蘇云金芽胞桿菌chiA73基因的克隆、表達和酶活性分析

張圓 周國旺 李海濤 劉榮梅 趙一夔 高繼國

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱　150030）

蘇云金芽胞桿菌chiA73基因的克隆、表達和酶活性分析

張圓 周國旺 李海濤 劉榮梅 趙一夔 高繼國

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱150030）

旨在對蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶基因進行分子鑒定和酶活測定，從產幾丁質酶活力高的Bt DLD171菌株中提取基因組DNA，通過PCR法克隆得到幾丁質酶chiA73 基因（GenBank登錄號為KJ508093）。結果顯示，對chiA73 基因進行表達，獲得大小約74 kD的表達產物。用熒光底物對表達產物進行酶活測定，發現表達產物只能水解熒光底物4-甲基傘形酮幾丁三糖［4-MU-（GlcNAc）3］，而不能水解4-甲基傘形酮幾丁單糖（4-MU-GlcNAc）。結果表明，ChiA73為一種內切幾丁質酶，在pH值為8、溫度為40℃時酶活性最高。

蘇云金芽胞桿菌；幾丁質酶；chiA73；熒光底物；酶活性

在自然界中，除纖維素外，幾丁質是存在最廣泛的有機化合物。幾丁質是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）以β-1，4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物［1］，它可以與蛋白質結合形成多種組織結構，如許多無脊椎動物的外骨骼、大多數真菌和藻類的細胞壁［2］。此外，幾丁質蛋白復合物是圍食膜的重要組成部分，圍食膜是昆蟲防止病原侵入的一道天然屏障［3］。近期研究發現由于幾丁質及其衍生物具有無毒的生物降解性和生物相容性，因此被廣泛應用于食品、制藥和生物技術等行業［4］。

幾丁質酶是細菌、真菌、昆蟲、植物和動物體內普遍合成的一種具有生物催化活性的水解酶類［5］，它能特異地催化水解幾丁質的 β-1，4-糖苷鍵生成 N-乙酰-D-氨基葡萄糖。幾丁質酶的作用十分廣泛，不僅用于甲殼素衍生物的生產，而且用于控制植物病原真菌的代謝，以及增強蘇云金芽胞桿菌的殺蟲活性［6，7］。由細菌產生的幾丁質酶主要分為兩大類：一類為內切幾丁質酶（endochitinase，EC3.2.1.14），此類酶可隨意裂解幾丁質和幾丁質寡聚物并釋放出可溶性低分子量混合物；另一類為外切幾丁質酶（exochitinase），分為兩個亞類：一類為幾丁二糖酶（chitobiosidase，EC3.2.1.29），可從非還原端裂解幾丁質和幾丁質寡聚物，釋放的最終產物主要是二乙酰幾丁二糖［（GlcNAc）2］；另一類為N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetylglucosaminidases，EC3.2.1.30），同幾丁二糖酶一樣可從非還原端裂解幾丁質和幾丁質寡聚物，釋放N-乙酰葡糖胺單體（GlcNAc），它也是唯一可以水解（GlcNAc）2的酶［8-10］。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）因為對多種害蟲具有毒殺作用而一直為人們所關注，目前已有十多個亞種的蘇云金芽胞桿菌被證明能產生幾丁質酶。目前，對Bt幾丁質酶的研究已經從最初的酶的分離純化發展到幾丁質酶基因的克隆表達，從對產幾丁質酶菌株的篩選發展到幾丁質酶的定向改造，但這些過程均與酶活性的檢測緊密相連。目前，大多數報道采用DNS方法測定幾丁質酶活性［11，12］，本研究在完成對蘇云金芽胞桿菌DLD171菌株中幾丁質酶chiA73基因克隆表達的基礎上，采用熒光底物對表達產物進行酶活測定［19］，旨在為幾丁質酶的后期開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 Bt DLD171菌株由本實驗室自己分離得到，表達菌株E. coli Rosetta（DE3）與載體pEB由本實驗室自己保存。

