蘇云金芽胞桿菌LTS290菌株抑制鐮孢菌的作用

周國旺 李玉紅 張圓 李海濤 劉榮梅 高繼國

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱　150030）

蘇云金芽胞桿菌LTS290菌株抑制鐮孢菌的作用

周國旺 李玉紅 張圓 李海濤 劉榮梅 高繼國

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱150030）

旨在擴大蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的生防范圍，通過對BtLTS290菌株的對峙培養和菌株無菌發酵液對鐮孢菌的抑制作用進行研究。結果表明，BtLTS290菌株可抑制6種馬鈴薯致病鐮孢菌的生長，并且BtLTS290無菌發酵液的抑菌效果顯著。抑菌物質對溫度不敏感，經過121℃處理 20 min后仍然具有抑菌活性。在pH3-11范圍內存放12 h 后，抑菌活性變幅不大，并且用蛋白酶K處理后其抑菌活性依然存在。實驗證明蘇云金芽胞桿菌BtLTS290是一株可以高效抑制馬鈴薯致病鐮孢菌的生防菌株。

蘇云金芽胞桿菌；馬鈴薯干腐病；鐮孢菌；抑菌活性；生防菌株

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種能產生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs）的革蘭氏陽性細菌［1，2］，ICPs主要由cry基因和cyt基因編碼，并具有廣譜的殺蟲活性［3］，且一種晶體蛋白可以對一種或多種害蟲具有殺蟲活性［4］。Bt殺蟲劑有毒力高、對人畜與天敵安全、不污染環境等優點［5，6］。目前，全世界幾十個國家已廣泛使用Bt 制劑，用于農業害蟲的生物防治［7］。

長期以來由真菌引起的植物病害十分普遍且日趨嚴重，給農業生產帶來巨大的損失。其中由鐮孢菌屬（Fusarium）真菌引起的馬鈴薯干腐病尤為常見，已嚴重影響馬鈴薯的生產。馬鈴薯干腐病是馬鈴薯儲藏期的主要病害之一［8］，據報道，每年因馬鈴薯鐮孢菌干腐病導致的產量損失可達6%-25%，窖貯損失率高達60%，該病害已成為馬鈴薯產業進一步發展的瓶頸問題［9］。為了拓展Bt在生防領域的應用范圍，國內外早已開始對Bt抑制Fusarium進行研究。2008年韓苗苗等［10］發現Bt519-1菌株對禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）和尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）具有抑制作用。2013年Akram等［11］發現Bt199菌株可以誘導多種方式抵御尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）。2014年Rocha等［12］證明蘇云金芽胞桿菌庫斯塔克亞種（B. thuringiensis subsp. kurstaki）菌株對輪狀鐮孢菌（Fusarium verticillioides）具有很好的抑制作用。

針對大多數蘇云金芽胞桿菌對真菌抑制作用不高的弱勢，本實驗室經篩選獲得一株可以高效抑制鐮孢菌的菌株BtLTS290，本研究首次對該菌株在抑制鐮孢菌生長及抑菌物質理化性質等方面進行測試分析，旨在為Bt在抑制鐮孢菌作用上的進一步研究及應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 蘇云金芽胞桿菌BtLTS290菌株，由本實驗室分離自從吉林采集的土壤樣品。供試病原真菌：從黑龍江各地區分離的馬鈴薯干腐病的6種致病菌，腐皮鐮孢菌［Fusarium solani（Mart.）］、擬絲孢鐮孢菌（Fusarium trichothecioides Wollenw）、燕麥鐮孢菌［Fusarium avenaceum（Corda & Fr.）Sacc］、接骨木鐮孢菌（Fusarium sambucinum Fuckel）、茄病鐮孢菌（Fusarium solani）和擬枝孢鐮孢菌（Fusarium sporotrioides Sherb），由東北農業大學生命科學學院植物教研室李鳳蘭老師饋贈。

1.1.2 培養基 液體LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 L，pH7.0。

固體LB培養基：在液體LB培養基中加13 g/L的瓊脂。固體1/2LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂13 g、蒸餾水1 L，pH7.0。

PDA 培養基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L，pH7.0。發酵培養基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 BtLTS290菌株晶體形態觀察 方法及具體步驟參照文獻［13］。

1.2.2 菌落對峙法測定抑真菌生物活性 在內徑9 cm的PDA培養皿距中心2.5 cm的4個對稱點接種活化的Bt菌株，培養24 h后，分別在培養皿中央接種直徑8 mm的馬鈴薯干腐病菌菌餅，重復3次，于25℃恒溫培養箱中培養3-4 d 后，觀察并測量抑菌效果，計算R值，即抑菌圈直徑與菌落直徑之比。同時用解剖針分別挑取正常生長的真菌菌絲和被抑制的真菌菌絲于載玻片上，載玻片上預先滴一滴無菌蒸餾水，然后輕輕蓋好蓋玻片，盡量控制氣泡產生，把制好的玻璃片放在高倍顯微鏡下觀察。

