海洋真菌提取物損傷大腸桿菌DNA活性的篩選及活性菌株研究

鮑海燕谷朋娟張翼穆軍馮妍趙辰燕

（1.大連交通大學環境與化學工程學院，大連　116028；2.廣東海洋大學食品與科技學院　廣東省水產品加工與安全重點實驗室　水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，湛江　524088；3.浙江海洋學院海洋科學與技術學院，舟山　316022）

海洋真菌提取物損傷大腸桿菌DNA活性的篩選及活性菌株研究

鮑海燕1谷朋娟1張翼2穆軍3馮妍2趙辰燕1

（1.大連交通大學環境與化學工程學院，大連116028；2.廣東海洋大學食品與科技學院廣東省水產品加工與安全重點實驗室水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，湛江524088；3.浙江海洋學院海洋科學與技術學院，舟山316022）

從海洋微生物中篩選抗菌、抗腫瘤物質是海洋藥物研究的熱點之一，而篩選模型在研究中起著重要作用。建立了可用于抗菌及潛在抗腫瘤活性物質篩選的大腸桿菌差異性DNA修復試驗模型，并運用該模型對海洋共附生真菌的提取物進行了篩選。結果顯示，5株海洋真菌的提取物具有較強的選擇性抑制DNA損傷修復基因缺陷型大腸桿菌的活性，可能具有DNA損傷作用。對這5種活性真菌進行了分子生物學鑒定，而且薄層色譜（TLC）和高效液相色譜（HPLC）-活性追蹤顯示這些菌株可產生較多樣化的活性物質。

海洋微生物；大腸桿菌差異性DNA修復試驗模型；鑒定

海洋微生物藥物是海洋藥物與生物技術重要的交叉領域，海洋真菌作為海洋微生物的重要組成類群，具有生物活性代謝產物豐富且相對易于培養的優點，從海洋真菌中篩選生物活性物質已成為海洋藥物研究的熱點，據不完全檢索，僅天然產物數據庫（Dictionary of Natural Products 2011）中收錄的海洋真菌抗菌與抗腫瘤活性化合物就已達87個［1］，新的報道仍不斷涌現［2，3］。

眾所周知，高效、靈敏、可靠的藥物篩選模型對藥物發現非常關鍵。就抗腫瘤藥物篩選而言，最常用的細胞毒體外篩選模型也存在一些局限性，如對實驗條件的要求和運行成本都比較高，不太適合大量粗提物樣品的經濟快速篩選。而從藥物作用機理來看，很多抗腫瘤或抗菌藥物的作用機制主要是作用于DNA，而多數對DNA 有損傷的物質雖有一定毒性但也有抗腫瘤或抗菌作用，其中毒副作用小的可望用做臨床藥物［4］。大腸桿菌（Escherichia coli）差異性DNA損傷修復試驗（Differentiated DNA damage repair test，DDRT）是一種用于檢測物質對DNA損傷能力的試驗方法，它以一對大腸桿菌菌株（其中一個具有正常的DNA損傷修復能力，而另外一個存在相應的基因缺陷）經樣品處理后生長受抑制程度的差異來判斷樣品是否具有損傷DNA的作用，該方法被用于環境毒物遺傳毒性評價，也被用于抗菌與潛在抗腫瘤物質活性篩選，該方法用于篩選抗腫瘤藥物，簡單快速，與腫瘤細胞株模型的結果具有一定的相關性［5-7］，還可兼顧抗菌活性，且適合于大量粗提物樣品的快速經濟篩選。本研究建立該方法并對本實驗室保藏的分離自大連潮間帶海洋生物的共附生真菌［8，9］發酵提取物進行活性篩選與相關研究，旨在為從海洋微生物中篩選抗菌抗腫瘤物質用于海洋藥物研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供篩選菌株：本實驗室保藏的海洋真菌66株；指示菌株：來自耶魯大學菌種庫，包括野生型大腸桿菌和缺陷性大腸桿菌兩種，編號分別為AB1157（+）、AB3027（-）。

