黃芩醇提物對(duì)副溶血性弧菌抑制機(jī)制的研究

謝麗玲 彭齊 蔡鏈純 周亮 朱炎坤 韓光耀

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，汕頭　515063）

黃芩醇提物對(duì)副溶血性弧菌抑制機(jī)制的研究

謝麗玲 彭齊 蔡鏈純 周亮 朱炎坤 韓光耀

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，汕頭515063）

從4種常見(jiàn)中藥中篩選出對(duì)副溶血性弧菌有較好抑制作用的中藥，并對(duì)其抑制機(jī)制進(jìn)行研究。采用牛津杯法及液體倍比稀釋法研究了中藥醇提取物對(duì)副溶血性弧菌的敏感性；通過(guò)生長(zhǎng)曲線(xiàn)和殺菌曲線(xiàn)、電鏡觀察以及SDS-PAGE等方法探討黃芩醇提物的抑菌作用及機(jī)理。結(jié)果顯示，4種中藥醇提物對(duì)副溶血性弧菌表現(xiàn)出不同的抑菌活性，其中黃芩醇提物對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈為22.00±1.00 mm，MIC和MBC均為3.91 mg/mL。經(jīng)MIC濃度處理后，細(xì)菌經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)一段時(shí)間的延遲期，也能進(jìn)入正常的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期；菌體表面變粗糙，出現(xiàn)裂解，菌液的蛋白含量明顯升高，但是菌體的可溶性蛋白變化較小。結(jié)果表明，黃芩醇提物對(duì)副溶血性弧菌有很強(qiáng)的抑制效果，其作用是破壞細(xì)胞膜的完整性導(dǎo)致菌體裂解死亡。

黃芩；副溶血性弧菌；醇提物；抑菌機(jī)理

副溶血性弧菌為革蘭氏陰性嗜鹽菌，自然環(huán)境中主要存在于河口和沿海中，與水產(chǎn)品污染密切相關(guān)，常引起大量魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)的感染，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)常能從生的海鮮品中分離到［1，2］。食用被其污染的食物可造成急性腸胃炎，表現(xiàn)特征是腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、腹痛和低燒，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起急性敗血癥。副溶血性弧菌引起的腸胃炎主要發(fā)生在每年4-10月份，在2003-2008年中，該菌引起的腸胃炎的爆發(fā)有322起，導(dǎo)致9 041人患病，3 948人住院治療，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示副溶血性弧菌在亞洲、南美、美國(guó)等地，是引起食物性感染的主要原因。在中國(guó)，該菌已經(jīng)成為引起食物中毒的首要病原菌，尤其是在一些沿海城市，其比例超過(guò)60%［3-6］。副溶血性弧菌引起的食物性感染已成為一個(gè)不容忽視的問(wèn)題！為了控制和防止它在水產(chǎn)品飼養(yǎng)中的污染，主要措施是使用消毒劑和抗生素，但這存在明顯的弊端，即：細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生、抗生素藥物的殘留、對(duì)水生動(dòng)物體內(nèi)微平衡以及免疫力的破壞，因此尋找其他綠色有效抑菌物質(zhì)越來(lái)越引起人們關(guān)注。

黃芩是常用的多年生藥用植物，根部是天然無(wú)毒產(chǎn)品，含有30多種黃酮類(lèi)物質(zhì)，活性物質(zhì)主要是黃芩苷、漢黃芩素、木蝴蝶素A，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。它們具有多種藥理作用，例如抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等［7-10］。雖然關(guān)于黃芩提取物的抑菌活性研究有較多報(bào)道，但是應(yīng)用于致病性副溶血性弧菌的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)黃芩對(duì)致病性副溶血性弧菌的抑菌活性及機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為開(kāi)發(fā)低毒高效、用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色抗菌藥物及尋找新的藥物靶點(diǎn)提供參考。

圖1 黃芩有效成分的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株為副溶血性弧菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 中藥粗提物 稱(chēng)取黃芩、黃連、大黃、金銀花各5.00 g，用50 mL 70%乙醇80℃提取兩次，每次1 h。合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至濃度為0.5 g/mL，過(guò)濾（0.2 μm）除菌后置于4℃冰箱保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：1% NaCl，1% peptone，0.5% yeast extract。