1.2.3 Bt菌株無菌發酵液的制備 將凍存管中儲存的BtLTS290在LB平板上劃線活化［14］，30℃培養12 h后，挑取單菌落接入裝有5 mL LB液體培養基的試管中，30℃、180 r/min下培養12 h。取1 mL活化菌液接入裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，30℃、180 r/min條件下振蕩培養3 d。同時取1 mL液體LB培養基接入裝有100 mL 發酵培養基的500 mL三角瓶中作為對照，30℃、180 r/min條件下振蕩培養3 d。之后，將發酵菌液在4℃、8 000 r/min下離心20 min，收集上清液經細菌濾器（濾膜孔徑0.25 μm）過濾除菌，即得到無菌發酵液，4℃保存備用。

1.2.4 Bt菌株無菌發酵液抑菌活性的測定 采用菌絲生長速率法［15］，以供試的6種馬鈴薯干腐病致病菌為檢測菌，測定Bt 菌株發酵液中活性代謝產物的抑菌活性。將BtLTS290菌株的無菌發酵液1 mL與9 mL冷卻到45℃左右的PDA培養液混勻，倒入無菌的培養皿中制成培養基平板。待凝固后將供試病原真菌菌餅（8 mm）倒置放在平板中央，每處理3次重復，以9 mL PDA 培養液和1 mL未接菌的發酵培養基作為對照。將上述處理在25℃下培養4 d后，用十字交叉法測量供試菌菌落生長直徑（mm），計算菌絲生長抑制率。計算公式：菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理后菌落直徑）/（對照菌落直徑- 8 mm）×100%。

1.2.5 Bt菌株抑菌活性物質產生時間及穩定性測定

1.2.5.1 Bt菌發酵時間 分別設1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 d，共9個采樣點，測定不同發酵時間發酵液的抑菌活性。

1.2.5.2 熱穩定性 取無菌發酵液分裝離心管中，分別置于水浴40℃、60℃、80℃、100℃、121℃加熱20 min，待自然冷卻后，測定各處理液的抑菌活性。

1.2.5.3 pH 穩定性 取無菌發酵液50 mL，分別用1 mol/L的HCl 和1 mol/L 的NaOH 處理將其pH 值分別調至3、5、7、9、10和11，并于4℃冰箱中過夜，然后調回原pH約7.0左右，測定各處理液的抑菌活性。

1.2.5.4 抗蛋白酶K穩定性 取離心管3 支，編號為1、2、3，1號和2號管中各裝入無菌發酵液10 mL，3號管中加入未接菌的發酵液10 mL，1號和3號管中分別加入蛋白酶K溶液（20 mg/mL）50 μL，充分混勻后，置于37℃下1 h，然后分別測定各處理液的抑菌活性。以上實驗均重復3次，以燕麥鐮孢菌作為指示菌，以未接菌的發酵液作對照，采用菌絲生長速率法測定各處理液的抑菌活性。

2 結果

2.1 晶體形態觀察

Bt菌株LTS290產生的晶體形態，光學顯微鏡（圖1-A）下箭頭所示，從左到右依次為球形晶體和芽胞；電鏡（圖1-B）中箭頭所指，從左到右依次為球形晶體和芽胞。

圖1 Bt野生菌株LTS290的光學顯微鏡圖（A）和電鏡晶體圖（B）

2.2 菌落對峙法測定抑真菌生物活性

Bt LTS290菌株對6種鐮孢菌都有抑制作用，僅以經燕麥鐮孢菌為例，如圖2-A所示，計算BtLTS290菌株對燕麥鐮孢菌的抑制率R值，約為0.3。通過對燕麥鐮孢菌菌絲顯微結構進行觀察，結果（圖2-B，C）顯示，正常生長的菌絲長，且呈直線型生長，而被抑制的菌絲短，并且變得彎曲，菌絲被抑制效果顯著。

2.3 Bt菌株無菌發酵液抑菌活性的測定

Bt LTS290無菌發酵液對6種鐮刀菌菌絲的生長抑制如圖3所示，通過計算，結果表明Bt LTS290無菌發酵液對燕麥鐮孢菌和接骨木鐮孢菌菌絲生長抑制率分別為91.38%和91.76%，而對其他供試鐮孢菌的菌絲生長抑制率在73%-87%之間。

圖2 BtLTS290菌株對黃色鐮刀菌的抑制作用

2.4 抑菌時間及穩定性分析

2.4.1 發酵液中抑菌活性代謝產物產生時間 圖4表明，菌株Bt LTS290發酵1 d時未產生抑菌物質，在發酵3 d時抑菌物質積累最多，對燕麥鐮刀菌菌絲生長抑制率最高，發酵時間3-4 d內對燕麥鐮刀菌菌絲生長抑制率未見明顯變化，但4.5 d后發酵液的抑菌活性開始下降。

2.4.2 熱穩定性 對菌株Bt LTS290無菌發酵液的熱耐受性實驗結果表明，當發酵液的處理溫度為40-100℃時處理20 min時，發酵液上清仍然具有抑菌活性，并且抑菌活性基本不變，仍維持在90%左右。經過121℃處理20 min后仍然具有抑菌活性，但抑菌活性明顯降低。