1.1.2 培養基 海洋真菌培養基（1 L）：蔗糖20 g、馬鈴薯汁500 mL、4%的人工海水500 mL、pH自然。如需固體培養基，則加入1.5%-2%的瓊脂粉。營養瓊脂培養基（1 L）：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂粉15 g、純水1 000 mL、pH自然。均高壓蒸汽滅菌。

1.2方法

1.2.1 指示菌懸液的制備 指示菌E. coli AB1157（+）和AB3027（-）的斜面經37℃兩次活化培養后，在超凈臺中加入少量無菌生理鹽水洗滌菌落搖勻，分別倒入無菌試管，并均稀釋至0.5麥氏濁度（OD600= 0.136）。

1.2.2 大腸桿菌差異性DNA損傷修復模型的驗證 采用平皿濾紙片法檢測博萊霉素、絲裂霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、氨芐青霉素、紫杉醇6種藥物各自對這兩株大腸桿菌指示菌的抑制差異性。

將100 μL指示菌［AB1157（+）或AB3027（-）］懸液均勻涂布在營養瓊脂平板表面，靜置待表面稍干，用鑷子貼上滴加有5 μg和2 μg藥物（溶劑為25 μL純水或甲醇）并晾干的無菌濾紙片，每個指示菌種、每種藥物、每個劑量做3個平行，以滴加25 L甲醇并晾干的濾紙片為陰性對照。每個平皿均勻貼7片濾紙片，背面做好標記。將平皿于4℃倒置擴散過夜后，取出于37℃倒置培養12-16 h，取出、測量記錄抑菌圈直徑，并用抑菌圈直徑數據計算藥物對這兩株指示菌的抑菌圈直徑比［AB3027（-）/AB1157（+）］以及該比值的平均值和標準差，并采用t檢驗分析其比值與1之間的差異顯著性（n=9）。

1.2.3 海洋真菌的發酵與提取 將在固體培養基上培養3 d活化的待篩菌種，接種到每個含100 mL海洋真菌液體培養基的500 mL錐形瓶中，無菌透氣膜封口后28℃靜置培養20 d。培養結束后，加入少量乙酸乙酯過夜殺菌，抽濾分離菌絲體與發酵液。菌絲體用100 mL甲醇浸泡過夜后抽濾，得濾液；發酵液用1/2體積乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層；將菌絲體提取物與發酵液提取物合并后旋轉蒸發儀45℃濃縮至干，用少量甲醇∶二氯甲烷（1∶1）多次溶解洗滌后轉入樣品瓶，定容至3 mL，冷藏備用。

1.2.4 活性物質的篩選

1.2.4.1 初篩 將每種樣品一個濾紙片（滴加25 μL提取物）晾干后貼到涂有100 μL指示菌AB3027（-）的營養瓊脂平皿上，使用模型驗證相同的方法培養，并觀察、測量抑菌圈直徑。對于抑菌圈較明顯（抑菌圈大于8 mm）的樣品，使用同樣的方法重復篩選1次（二次初篩）。

1.2.4.2 復篩 將初篩得到的樣品用兩種指示菌缺陷型AB3027（-）和野生型AB1157（+）共同實驗，進行復篩。配制兩種指示菌的新鮮菌懸液，每種指示菌、每個樣品做3個平行。在培養箱中37℃培養12-16 h后取出，測量記錄不同樣品分別對兩種指示菌抑菌圈的直徑，并進行數據分析，選出具有強DNA損傷活性的樣品。

1.2.5 強活性菌株的分子生物學鑒定及薄層層析指紋圖譜

1.2.5.1 分子生物學鑒定 對復篩得到的菌株進行分子生物學鑒定，包括DNA提取、PCR擴增、電泳以及測序［8］。測序引物為真菌通用引物ITS1和ITS4，將測序得到的核糖體DNA內轉錄間隔區（ITS rDNA）全序列提交GenBank進行BLAST檢索，與數據庫中已有菌株的ITS rDNA序列進行相似性比較。并用Clustal W進行序列比對后，采用Mega 4.0軟件構建系統發育進化鄰接樹［10］。