1.1.4 主要試劑和儀器 丙烯酰胺（Acrylamide），甲叉雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide），三羥甲基氨基甲烷（Tris），十二烷基硫酸鈉（SDS），考馬斯亮藍(lán)R-250/G250（Coomassie brilliant blue R-250/G250）等試劑購(gòu)于上海Sangon生物工程有限公司；無(wú)水乙醇、甲醇、冰乙酸、濃鹽酸等試劑購(gòu)于汕頭西隴化工有限公司；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV-2102C紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海優(yōu)尼柯儀器有限公司）；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)儀器廠）； JSM-6360LA掃描電鏡。

1.2 方法

1.2.1 中藥醇提取物對(duì)副溶血性弧菌敏感性實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 牛津杯法 取100 μL稀釋至107CFU/mL的菌液，均勻涂布平板，將中藥粗提液200 μL加入到牛津杯中，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，20 μg/mL卡那霉素為陽(yáng)性對(duì)照。先在4℃冰箱中放置4 h待藥液擴(kuò)散一段時(shí)間，然后再移至37℃培養(yǎng)16 h后觀察，測(cè)定抑菌圈大小。

1.2.1.2 液體倍比稀釋法 采用二倍倍比稀釋法測(cè)定中藥粗提液的最低抑菌濃度（MIC），以不加粗提液為陰性對(duì)照，不渾濁的最低藥物濃度為MIC值。

1.2.1.3 平皿法測(cè)定最低殺菌濃度（MBC） 根據(jù)MIC的觀察結(jié)果，將培養(yǎng)液劃線(xiàn)于LB培養(yǎng)基上。平皿內(nèi)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度為MBC值。

1.2.2 抑菌機(jī)制的分析

1.2.2.1 副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制 將100 μL已培養(yǎng)12 h的副溶血性弧菌加入到含1/2MIC和MIC粗提液的100 mL LB培養(yǎng)基中，以不加粗提液為陰性對(duì)照。37℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)OD，連續(xù)測(cè)量16 h，繪制出藥物組和對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（λ= 600 nm）。

隨著互聯(lián)網(wǎng)、物聯(lián)網(wǎng)、大數(shù)據(jù)、云計(jì)算、人工智能等新科技的快速發(fā)展和充分運(yùn)用，教育現(xiàn)代化、信息化的發(fā)展“永遠(yuǎn)在路上”。教師作為直接參與教學(xué)、踐行教學(xué)，面對(duì)學(xué)生、面對(duì)家長(zhǎng)的教育戰(zhàn)線(xiàn)一線(xiàn)工作者，只有加強(qiáng)自身學(xué)習(xí)不斷提升教學(xué)業(yè)務(wù)能力，才能適應(yīng)新時(shí)代新科技的新發(fā)展，適應(yīng)教育工作改革創(chuàng)新的新形勢(shì)，滿(mǎn)足學(xué)生、家長(zhǎng)和社會(huì)對(duì)教師的新期待。因此，教師不僅要兢兢業(yè)業(yè)、勤勤懇懇地教好書(shū)、育好人，還要積極學(xué)習(xí)掌握教育領(lǐng)域的新科技、新手段和新方式，要善于思考、善于學(xué)習(xí)，“走出去、引進(jìn)來(lái)”，不斷豐富完善教學(xué)模式，不斷提高教學(xué)水平和教學(xué)質(zhì)量。

1.2.2.2 殺菌曲線(xiàn)的繪制［11］在4 mL培養(yǎng)液中加入粗提液，使終濃度為MIC和2MIC，以不加粗提液為陰性對(duì)照。每管中加入稀釋后的副溶血性弧菌使其濃度為105-106CFU/mL。37℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h取100 μL菌液采用平板計(jì)數(shù)（T=0、2、4、6和8 h）。然后平板在37℃下培養(yǎng)16 h，記錄菌落形成數(shù)量。最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，每毫升菌落形成單位的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖繪制殺菌曲線(xiàn)。

