高產二羥基丙酮重組菌株的構建

許曉菁趙瓊王祥河

（1.天津市產品質量監督檢測技術研究院，天津　300380；2.天津市工業微生物研究所，天津　300462）

高產二羥基丙酮重組菌株的構建

許曉菁1，2趙瓊2王祥河2

（1.天津市產品質量監督檢測技術研究院，天津300380；2.天津市工業微生物研究所，天津300462）

旨在構建一株過量表達編碼膜系甘油脫氫酶的sldAB基因的重組菌株，以提高二羥基丙酮產量。以氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H的基因組DNA為模板，運用PCR方法擴增得到基因sldAB，并連接到pBBR1MCS-2質粒上，構建表達載體pBBR1MCS-2-sldAB。通過電轉化將載體pBBR1MCS-2-sldAB轉化進入氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H內，得到重組菌株GOX205。結果顯示，重組菌株構建成功，其甘油脫氫酶的酶活力較之于出發菌株提高了26%。在甘油初始濃度100 g/L的甘油發酵培養基中，較之于出發菌株，GOX205的生長狀況良好，發酵52 h時DHA濃度達到94.1 g/L，較之于出發菌株提高了19.7%，甘油殘量降低了15.1 g/L。

1，3-二羥基丙酮；重組菌株；甘油；過量表達

1，3-二羥基丙酮（DHA）是一種重要的精細化工產品，可作為農藥合成中間體、精細化工原料和醫藥前體，用途廣泛。DHA的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法，當前的生產方法以化學合成法為主，但從技術的經濟型和環境的友好性來看，微生物發酵法更具經濟和社會效益。自從1898年Bertrand發現利用細菌可以將甘油轉化為DHA后，各國科研人員對微生物發酵甘油生產DHA進行了多方面的研究［1］。

氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）是一種嚴格好氧菌，經常被用于氧化甘油生成二羥基丙酮［2-6］。許多科研人員通過優化工藝參數［7］，培養基組成［8］、溶氧［9］、培養方式［10］、反應器類型［11，12］等方式來達到提高DHA產量的目的。也有人針對高產菌株的選育開展研究，例如從自然界篩選高產菌株［13］或者通過激光誘變［14］獲得高產菌株，華東理工大學的魏東芝等［15］申請的專利中公布了一種用重組基因工程質粒pET-gdh和pET-ndh轉化大腸桿菌，從而構建得到DHA產量提高的工程菌的方法，Li等［16］通過在乙醇脫氫酶缺失菌株中過量表達甘油脫氫酶提高了G. oxydans的DHA產量。

在G. oxydans菌中存在兩條甘油氧化的途徑，一條是甘油直接氧化成DHA，由不依賴于NAD的膜系甘油脫氫酶催化，最佳pH為6.0，然后DHA被激酶磷酸化成為磷酸二羥丙酮；另一條途徑是甘油被激酶催化成為甘油-3-磷酸，最佳pH為8.5，然后被依賴于NAD的脫氫酶氧化成為磷酸二羥丙酮，磷酸二羥丙酮通過PPP途徑分解代謝［17］。甘油發酵生產二羥基丙酮的過程便是利用了不依賴于NAD的膜系甘油脫氫酶（以下簡稱GDH）的催化作用。該酶以氧氣作為最終的電子受體，催化中心定位于周質空間，所以底物運輸不必透過細胞膜進入細胞內［18］。已有研究表明，甘油脫氫酶GDH是二羥基丙酮合成過程中的關鍵酶，提高甘油脫氫酶的表達量將提高底物轉化的效率［19，20］。本研究通過PCR方法獲得編碼甘油脫氫酶的基因sldAB，構建載體pBBR1MCS-2-sldAB，通過電轉化將載體pBBR1MCS-2-sldAB轉化進入宿主ATCC621H內，旨在得到過量表達甘油脫氫酶的重組菌株GOX205，為用于工業生產的二羥基丙酮重組菌株的構建進行有益探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 本實驗所用的菌株為G. oxydans ATCC621H，購自ATCC，由本實驗室保藏。大腸桿菌DH5α由本實驗室保藏。質粒pBBR1MCS-2由中國農業大學惠贈，該質粒具有卡那霉素抗性，可以在大腸桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌中進行轉化。