1.2.5.2 薄層層析（TLC） 用毛細管吸取活性樣品各約5 μL點樣于GF254硅膠薄層層析板，置層析缸中以二氯甲烷∶甲醇（V/V=20∶1）為展開劑展開后取出晾干，置于254 nm及365 nm的紫外燈下觀察并拍攝圖像，再噴茴香醛-硫酸顯色劑后加熱顯色，用掃描儀記錄圖像。

1.2.6 強活性樣品的高效液相色譜-活性追蹤

1.2.6.1 液相分離與96孔板收集 活性樣品經3 000 r/min、20 min離心后，分別取20 μL進行依利特P230型高效液相色譜分析，色譜柱為4.6×250 mm，5 μm粒徑Hypersil填料的C18柱，流動相為甲醇-水系統（梯度洗脫），流速0.6 mL/min，將96孔板置于檢測器后的流出口，從第3孔起每30 s一孔依次收集流分直至46.5 min（第96孔）。收集完畢后，每孔用甲醇補滿，用多道移液槍移1/2到另一個空96孔板中，一一對應，即一個樣品對應兩個96孔板（分別用于培養兩株大腸桿菌指示菌）做好標記。將96孔板置于超凈臺中，用無菌風吹至近干，再置于潔凈的真空干燥箱中徹底干燥。

1.2.6.2 指示菌孵育與DNA損傷活性追蹤 先將96孔板表面及邊緣用酒精棉擦拭后，揭開蓋子置于超凈臺紫外殺菌20 min。其后在每塊96孔板的A行第1孔加180 μL培養基和20 μL的生理鹽水（空白），第2孔加入180 μL的培養基和20 μL的菌懸液（對照），其余各孔均加入180 μL的培養基和20 μL的菌懸液，小心的水平晃動混勻。每個樣品對應的兩塊96孔板中，一個加AB1157（+）的菌懸液，另一個加AB3027（-）的菌懸液。將96孔板于37℃培養16-18 h后，在各孔中加入25 μL的MTT顯色劑（2 mg/mL），于37℃再培養30 min，拍照，并用酶標儀測540 nm波長下各孔光吸收值（A）。

1.2.6.3 數據處理與作圖 使用Excel軟件，根據公式［抑菌率（IR）= 100%×（A對照-A樣品）/（A對照-A空白）］計算各孔抑菌率，然后計算每個樣品每個時間點（ti）的對兩種指示菌的抑菌率差值，即抑菌率差值=IRti，AB3027（-）-IRti，AB1157（+），作抑菌率差值-時間折線圖，此即樣品的選擇性抗大腸桿菌［AB3029（-）與AB1157（+）］活性色譜圖。通過活性色譜圖與HPLC譜圖的對照，可指認樣品中的活性峰。

2 結果

2.1 篩選模型的驗證

圖1 五種抗菌或抗腫瘤藥物對兩種指示菌的抑菌圈直徑之比

理論上講，如果某藥物對這一對指示菌存在無差別的抑制活性，則抑菌圈直徑比值應等于1。如圖1所示，博萊霉素、絲裂霉素C、阿霉素和5-氟尿嘧啶這4種抗腫瘤藥物對這兩株指示菌［AB3027（-）/AB1157（+）］的抑菌圈直徑比值均大于1，且t值均大于t0.05（2.306），說明其對兩種指示菌抑菌圈的比值與“1”之間都存在顯著差異，其中以博萊霉素（2 μg）、絲裂霉素（5 μg、2 μg）和阿霉素（5 μg、2 μg）最為顯著，其t值均大于甚至遠大于t0.01（3.355）（如絲裂霉素2 μg對應的t值為12.38），說明它們都顯示出了預期的DDRT差異活性（即對缺陷型菌株的抑制強于對野生型的抑制）。而氨芐青霉素在2 μg時t=3.75略大于t0.01，可認為與“1”之間具有顯著差異，但差異不算太大，說明在該劑量下對兩種指示菌活性差別較小；而在5 μg劑量下t=18.09，遠大于t0.01，說明存在較顯著差異，其具體機制有待研究。另外，篩選中也發現紫杉醇對兩種指示菌均無抑制活性（即無抑菌圈）。