1.2.2.3 掃描電鏡觀察［12］將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的副溶血性弧菌按2%接種量，接種到含MIC粗提液的培養(yǎng)液中，以不加粗提液為陰性對(duì)照。37℃搖床培養(yǎng)，6 h后取樣，離心去上清，2.5%的戊二醛4℃固定過(guò)夜后用0.2 mol/L的PBS（pH7.4）洗3次，然后依次用30%、50%、70%、85%、90%和100%乙醇脫水一次，每次15 min，最后涂片、干燥、噴金，在掃描電鏡JSM-6360LA下觀察。

1.2.2.4 對(duì)細(xì)胞膜的作用［13］用Bradford法測(cè)蛋白濃度，首先分別加0、20、40、60、80和100 mL 1 mg/mL的牛血清蛋白到5 mL的Bradford中，室溫顯色5 min，于721分光光度計(jì)下，595 nm作比色測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的副溶血性弧菌按2%接種到含MIC粗提液的培養(yǎng)液中，以不加藥液為陰性對(duì)照。37℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h（T=0、2、4和8 h）取樣，離心，收集上清，測(cè)蛋白濃度，每組測(cè)定3次。

1.2.2.5 SDS-PAGE和細(xì)胞可溶性蛋白含量的測(cè)定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的副溶血性弧菌按2%接種到含MIC粗提液的培養(yǎng)液中，以不加藥液為陰性照組。37℃搖床培養(yǎng)，收集2、4、6和8 h菌體（0.05 g濕重）超聲破碎提取蛋白。選用5%濃縮膠，10%分離膠，染色液用0.5%考馬斯亮藍(lán) R-250，上樣40 μL進(jìn)行電泳。Bradford法測(cè)定可溶性蛋白濃度，每組測(cè)定3次。

2 結(jié)果

2.1 黃芩等醇提取物對(duì)副溶血性弧菌的抑制活性及MIC和MBC

牛津杯法測(cè)定結(jié)果（表1和圖2）顯示，不同中藥醇提物對(duì)副溶血性弧菌的抑制活性有很明顯的差異，其中黃芩的效果最好，金銀花的效果最差，抑菌圈直徑分別是22.00±1.00 mm和15.00 mm，雖然都小于卡那霉素形成的抑菌圈（24.00±2.64 mm），但是黃芩形成抑菌圈的大小與其相差較小，而陰性對(duì)照組則無(wú)抑菌圈的形成。最低抑菌濃度（MIC）是評(píng)價(jià)抗菌藥物抑菌活性的指標(biāo)，指在體外用培養(yǎng)基培養(yǎng)16-24 h后，能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。最低殺菌濃度（MBC）則是指將細(xì)菌殺死的最低藥物濃度。MIC和MBC的結(jié)果（表2）也進(jìn)一步顯示，不同中藥粗提液對(duì)副溶血性弧菌的抑制活性存在很大差異。其中黃芩對(duì)副溶血性弧菌有十分明顯的抑制效果，MIC和MBC均為3.91 mg/mL。而其他中藥的效果較差，MIC為15.64 mg/mL。基于上述結(jié)果，在隨后的機(jī)制研究中，以黃芩為研究對(duì)象。

表1 不同中藥醇提物對(duì)副溶血性弧菌抑菌圈的大小

圖2 不同中藥對(duì)副溶血性弧菌的抑菌圈

表2 不同中藥醇提物對(duì)副溶血性弧菌的M IC和MBC

2.2 黃芩醇提物對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果（圖3）顯示，對(duì)照組的細(xì)菌生長(zhǎng)具有典型的生長(zhǎng)特征，呈S型生長(zhǎng)曲線(xiàn)。當(dāng)菌液中添加1/2MIC藥物時(shí)，細(xì)菌的活性被部分抑制，細(xì)菌的延遲期長(zhǎng)達(dá)8 h，但是之后細(xì)菌也可以進(jìn)入正常的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，而且菌的終濃度與對(duì)照差距較小。當(dāng)藥物濃度是MIC時(shí)，細(xì)菌菌液的OD值處于一個(gè)平穩(wěn)狀態(tài)，基本沒(méi)有變化。這說(shuō)明在MIC溶度下黃芩醇提物將細(xì)菌完全抑制或殺滅，因此細(xì)菌不能生長(zhǎng)。