圖3 Bt LTS290無菌發酵液對馬鈴薯干腐病6種致病鐮孢菌的抑菌作用

圖4 BtLTS290不同發酵時間對燕麥鐮刀菌的抑菌活性

2.4.3 pH穩定性 Bt LTS290無菌發酵液經不同pH處理后，其穩定性結果（圖5）表明，BtLTS290發酵液在pH3-11范圍內均有抑菌活性，并且變化幅度不大，pH為7時抑菌活性最高。

圖5 Bt LTS290產抑菌物質在不同pH值下的穩定性

2.4.4 抗蛋白酶K的穩定性 1號和2號處理的無菌發酵液對燕麥鐮孢菌都具有抑菌活性，并且測定數值非常接近。而3號未接菌的發酵液對燕麥鐮孢菌沒有抑制作用，說明BtLTS290菌株發酵液中的活性代謝產物對蛋白酶K具有較強的穩定性。

3 討論

蘇云金芽胞桿菌作為一種重要的生防細菌，主要用于農業蟲害的防治。但隨著農業和環境可持續發展的需要，篩選出多功能 Bt 菌株變得尤為重要。

關于蘇云金芽胞桿菌抑真菌的報道非常多，但對于其抑真菌機制尚無明確報道［16］。本研究證明BtLTS290菌株對馬鈴薯干腐病鐮孢菌具有一定的抑制作用，由于PDA培養基以及培養的溫度不利于BtLTS290的生長，抑菌圈不是十分明顯，但通過顯微鏡可以明顯觀察到鐮孢菌菌絲的生長被嚴重抑制。由于未進行更微觀的顯微結構觀察，如孢子的萌發是否被抑制，因此有必要參照一些文獻［10，11］，對孢子的萌發程度進行檢測。但BtLTS290的無菌發酵液對鐮孢菌菌絲的抑制率明顯，說明無菌發酵液中的抑菌物質對鐮孢菌有很強的抑制作用。已報道的芽胞桿菌抑菌物質種類很多，有細菌素、脂肽、小分子蛋白及幾丁質酶等。目前關于幾丁質酶的報道較多，幾丁質酶不但對真菌的生長有抑制作用，而且可以協同Cry毒素進行殺蟲［17-19］。而對于BtLTS290無菌發酵液中的抑菌物質是什么，我們并不十分清楚，但可以肯定的是此物質具有良好的熱穩定性和pH穩定性。因此，對于抑菌作用來源于何種物質仍需進一步深入研究。除此之外，對于BtLTS290菌株中何種cry基因編碼了晶體蛋白，可參考一些新基因的克隆方法進行鑒定［20，21］。

4 結論

由本實驗室分離得到的野生菌株BtLTS290對馬鈴薯干腐病致病鐮孢菌具有較好的抑制作用，尤其對菌絲生長的抑制作用明顯。以腐皮鐮孢菌、擬絲孢鐮孢菌、燕麥鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、茄病鐮孢菌和擬枝孢鐮孢菌作為指示菌，測得BtLTS290菌株的無菌發酵液對這6種馬鈴薯干腐病致病鐮孢菌的菌絲生長抑制率均在73%-91%之間。對菌株BtLTS290所產的抑菌活性物質的理化性質進行研究發現，其抑菌活性物質對溫度不敏感，在pH3-11內抑菌活性變化不大，并且對蛋白酶K不敏感，說明抑菌活性物質具有良好的穩定性。

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（責任編輯 馬鑫）

A Study of Bacillus thuringiensis Strain LTS290 Inhibiting Fusarium

Zhou Guowang Li Yuhong Zhang Yuan Li Haitao Liu Rongmei Gao Jiguo
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin150030）

In oder to expand the biocontrol scope of Bacillus thuringiensis（Bt）， the inhibiting effects of confront culture and sterile fermented liquid of strain BtLTS290 on the growth of Fusarium were investigated. Results showed that BtLTS290 inhibited the growth of 6 strains of Fusarium， and the sterile fermented liquid of Bt had solid antibacterial effect. The fungistatic substances were not sensitive to temperature， and it still had the bacteriostatic activity for 20 min under 121℃. After storing 12 h while pH varied from 3 to 11， the range of antibacterial activity was not significantly changed. The bacteriostatic activity still existed after being treated with proteinase K. Conclusively， the work convinced that the BtLTS290 was a biocontrol strain that had efficient antagonistic activity against Fusarium of causing dry rot of potato.

Bacillus thuringiensis；dry rot of potato；Fusarium；bacteriostatic activity；biocontrol strain

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.022

2014-12-15

轉基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX0800913B-002），國家基礎科學人才培養基金資助項目（J1210069），國家高技術研究發展計劃課題（2011AA10A203），國家自然科學基金項目（31401812），黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12521021）

周國旺，男，碩士，研究方向：生物防治微生物功能基因的發掘、研究和利用；E-mail：1449717662@163.com

高繼國，男，博士生導師，研究方向：生物大分子的分離純化，蘇云金芽胞桿菌抗性機理、生物安全性；E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com