2.2 活性物質篩選結果

2.2.1 初篩結果 考慮到樣品數量較多，先用指示菌AB3027（-）進行了初篩，從66株海洋真菌的提取物中發現了48株樣品具有清晰的抑菌圈。在這些活性樣品中有14個樣品抑菌圈直徑大于8 mm，如表1所示。

表1 紙片擴散法初篩中顯示相對較強抑制E. coli AB3027（-）活性的樣品

2.2.2 復篩的結果 為考察這些活性樣品是否具有DNA損傷活性，從上述初篩結果中選取抑菌圈不小于10 mm的11個樣品，進行了同時拮抗兩株指示菌的復篩實驗。結果（表2）表明，有5株真菌的提取物樣品即6-N、6-F、DLEN2008006、15-F和DLEN2008024，表現出明顯的選擇性抑制缺陷型大腸桿菌的活性，可用于進一步的菌種鑒定及提取物成分研究。

表2 同時使用E. coli AB1157（+）和AB3027（-）作為指示菌的紙片擴散法復篩結果

2.3 活性菌株的分子生物學鑒定及TLC指紋圖譜

表3 五個活性菌株的測序和比對結果

通過真菌通用引物PCR擴增了該5株活性真菌的核糖體RNA基因內轉錄間隔區（ITS1-5.8S-ITS2 rDNA）序列，測得的序列用BLAST與GenBank中已知序列進行比對，顯示它們與已知種屬的相似度都達到了99%-100%（表3）；而且，其序列與GenBank中收錄的相同及相近種屬的同源序列一起構建了系統發育樹（圖2），也顯示菌株DLEN2008006、6-F和15-F分別與曲霉屬的Aspergillus clavatus、A. sydowii和A. fumigatus親緣關系較近，菌株6-N和DLEN2008024則分別與糞殼菌綱的Chaetomium globosum 和Glomerella acutata有較近親緣關系。由此確定了這些菌株的種屬，它們都屬于子囊菌門中的盤菌亞門。

圖2 根據ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列構建的5株活性真菌的系統發育鄰接樹

而且，薄層層析（圖3）顯示，在同一培養條件下，這5個菌株的次生代謝產物也有較大的差異，同屬于曲霉屬的6-F、15-F和DLEN2008006的次生代謝指紋差別顯著。

圖3 五種活性樣品的薄層層析圖像（254、365 nm雙波長檢測）

2.4 活性樣品的HPLC-活性跟蹤實驗

通過HPLC-C18柱分離、96孔板收集及隨后對兩種指示菌的抑制活性測試與數據分析，可將各樣品的HPLC譜圖與其選擇性抑制大腸桿菌［AB3027（-）/AB1157（+）］活性色譜圖對應起來。結果（圖4）顯示，該5個樣品的HPLC色譜圖呈現較大的差異，這與分類學及TLC分析結果是一致的；而且這5個樣品中的主要活性色譜峰也各不相同。