1.1.2 培養基 液體LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL，pH7.0。固體LB培養基：在液體LB培養基中加13 g/L的瓊脂。固體1/2LB培養基：胰蛋白胨5 g、酵母提取物2.5 g、氯化鈉5 g、瓊脂13 g、蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

幾丁質酶誘導固體培養基［13］：（NH4）2SO43 g、K2HPO40.7 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·H2O 0.5 g、膠體幾丁質3 g、酵母粉3 g、瓊脂13 g、蒸餾水 1 000 mL，pH7.2。

幾丁質酶發酵培養基［8］：蛋白胨2 g、酵母提取物 2 g、K2HPO40.7 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·H2O 0.5 g、細粉幾丁質12 g、蒸餾水1 000 mL，pH6.8。

1.2 方法

1.2.1 幾丁質酶產酶菌的篩選 幾丁質酶的篩選通過水解圈法進行，將Bt菌株直接接種在幾丁質誘導固體培養基上，觀察其生長情況和水解圈的有無［14］。

1.2.2 晶體形態觀察 將Bt菌株DLD171在1/2LB培養基上培養48 h后，將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復紅染液染色3 min，清水沖洗，100×油鏡進行鏡檢［15］。

1.2.3 幾丁質酶基因的克隆和測序 Bt DLD171菌株在LB培養基中培養，提取基因組DNA。使用引物上游序列（5'-ATGGCTATGAGGTCTCAAAAATT-3'）和下游序列（5'-CTAGTTTTCGCTAATGACGGC-3'）擴增幾丁質酶基因［16］，引物設計基于chiA HD-73的全長序列［19］。PCR擴增時使用KOD高保真酶，PCR反應程序：94℃ 2 min；98℃ 10 s，52℃ 30 s，68℃ 2 min，30個循環；最后68℃延伸10 min。將擴增產物進行純化并與pEB載體連接，轉化到E. coli Rosetta（DE3）中［17］。提取質粒，送至北京金維智公司進行測序。

1.2.4 基因誘導表達及SDS-PAGE分析 將重組的大腸桿菌菌株進行誘導表達，誘導條件為：IPTG 1 mg/mL，30℃，150 r/min，震蕩培養6 h。將誘導的培養液在4 000 r/min的條件下離心5 min并收集菌體，用預冷的20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）懸浮菌體兩次。最后用2 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）懸浮菌體，并在冰水混合物中超聲波破碎菌體，超聲時工作3 s，間歇3 s，將破碎完全的菌液離心取上清備用［18］。

1.2.5 幾丁質酶活性測定 挑取Bt單菌落于5 mL LB試管中，30℃、220 r/min振蕩培養12 h后，按1%的接種量接種在幾丁質酶發酵培養基中，30℃、220r/min振蕩培養5 d。將培養物在4℃、12 000 r/min條件下離心20 min取上清備用。使用熒光幾丁質低聚糖進行幾丁質酶活性測定，4-甲基傘形酮幾丁三糖［4-MU-（GlcNAc）3］和4-甲基傘形酮幾丁單糖（4-MU-GlcNAc）作為反應底物。使用的酶液為上述表達的幾丁質酶和Bt直接發酵的酶，測定體系為：熒光底物10 μL，幾丁質酶10 μL，磷酸緩沖液（pH7）580 μL，37℃反應1 h后加入600 μL Na2CO3終止反應［20］。使用熒光分光光度計（LS45）對反應產物進行熒光測定，測定時儀器的參數設為激發光340 nm和發射光415 nm，用于測量4-甲基傘型酮（4-methylumbelliferone）發出的熒光。為了量化這種酶，一個酶活力單位定義為在1 h釋放1 μmol的4-methylumbelliferone 所需的酶量［19］。每個實驗一次平行3次，整個實驗重復3次。

1.2.6 pH值和溫度對幾丁質酶活力的影響 用4-MU-（GlcNAc）3作為底物，測定表達的幾丁質酶ChiA73的最適pH，緩沖溶液為pH 4-10的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液。在最適pH時，使用4-MU-（GlcNAc）3作為底物測定ChiA73在溫度為20-80℃時酶活性的大小。每個實驗一次平行3次，整個實驗重復3次。