1.1.2 酶與化學試劑 基因片段回收試劑盒、質粒提取試劑盒、限制性內切酶、T4連接酶、蛋白酶K、Pfu DNA聚合酶和dNTP均購自TaKaRa公司。

甘露醇、甘油、NaCl、MgSO4·7H2O、酵母抽提物、蛋白胨、化學試劑均為分析純。

1.1.3 引物設計與合成 根據G. oxydans染色體中sldAB基因序列設計引物，上游引物命名為sldab-fw、下游引物命名為sldab-re，分別在上下游引物兩端添加Hin dⅢ、Eco RⅠ限制性內切酶酶切位點。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.1.4 培養基 甘露醇液體培養基（g/L）：酵母抽提物5.0，蛋白胨3.0，甘露醇25.0。

甘露醇固體培養基：在上述甘露醇液體培養基中加入1.5%（w/v）瓊脂粉。

甘露醇-卡那霉素固體培養基：上述甘露醇固體培養基經高溫滅菌并冷卻至室溫后加入卡那霉素至終濃度為50 μg/mL，混勻后倒入滅菌培養皿中。

LB-卡那霉素固體培養基：LB固體培養基（胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.5）經高溫滅菌并冷卻至室溫后加入卡那霉素至終濃度為50 μg/mL，混勻后倒入滅菌培養皿中。

電轉化培養基（g/L）：甘露醇80，酵母抽提物15，MgSO4·7H2O 2.5，甘油0.5，CaCl21.5。

種子培養基（g/L）：甘油10，酵母抽提物20，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5。

發酵培養基（g/L）：甘油30-200，酵母抽提物5，CaCO37。

1.2 方法

1.2.1 sldAB基因的擴增 利用細菌染色體提取試劑盒，提取氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H的染色體DNA，以其為模板用高保真Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增，反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min 。PCR產物按照PCR產物回收試劑盒說明書要求進行純化回收。

1.2.2 質粒pBBR1MCS-2-sldAB的構建 將擴增得到的sldAB基因片段4 μL與pBBR1MCS-2質粒4 μL分別加入限制性內切酶Hin dⅢ、Eco RⅠ各0.25 μL，10×酶緩沖液2 μL，用無菌水將總體積補充

到20 μL，放于37℃條件下消化1-2 h。用試劑盒對酶切產物分別進行純化回收。在20 μL連接體系中，加入2 μL 10×T4連接酶緩沖液，1 μL T4連接酶，sldAB基因片段3 μL，根據pBBR1MCS-2片段和sldAB基因片段的電泳條帶亮度確定pBBR1MCS-2片段的加入量，加水至20 μL，在16℃條件下連接2-3 h后，通過酶切驗證得到pBBR1MCS-2-sldAB質粒。

1.2.3 電轉化法構建重組菌株GOX205 采用電轉化法將質粒pBBR1MCS-2-sldAB導入氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H中，通過卡那霉素抗性壓力進行篩選，具體操作為：（1）制備電轉化感受態細胞：將氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H接種于裝有50 mL電轉化培養基的500 mL搖瓶中，將搖瓶放于30℃，200 r/min的搖床中培養至培養液在600 nm的吸光度達到0.4；將細胞通過在4℃，6 000 r/min條件下離心4 min進行收獲，并在30 mL的滅菌過的10%（v/v）甘油中重懸，細胞用冷的10%（v/v）甘油洗3次，最后重懸于2 mL 10%（v/v）甘油中，即為電轉化感受態細胞；（2）取400 μL電轉化感受態細胞用于電轉化，每管感受態細胞加入 1 μL pBBR1MCS-2-sldAB質粒，用移液器輕輕吸打均勻，置于冰上；（3）將要轉化的混合物加入預冷的 1 mm的電轉化杯中，立即按下按鈕電擊，脈沖電壓2 000 v；（4）立即加800-1 000 μL甘露醇培養基到轉化杯中重懸細胞；（5）將細胞轉入合適的培養管中置于30℃搖床中培養3-5 h；（6）吸取100-200 μL的菌液涂布到甘露醇-卡那霉素固體培養基平板上，30℃條件下培養3-5 d；（7）挑選轉化子：挑出在甘露醇-卡那霉素固體培養基平板上生長的單菌落，提取質粒后進行酶切實驗驗證，得到轉化子GOX205。