菌株6-N提取物中選擇性抑制缺陷型大腸桿菌的活性主要集中在保留時間為8.75 min的顯著色譜峰，其對缺陷型菌株及野生型菌株的抑制率差值達到100%；6-F提取物中選擇性抑制缺陷型大腸桿菌的活性色譜峰的分布比較分散，有多個峰抑菌率差值介于50%-70%之間；DLEN2008006提取物中保留時間6.25 min的顯著色譜峰顯示了最強的選擇活性，其對缺陷型大腸桿菌與野生型菌株的抑制率差值達到100%；15-F提取物中保留時間為4.75 min和41.25 min的色譜峰顯示了相對較強的選擇活性，其抑制率差值均在70%左右；而菌株DLEN2008024提取物中的色譜峰選擇活性相對都比較弱，保留時間為5.25 min的色譜峰達到50%左右的抑菌率差值。

另外，上述樣品中都存在一些色譜峰具有“負”的選擇活性，即對缺陷型菌株及野生型菌株的抑制率差值為負值，特別是菌株6-F（保留時間2.75 min無紫外吸收的活性峰）和DLEN2008024（保留時間41.25 min的色譜峰）中都出現了抑菌率差值為-100%的色譜峰，這些色譜峰對應的物質也可用于非DNA損傷機制抗菌藥物的研究。

圖4 五株活性真菌提取物的HPLC色譜圖（254 nm，A）和選擇性抗大腸桿菌［AB302F（-）/AB1157（+）］活性色譜圖（B）（箭頭標明主要活性色譜峰）

3 討論

從海洋微生物中尋找抗腫瘤、抗菌活性物質是海洋藥物研究的重要課題，而經濟高效的篩選模型在研究工作中至關重要，一些采用特殊的微生物或其他低等生物作指示的方法常被用于對大量發酵粗提物的活性初篩，如大腸桿菌生化誘導分析（BIA）法、海蝦致死法、稻瘟霉法等［11-13］。大腸桿菌差異性DNA 損傷修復試驗法（DDRT）用于篩選基于DNA損傷機制的抗腫瘤抗菌藥物，具有簡單、快速、靈敏和經濟的優點，可發現在不同位點、經各種途徑誘導遺傳損傷的樣品，且能兼顧抗菌與抗腫瘤活性，適合于需要大量微生物發酵粗提物樣品的篩選。大腸桿菌菌株對E. coli 343/591 和E. coli 343/636曾被引入國內用于該方法［14］，本研究則采用了曾用于環境遺傳毒理研究的大腸桿菌菌株對E. coli AB3027（-）（DNA損傷修復基因缺陷型）和E. coli AB1157（+）（具有正常DNA損傷修復功能的野生型）來建立該模型［7］。

在該模型對DNA損傷活性物質的響應能力驗證實驗中，博萊霉素、絲裂霉素C、阿霉素和5-氟尿嘧啶這4種抗腫瘤藥物都顯示出了預期的DDRT差異活性（即對缺陷型菌株的抑制強于對野生型的抑制），這可能與它們的作用機制均針對DNA有關［15-18］；而前人藥理學研究指出紫杉醇作用于微管，與DNA無關［19，20］，本研究也顯示它對這兩株指示菌均無抑制。這些結果表明由這對大腸桿菌菌株組成的DDRT模型確可用于檢測選擇性損傷DNA的物質。當然該模型也存在一定局限性，在具體應用中最好能與腫瘤細胞株等模型結合使用，進行分級篩選，但作為一個經濟的初篩模型仍然具有自身的價值。

使用該篩選模型，本研究發現5株海洋真菌顯示出了較強的DDRT差異活性，很可能具有DNA損傷活性，它們均來自子囊菌門（Chaetomium、Aspergillus和Glomerella屬）。目前已經報道發現的作用機制為損傷DNA的真菌天然產物并不多，檢索表明天然產物詞典（Dictionary of Natural Products on DVD）中收錄的真菌產生的直接或間接損傷DNA活性的化合物僅9例報道，主要來自子囊菌（Paecilomyces、Alternaria、Fusarium和 Oidiodendron屬）和擔子菌（Marasmius、Curvularia和Lactarius屬），化合物類型包括蒽醌或萘醌衍生物、二萜衍生物、生物堿以及含吡喃酮或呋喃酮結構的化合物等［1］。而本研究發現的菌株不同于這些已經報道的種屬，且系統發育分析及TLC、HPLC-活性跟蹤顯示它們具有生物學和化學的多樣性，因此從中發現新的DNA損傷活性物質可能性較大。