圖3 加入不同溶度黃芩后副溶血性弧菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.3 殺菌曲線(xiàn)的繪制

黃芩醇提物的殺菌效率通過(guò)殺菌曲線(xiàn)來(lái)評(píng)價(jià)。殺菌曲線(xiàn)結(jié)果（圖4）顯示，黃芩的抑菌活性與藥物濃度存在依賴(lài)性。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組的菌數(shù)穩(wěn)定增加。而當(dāng)藥液為MIC和2MIC時(shí)，菌的數(shù)量逐漸減少，并且當(dāng)藥液為MIC時(shí)，需要8 h才能將菌全部殺死，當(dāng)藥液為2MIC時(shí)，第6 h菌已經(jīng)被完全殺死。

圖4 黃芩對(duì)副溶血性弧菌的殺菌曲線(xiàn)

2.4 掃描電鏡觀察

掃描電鏡可以用來(lái)觀察微生物細(xì)胞在面對(duì)外界壓力時(shí)的形態(tài)變化，對(duì)照組的菌體（圖5-A）為長(zhǎng)桿狀，表面光滑，形態(tài)飽滿(mǎn)，沒(méi)有細(xì)胞破損情況。而用藥組中，有部分菌體（圖5-B）發(fā)生明顯變化，表面粗糙，扭曲變形，并且開(kāi)始裂解。

圖5 副溶血性弧菌培養(yǎng)6 h后電鏡觀察結(jié)果

2.5 對(duì)細(xì)胞膜的作用

黃芩醇提物對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜的作用通過(guò)測(cè)定上清液蛋白含量來(lái)評(píng)價(jià)，結(jié)果（圖6）顯示，經(jīng)黃芩處理后，培養(yǎng)液中的蛋白含量隨著時(shí)間的增加而升高，在第8 h時(shí)的蛋白含量約為初始時(shí)的兩倍。而對(duì)照組培養(yǎng)液的蛋白含量雖然出現(xiàn)不規(guī)律的變化，但是一直在較低的水平內(nèi)變化。說(shuō)明經(jīng)黃芩處理后，菌體的細(xì)胞膜受到破壞，蛋白質(zhì)釋放，導(dǎo)致培養(yǎng)液中蛋白含量升高。

圖6 副溶血性弧菌經(jīng)黃芩處理后蛋白釋放情況

2.6 對(duì)細(xì)菌蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)SDS-PAGE來(lái)確定黃芩對(duì)副溶血性弧菌的可溶性蛋白的影響，結(jié)果（圖7）顯示，經(jīng)黃芩作用后，與對(duì)照組相比，加藥組的副溶血性弧菌蛋白表達(dá)在2、4、6和8 h中基本不受影響，沒(méi)有條帶的明顯缺失或顏色變淺。經(jīng)Bradford法測(cè)其蛋白濃度，結(jié)果（圖8）顯示，在2、4、6和8 h時(shí)，加藥組的總蛋白含量也無(wú)明顯變化（P＞0.05），說(shuō)明黃芩對(duì)副溶血性弧菌的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響。