2 結果

2.1 晶體形態觀察

BtDLD171菌株產生的晶體形態，光學顯微鏡（圖1）下箭頭所示，從左到右依次為菌體、芽胞和晶體。

圖1 Bt DLD171的光學顯微鏡圖片

2.2 幾丁質酶基因chiA73的克隆和序列分析

PCR擴增結果（圖2）所示，將測序結果提交到GenBank，獲得登錄號為KJ508093。并將其命名為chiA73，幾丁質酶chiA73序列全長為2 031 bp，編碼676個氨基酸殘基。chiA73與其他來源于GenBank報道的Bt幾丁質酶基因有94%-99%的相似度。

圖2 chiA73基因擴增結果

2.3 幾丁質酶ChiA73蛋白結構分析

使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Sig nalP/）分析結果（圖3）表明，幾丁質酶ChiA73的切割位點在Ala-34和Asp-35之間，催化區域由Gly-147 到Ser-222共76個氨基酸組成，粘蛋白III型同源區（FN3）由Ile-479到Thr-574共96個氨基酸組成，幾丁質結合域（CBD）由Val-587 到Lys-629共43個氨基酸組。

2.4 chiA73在大腸桿菌中的表達

對chiA73基因進行誘導表達，提取蛋白并進行SDS-PAGE電泳檢測。結果（圖4）顯示，表達產物的大小約74 kD。以空質粒 pEB 轉入 Rosetta（DE3）菌株作為陰性對照，未發現74 kD的蛋白，說明在大腸桿菌中成功表達了幾丁質酶ChiA73。

2.5 原菌發酵液與表達蛋白ChiA73的活性檢測

用兩種熒光幾丁質低聚糖作為底物對幾丁質酶酶活進行測定，結果（表1）顯示，在pH值為7時，原菌發酵液對4-MU-（GlcNAc）3具有較高的水解活性，同時對4-MU-GlcNAc具有一定的水解活性。表達的幾丁質酶ChiA73只對4-MU-（GlcNAc）3具有高的水解活性，對4-MU-GlcNAc沒有水解活性。E. coli DE3自身的蛋白未檢測到水解活性。結果表明原菌發酵液不僅具有內切幾丁質酶活性，還具有N-乙酰氨基葡萄糖酶活性。而表達的幾丁質酶ChiA73只具有內切幾丁質酶活性，說明幾丁質酶ChiA73是一種內切幾丁質酶。

圖3 ChiA73的氨基酸序列

圖4 ChiA73表達蛋白SDS-PAGE電泳

表1 不同底物下幾丁質酶的活性分析/（U·m L-1）

2.6 pH值和溫度對幾丁質酶ChiA73活性的影響

在37℃下，改變酶活測定體系的pH值，結果（圖5-A）顯示，在pH 4-10范圍內，幾丁質酶均具有一定活性，pH為8時酶活性最高。在pH為8時，改變測活體系的反應溫度，結果（圖5-B）顯示，在溫度20-80℃范圍內幾丁質酶均有活性，在40℃時幾丁質酶酶活性最高。

圖5 pH（A）和溫度（B）對內切幾丁質酶活性的影響

3 討論

幾丁質酶酶活的檢測方法有很多種，如DNS試劑檢測法，此方法可快速測定幾丁質酶總酶活，但無法測定單個幾丁質酶的活性，更不能用于鑒定幾丁質酶的種類［12］。而使用熒光幾丁質低聚糖對幾丁質酶酶活進行測定，可以彌補DNS試劑檢測法的不足。最為常用的熒光劑是4-甲基傘形酮，此方法區分3種幾丁質酶的原理為：內切幾丁質酶能水解4-MU-（GlcNAc）3但不能水解4-MU-GlcNAc；只有N-乙酰氨基葡萄糖酶可以水解4-MU-GlcNAc；而幾丁二糖酶只能水解4-MU-（GlcNAc）2生成4-甲基傘形酮［21］。本研究從Bt DLD171菌株中克隆得到幾丁質酶基因ChiA73，并證實ChiA73為一種內切幾丁質酶，這與Barboza-Corona等［19］對ChiA-HD73的鑒定結果一致。