值得注意的是，這些菌株中彌散分布、含量較低但仍顯示出中低選擇活性（對兩種指示菌的抑制率差值多數在40%-60%之間）的色譜峰多樣性也很高，這為尋找多樣性的DNA損傷活性物質提供了啟示和深入研究的線索。其中有些活性峰可能是因為含量低，使得差別顯現得還不夠充分，如果加大進樣量，可能會更加凸顯。另外，也不排除其中有些是受到指示菌的生長狀態不均衡、96孔板間移液操作不準確等實驗誤差的影響所造成的假陽性，采取更多的實驗重復可能會排除這種影響。

當然，盡管對DNA損傷修復基因缺陷型大腸桿菌的選擇性抑制表明這些樣品可能作用于大腸桿菌的DNA，但其損傷效應還有待彗星實驗的直觀驗證［21］，其抗腫瘤潛力及對高等動物正常體細胞DNA是否具有損傷作用也有待深入研究。

4 結論

本研究建立了一種基于缺陷型/野生型大腸桿菌菌株對的DNA損傷活性篩選模型，該模型對于絲裂霉素C、阿霉素等抗腫瘤藥物都有較好的響應，可用于抗菌及潛在抗腫瘤活性物質的篩選，因其成本低廉、操作簡單的特點尤其適合海洋微生物等涉及大量粗提物的活性篩選。運用該模型，我們對實驗室保藏的海洋真菌菌株進行了篩選，發現了5株活性海洋真菌，鑒定了其種屬并對其TLC特征及活性成分進行了追蹤分析，研究表明這些菌株具有較好的生物與化學多樣性。

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（責任編輯 李楠）

Screening the Extracts of M arine Fungi for the Activity of Damaging the DNA of Escherichia coli and Researches on Active Strains

Bao Hanyan1Gu Pengjuan1Zhang Yi2Mu Jun3Feng Yan2Zhao Chenyan1
（1.College of Environmental and Chemical Engineering，Dalian Jiaotong University，Dalian116028；2.College of Food Science and Technology of Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory for Processing and Safety of Aquatic Products，Key Laboratory of Further Processing Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang524088；3. College of Marine Science and Technology，Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022）

Screening of antimicrobial and antitumor agents from marine microorganisms is one of the hot spots for the research of marine drugs， and screening models play an important role in the study. The authors set up an Escherichia coli differentiated DNA damage repair test model， which can be used for the screening of antimicrobial and potential antitumor substances. This model was further applied to screen the bioactivities of the extracts of marine symbiotic fungi. As the result， five marine fungal strains’ extracts showed strong selective inhibition to E. coli strains with DNA damage repairing genes-deficiency， i.e， the potential of damaging DNA. The five strains were identified by molecular biological methods. Furthermore， analyses by thin layer chromatography（TLC）and high performance liquid chromatography（HPLC）-bioactivity tracing revealed that these strains produced diverse bioactive substances.

marine microorganisms；Escherichia coli differentiated DNA damage repair test model；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.020

2014-11-06

國家自然科學基金項目（20902009），中國博士后科學基金項目（2011M500051，2012T50258），廣東省“揚帆計劃”引進緊缺拔尖人才項目（201433009），廣東海洋大學引進人才科研啟動項目（E15155），廣東海洋大學創新強校工程項目（GDOU2014030502，GDOU2014050203），廣東海洋大學自然科學研究項目（C14519）

鮑海燕，女，碩士研究生，研究方向：海洋真菌的生物活性，E-mail：baohaiyanbhy@163.com；谷朋娟同為本文第一作者

張翼，男，碩士生導師，研究方向：海洋藥用生物資源的研究與利用；E-mail：hubeizhangyi@163.com