1.2.4 轉化子的遺傳穩定性實驗 用傳代的方法考察轉化子的遺傳穩定性，將GOX205在不含卡那霉素的甘露醇斜面上進行連續傳代20代，并將第1、10、20代轉化子提取質粒后用PstⅠ進行酶切驗證。與此同時，進行搖瓶發酵實驗，將1、10、20代的轉化子分別接種于500 mL搖瓶中，每個搖瓶中均裝有150 mL甘油初始濃度為30 g/L的發酵培養基，30℃，200 r/min搖床上進行發酵實驗，發酵16 h達到發酵終點。比較第1、10、20代轉化子的甘油到DHA的轉化率。轉化率計算公式如下：

其中，m為質量，90為DHA的分子量，92為甘油的分子量。

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 生物量測定 利用分光光度計測定發酵液在600 nm處的吸光度，以OD600表示。

1.2.5.2 甘油和DHA的測定 高效液相法，Agilent 1100 HPLC儀，流動相為乙腈∶水（90∶10），色譜柱為Lichrospher 5-NH2（4.6 mm×250 mm），甘油采用示差檢測器，柱溫35℃，DHA采用紫外檢測器，檢測波長：271 nm［21］。

1.2.5.3 相對酶活力測定 發酵進入穩定期后分別取重組菌株GOX205和出發菌株的發酵液20 mL，8 000 r/min離心10 min收集細胞，將細胞洗滌兩次后用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋成在OD600處吸光度值相同的細胞懸浮液。在250 mL的三角瓶中加入1 mL的細胞懸液和30 mL 1 mol/L的甘油，30℃，200 r/min反應1 h，檢測生成的DHA的量。將1 mL出發菌株的細胞懸液中GDH的酶活力設為1，根據DHA量計算1 mL重組菌株GOX205細胞懸液中GDH的相對酶活力。

2 結果

2.1 目的基因sldAB的獲得

利用PCR方法擴增目的基因sldAB，并將反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果（圖1）顯示，擴增得到的片段大小為3 000 bp左右，經測序比對與目的基因sldAB的同源性為100%。

圖1 sldAB基因的擴增

2.2 質粒pBBR1MCS-2-sldAB的構建

重組質粒pBBR1MCS-2-sldAB分別用Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切，經瓊脂糖凝膠電泳上跑膠驗證。若質粒構建成功，則經過Bam HⅠ后應出現大小分別為2 181 bp和6 012 bp的條帶；用Eco RⅠ酶切，應出現一條8 193 bp的條帶。結果（圖2）顯示，重組質粒構建成功。

圖2 pBBR1MCS-2-sldAB質粒酶切圖譜

2.3 重組菌株的穩定性

第1、10、20代轉化子在提取質粒并用Bam HⅠ酶切后，結果（圖3）顯示，經過20次傳代后，并未發生質粒丟失或回復突變現象，說明該重組菌株遺傳性能穩定。同時，對1、10、20代的轉化子進行發酵性能實驗，其16 h轉化率分別為88.6%、89.8%和88.4%。結果（圖4）表明，經過20次傳代后，轉化子的發酵性能無明顯變化。

圖3 轉化子穩定性的驗證

2.4 相對酶活力測定

將GOX205與出發菌株在相同的搖瓶培養條件下（甘油初始濃度100 g/L，30℃，200 r/min）發酵至40 h時，兩菌株均已進入穩定期，分別取兩種發酵液制備相同濃度的細胞懸液，測定GDH的活力。結果（圖5）顯示，相同細胞濃度條件下，重組菌株GOX205的酶活力是出發菌株的1.26倍。說明通過sldAB基因的過量表達，GDH的表達量有了明顯的提高。

圖4 轉化子穩定性的驗證（發酵實驗）

圖5 重組菌株GOX205的相對酶活

2.5 發酵性能考察

在5 L發酵罐中進行發酵實驗考察重組菌株GOX205的發酵性能。發酵培養基中甘油初始濃度為100 g/L，發酵溫度30℃，通氣量為6 vvm，培養時間為52 h，跟蹤測定發酵過程中發酵液吸光度變化與甘油消耗及DHA生成情況。同時將出發菌株ATCC621H做平行對照。結果（圖6-圖8）表明，在100 g/L的甘油發酵液中，GOX205的生長狀況良好，DHA濃度達到94.1 g/L，較之于ATCC621H提高了19.7%，甘油殘量較之于ATCC621H降低了15.1 g/L。