圖7 副溶血性弧菌經(jīng)黃芩處理后蛋白變化情況

圖8 副溶血性弧菌經(jīng)黃芩處理后可溶性蛋白含量變化情況

3 討論

近年來(lái)抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的濫用，使得藥物殘留以及細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，尋找綠色藥物來(lái)代替抗生素引起人們的關(guān)注。具有抗菌消炎作用的中草藥在我國(guó)已經(jīng)有幾千年的歷史，由于它們的低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)受到人們的青睞。本研究希望從已證實(shí)的有較好抑菌活性的黃芩、大黃、黃連、金銀花中篩選出對(duì)副溶血性弧菌有較強(qiáng)抑制作用的中藥［14-17］。抑菌圈結(jié)果顯示，4種中藥對(duì)副溶血性弧菌的抑制活性有很大的差異，并且MIC和MBC也與抑菌圈的關(guān)系一致，即抑菌圈直徑越大MIC和MBC越小。黃芩對(duì)副溶血性弧菌的抑菌效果最為顯著，這與Rashed等［18］和Duan等［11］的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)黃芩對(duì)G-和G+都具有很好的抑菌效果。其他3種中藥對(duì)副溶血性弧菌的抑制效果較差，可能是它們有效成分對(duì)副溶血性弧菌沒(méi)有明顯的抑制活性或者由于提取方法不當(dāng)，導(dǎo)致抑菌活性不高。如在張銳利［19］和時(shí)維靜［20］的研究中，也發(fā)現(xiàn)通過(guò)不同提取方法所得到提取物的抑菌效果相差很大。

菌液的OD600值能夠衡量細(xì)菌的數(shù)量，因此OD600的變化可以反映黃芩醇提物對(duì)副溶血性弧菌的抑制和殺滅作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩抑制副溶血性弧菌主要是延長(zhǎng)細(xì)菌的延遲期，而在一段時(shí)間之后細(xì)菌依然能夠進(jìn)入正常的穩(wěn)定期，而且數(shù)量也與對(duì)照組一致。楊艾青［21］在研究黃芩對(duì)沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)時(shí)也發(fā)現(xiàn)延遲期被延長(zhǎng)的結(jié)果，但最后達(dá)到的菌濃度比對(duì)照組低很多。殺菌曲線(xiàn)的結(jié)果也顯示，在前6 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，黃芩的殺菌效果變?nèi)酰@與Duan等［11］在研究黃芩提取物對(duì)鏈球菌的抑制活性時(shí)得到的結(jié)果一致。基于此結(jié)果，在后面實(shí)驗(yàn)的取樣測(cè)量中選擇前8個(gè)小時(shí)的生化作為參考指標(biāo)。

細(xì)菌的許多代謝過(guò)程都與細(xì)胞膜功能相關(guān)，而細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整是行使正常功能的重要保證。完整的細(xì)胞膜具有選擇透過(guò)性，帶電離子和大分子物質(zhì)無(wú)法自由通過(guò)細(xì)胞膜屏障，而當(dāng)細(xì)胞膜完整性遭到破壞時(shí)，首先會(huì)導(dǎo)致小分子物質(zhì)如鈉鉀離子的釋放，然后是大分子的蛋白核酸等物質(zhì)釋放到培養(yǎng)液中［22］。如Ikigai等［23］通過(guò)脂質(zhì)體模型，發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，導(dǎo)致小分子物質(zhì)從胞內(nèi)滲透出來(lái)。Sato等［24］在研究黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)口腔微生物的抑制活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)上清液260 nm處的吸光值增加，反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的核酸等物質(zhì)的滲漏，說(shuō)明破壞了細(xì)胞膜的完整性。本研究通過(guò)測(cè)定上清液蛋白濃度來(lái)判斷細(xì)菌細(xì)胞膜是否受到損傷。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)黃芩處理后，上清液的蛋白濃度不斷上升，而對(duì)照組的變化很小。而且He等［25］通過(guò)同樣的方法，也發(fā)現(xiàn)大腸桿菌經(jīng)黃酮類(lèi)物質(zhì)處理后上清液蛋白含量顯著性提高。本實(shí)驗(yàn)中，掃描電鏡觀察到細(xì)菌形態(tài)的變化，表面變得粗糙，不光滑，表明黃芩對(duì)副溶血性弧菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用。Sikkema等［26］報(bào)道大部分膜活性抑菌物質(zhì)是強(qiáng)疏水性的，因?yàn)槭杷杂兄谒鼈冊(cè)诩?xì)胞膜上積累，干擾其結(jié)構(gòu)，并且可以通過(guò)與細(xì)胞壁細(xì)胞膜的相互作用對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，導(dǎo)致通透性增加，而黃芩的主要活性成分正是具有較強(qiáng)疏水性的黃酮類(lèi)物質(zhì)。而且在Tsuchiya等［27］的研究報(bào)道中，也發(fā)現(xiàn)由于黃酮類(lèi)物質(zhì)的疏水性以及C3位的電荷與細(xì)胞膜的相互作用，改變了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。因此副溶血性弧菌的細(xì)胞膜是黃芩的一個(gè)作用靶點(diǎn)。在Lee等［28］的研究中也報(bào)道了黃酮類(lèi)物質(zhì)直接對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用。黃芩對(duì)副溶血性弧菌的具體抑制機(jī)制以及是否存在除了細(xì)胞膜之外的其他靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步的研究。

