能穩定。

圖4 發酵過程中菌株W-273發酵不同時間效價變化

圖5 培養3 d后W-273菌株發酵液對紅酵母的抑菌效果

前期劉彥彥等［5］將wysR基因克隆至具有強啟動子psf的載體PSF14上，并接合轉移至原始菌株 CK-15中，構建了過表達菌株ooR，效價穩定在3 000-4 000 μg/mL。傳統的誘變方法具有盲目性和隨機性，突變率僅有1/103-1/106，并且突變株中多數為負向變異，正突變率低［18］，導致育種工作量大，隨機性強，效率低下。本實驗通過瓊脂塊法及搖瓶發酵的方法篩選高產過表達菌株，最終從2 060株過表達菌株中篩選得到高產菌株W-273，較出發菌株ooR效價提高1倍。基因工程育種目標明確，正突變率顯著提高，此次篩選的2 060株過表達菌株的抑菌效果較原始菌株均有顯著的提高，工作量減小，育種效率顯著提高。

通過MS培養基平板和插片法顯微鏡觀察wysR基因過表達菌株W-273菌絲孢子生長情況，結合發酵過程中的生理生化指標包括菌絲體干重、發酵液糖含量和發酵液抑菌活性，比較其生物學特性。結果表明與原始菌株CK-15相比，W-273菌株生長迅速，產孢量增加且產孢時間提前；W-273菌株較CK-15菌株代謝旺盛，發酵前期菌絲體增長快，糖消耗量大，產素時間提前4-8 h，并且抗生素產量提高79%-289%，說明wysR基因可以正調控菌株的生長速率、產孢量及武夷菌素的生物合成，這一結論與劉彥彥［5］的結論是一致的。觀察菌株孢子形態，W-273菌株孢子呈橢圓形或桿狀，CK-15菌株孢子呈圓形；W-273菌株菌體形態的變化說明wysR不僅與武夷菌素的生物合成有關，而且可以影響菌體形態分化，這與天藍色鏈霉菌的情況相類似，天藍色鏈霉菌中bld、afs、abs等基因不僅可以調控抗生素的生物合成，而且可以影響菌體的生長［19］，而基因影響菌體形態變化的分子機制有待進一步的研究。

4 結論

通過瓊脂塊法初篩以及搖瓶發酵復篩的方法從武夷菌素wysR基因過表達菌株單菌落中篩選出高產武夷菌素wysR基因過表達菌株W-273。研究W-273菌株的生物學特征，發現W-273菌株生長迅速，產孢量增加且產孢時間提前，W-273菌株產孢時間較菌株CK-15提前了3-4 d；電子顯微鏡觀察W-273孢子呈橢圓形或桿狀，CK-15菌株孢子呈圓形；通過搖瓶發酵表明W-273菌株較CK-15菌株代謝旺盛，抗生素產量提高79%-289%，且最佳發酵時間縮短4-8 h，W-273菌株可以滿足工業生產需要。

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（責任編輯 李楠）

Screening of High-yield Strain of W uyiencin Gene wysR Overexpression and Its Biological Characteristics

Wang Jiawang Ge Beibei Liu Yan Liu Yanyan Zhang Kecheng
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193）

In this research the over-expression strains with positive-regulating gene wysR synthesized from Wuyiencin were utilized as primary materials， 35 relatively optimal strains were selected from 2060 individual colonies of over-expression strains by agar blocks， then 9 high-yield strains were screened out adopting the method of shake flask fermentation. Ultimately， the strain W-273 was determined as the optimal strain by genetic stability analysis. Comparing the physiological and morphological characteristics between the strain of W-273 and original CK-15， W-273 strain grew faster， the production of spore was higher， and the time of spore production was in advance. The time to complete spore production for W-273 strain was 3-4 d， and this was in advance for 3-4 d than the original strain CK-15. Through electron microscope observation， the spores of W-273 were oval or rod， and the CK-15 strains were circular. Shake flask fermentation showed that strain W-273 had a higher metabolism compared to strain CK-15， antibiotic production increased 79%-289%， and the best fermentation time shortened 4-8 h.

Wuyiencin；over-expression strain；wysR gene；screen

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.019

2014-11-17

公益性行業（農業）科研專項（201103002，201303025），國家自然科學基金項目（31371985， 31401796）

王家旺，男，碩士研究生，研究方向：農用抗生素；E-mail：wjiawang1014@163.com

張克誠，男，博士，研究員，研究方向：農用抗生素；E-mail：zhangkecheng@sina.com