3 討論

底物抑制和產物抑制被認為是制約G. oxydans轉化甘油生成DHA的轉化效率的重要因素。高濃度的DHA會阻礙甘油的進一步氧化，這種抑制作用對細胞產生不可逆的損害，以至于細胞的活力隨時間指數下降，其間GDH的活力也受到影響［22，23］。在本研究中，當提高甘油初始濃度至150 g/L和200 g/L時，5 L發酵罐間歇發酵時重組菌株GOX205的 DHA產量分別達到133 g/L和124 g/L，而出發菌株的DHA產量分別為96 g/L和90 g/L。這說明當GDH的表達量增大時底物抑制作用會降低，細胞活性能夠得以保持，這與Gatgens等［20］的研究結論一致。同時Gatgens等［20］的研究表明，過量表達sldAB基因時采用強啟動子可以使得sldB基因的表達量顯著提高，并且采用強啟動子表達的菌株在甘油初始濃度提高時顯示出更高的底物抑制消除作用。

圖6 重組菌株GOX205與出發菌株生長性能比較

圖7 重組菌株GOX205與出發菌株甘油消耗性能比較

圖8 重組菌株GOX205與出發菌株DHA產量比較

在G. oxydans的細胞內，大部分甘油被GDH氧化成為DHA，同時一小部分被膜系乙醇脫氫酶（ADH）氧化生成甘油醛，進而轉化為甘油酸［24］，Habe等［25］構建了adhA基因敲除的突變菌株，在甘油初始濃度100 g/L的間歇發酵中，G. oxydans野生菌在2 d內消耗完大部分甘油，DHA產量為54.3 g/L，而突變菌株在相同的時間內產生DHA 74.8 g/L，當甘油初始濃度進一步增加時，突變菌株的優勢更加明顯。在本研究中，重組菌株的相對酶活力較之于出發菌株提高了26%，而Li等［16］的研究顯示，在ADH缺失的菌株中過量表達sldAB時，GDH的酶活力較之于出發菌株可提高58%。與之類似的是，Gatgens等［20］在葡萄糖酸-2-脫氫酶缺失菌株中過量表達sldAB時，DHA的產量也高于在野生型菌株中過量表達。這提示我們，微生物的基因彼此之間存在相互關聯，要獲得更高的DHA產量，除了在過量表達sldAB時引入強啟動子，還可以結合代謝工程手段尋找與DHA生成相關的多個基因進行一系列基因工程操作。

4 結論

本研究中，通過利用基因工程手段過量表達編碼DHA合成途徑關鍵酶——甘油脫氫酶的sldAB基因，構建了重組菌株GOX205，該菌株具有穩定的遺傳性能，其發酵甘油生產DHA的性能較出發菌株有明顯的提高。

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（責任編輯 馬鑫）

Construction of a Recombinant Strain Producing High-yield Dihydroxyacetone

Xu Xiaojing1，2Zhao Qiong1Wang Xianghe1
（1. Industrial Microbe Research Institute of Tianjin，Tianjin300462；2. Tianjin Product Quality Inspection Technology Research Institute，Tianjin300380）

This work aims to construct a recombinant strain containing gene sldAB over-expressing membrane-bound glycerol dehydrogenase for raising the yield of dihydroxyacetone（DHA）. Firstly， using genomic DNA of Gluconobacter oxydans ATCC621H as a template， sldAB amplified by PCR was ligated to the plasmid pBBR1MCS-2 and the expression vector pBBR1MCS-2-sldAB was constructed；subsequently the plasmid pBBR1MCS-2-sldAB was transformed into the G. oxydans ATCC621H by electrotransfer， and the recombinant strain GOX205 was obtained. Results showed that the recombinant strain was constructed successfully， and the activity of glycerol dehydrogenase increased by 26% compared with the original strain. When initial concentration 100 g/L of glycerol as carbon source， the growth of GOX205 was significantly improved compared with the original strain， the final DHA concentration was 94.1 g/L and increased by 19.7%， and the residue of glycerol decreased 15.1 g/L. Therefore， this study provides a basis for further improving the biotransformation process of DHA production.

1， 3-dihydroxyacetone；recombinant strain；glycerol；over-expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.025

2014-12-09

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（天津市自然科學基金）重點項目（10JCZDJC16600）

許曉菁，女，博士，高級工程師，研究方向：工業微生物發酵及檢測方法開發；E-mail：xxjmiss@163.com