幾丁質酶ChiA73由信號肽、催化區、粘蛋白III型同源區和幾丁質結合區4個結構域組成。蛋白質前體的信號肽斷裂位點在Ala-34和Asp-35之間，符合革蘭氏陽性細菌的斷裂位點，革蘭氏陰性菌的斷裂位點在Leu-33和Ala-34之間。 成熟的ChiA73蛋白質在N端存在一個催化區，與糖基水解酶18家族的催化區有較高的同源性，其中Asp-207、Asp-209和Glu-211高度保守，與幾丁質酶的活性相關。催化區之后是粘蛋白III型同源區，該結構域對幾丁質酶與幾丁質的結合作用無影響，卻與膠狀幾丁質降解程度有關。除幾丁質酶外，纖維素酶、α-淀粉酶、PHB解聚酶等也存在粘蛋白III型同源區域［22］。ChiA73蛋白質C端幾丁質結合區中的Trp-591、Tyr-595和Trp-626也是高度保守的，該結構域能特異結合不可溶幾丁質（如膠狀幾丁質或再生幾丁質）及晶體幾丁質。

大多數幾丁質酶在偏酸的環境下酶活最高，而對ChiA73理化性質研究表明其最適pH值為8。研究表明，Bt幾丁質酶可協同Bt產生的晶體蛋白進行殺蟲［23］，Bt在害蟲體內的作用位點是昆蟲中腸，而中腸液偏堿性，堿性條件下ChiA73具有較高的活性為其殺蟲增效作用提供了條件。此外，Bt幾丁質酶還可以抑制真菌的生長，本研究為Bt幾丁質酶在生物防治及農業生產上的應用提供了參考。

4 結論

本研究從Bt DLD171菌株中克隆得到幾丁質酶chiA73基因，基因序列全長為2 031 bp，編碼676個氨基酸殘基，分子量約為74 kD，GenBank登錄號為KJ508093。將該基因在大腸桿菌 Rosetta（DE3）中表達，表達的ChiA73蛋白只具有內切幾丁質酶活性，且最適pH為8、最適溫度為40℃。結果表明，熒光劑4-甲基傘形酮幾丁質低聚糖法是一種行之有效的幾丁質酶酶活檢測法，并且可以用于鑒定幾丁質酶的種類。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning，Expression and Enzymatic Activities of chiA73 Gene from Bacillus thuringiensis

Zhang Yuan Zhou Guowang Li Haitao Liu Rongmei Zhao Yikui Gao Jiguo
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin150030）

In order to identify and detect chitinase activities from Bacillus thuringiensis strains， chitinase gene chiA73（GenBank accession number：KJ508093）from genomic DNA of Bt DLD171 producing high-yield chitinase was cloned by PCR. Gene of chitinase chiA73 was expressed and the weight of expression product was approximate 74 kD. The results measured by fluorogenic substrates showed that the expression product of chiA73 hydrolyzed 4-MU-（GlcNAc）3only， but not 4-MU-GlcNAc. In conclusion， the work indicated that ChiA73 was one of endochitinase， and had the highest activity at pH8 and 40℃.

Bacillus thuringiensis；chitinase；chiA73；fluorogenic substrates；enzymatic activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.021

2014-12-08

轉基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX0800913B-002），國家基礎科學人才培養基金資助項目（J1210069），國家高技術研究發展計劃課題（2011AA10A203），國家自然科學基金項目（31401812），黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12521021）

張圓，女，碩士，研究方向：生物防治微生物功能基因的發掘、研究和利用，E-mail：13009835138@126.com；周國旺為并列第一作者

高繼國，男，博士生導師，研究方向：生物大分子的分離純化，蘇云金芽胞桿菌抗性機理、生物安全性；E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com