另一方面，由于蛋白質(zhì)在生命活動(dòng)中扮演著重要的角色，生物合成都離不開(kāi)蛋白質(zhì)的參與，所以通過(guò)對(duì)細(xì)胞蛋白提取來(lái)進(jìn)一步探索黃芩是否會(huì)通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)而達(dá)到抑菌效果。雖然Yong等［29］研究抗菌植物對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)了7種與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和外膜有關(guān)的蛋白合成受到抑制；陳禹先等［30］也發(fā)現(xiàn)黃芩素能強(qiáng)烈抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌蛋白的表達(dá)，但是副溶血性弧菌經(jīng)黃芩處理后，SDS-PAGE的結(jié)果顯示，在不同的處理時(shí)間下，蛋白的條帶并沒(méi)有發(fā)生明顯變化。進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌可溶性蛋白含量測(cè)定說(shuō)明，黃芩處理組與對(duì)照組的蛋白含量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明黃芩對(duì)副溶血性弧菌不是通過(guò)抑制蛋白合成而起作用。

4 結(jié)論

本研究從常見(jiàn)的4種抑菌中藥黃芩、黃連、大黃、金銀花中篩選對(duì)副溶血性弧菌有較好抑制效果的中藥，并對(duì)其抑菌機(jī)制進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，黃芩對(duì)副溶血性弧菌具有很好的抑制效果，并且其抑菌機(jī)制主要是黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，最終導(dǎo)細(xì)胞的裂解死亡。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Study on Antibacterial M echanism s of Ethanol-extracts from Scutellaria baicalensis Against Vibrio parahaemolyticus

Xie Liling Peng Qi Cai Lianchun Zhou Liang Zhu Yankun Han Guangyao
（College of Science，Shantou University，Shantou515063）

The goal of this work is to screen one with strong antibacterial activities against Vibrio parahaemolyticus from 4 traditional Chinese medicines（TCMs）， and study the underlying mechanisms. The sensitivity of ethanol-extracts from TCMs to Vibrio parahaemolyticus was determined by Oxford cup assay and liquid double dilution method. The antibacterial mechanism was investigated by measuring growth curve and bactericidal curve， electron microscope examination， and SDS-PAGE analysis. The results showed that different ethanol-extracts from 4 TCMs had different antibacterial activities upon V. parahaemolyticus， among them the ethanol-extract from S. baicalensis had the best antibacterial activity with an inhibition zone diameter of 22.00 ± 1.00 mm. Both the minimum inhibitory concentration（MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC）of the extract against V. parahaemolyticus were 3.91 mg/mL. V. parahaemolyticus treated with Scutellaria extract in MIC still entered a normal log and stationary phase after a longer lag phase. Bacterial surface became rough， showing a sign of cell lysis. Protein concentration in the supernatant increased significantly. However， the concentration of soluble proteins changed lightly after the treatment of Scutellaria extract. Conclusively， Scutellaria extract has a significant inhibition effect against V. parahaemolyticus by destroying the integrity of cell membrane and causing cell lysis.

Scutellaria baicalensis；Vibrio parahaemolyticus；ethanol-extract；antibacterial mechanism.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.023

2014-12-25

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（S2013010015919），汕頭大學(xué)校內(nèi)國(guó)家基金培育項(xiàng)目（NFC14003），廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410560066）

謝麗玲，女，碩士，副教授，研究方向：生物活性物質(zhì)，E-mail：llxie@stu.edu.cn；彭齊同為本文第一作者