M ixture與響應面法結合開發BHK-21細胞無血清懸浮培養基

汪梁 劉旭平 譚文松

（華東理工大學　生物反應器工程國家重點實驗室，上海　200237）

M ixture與響應面法結合開發BHK-21細胞無血清懸浮培養基

汪梁 劉旭平 譚文松

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海200237）

采用Mixture與響應面實驗設計相結合的方法開發BHK-21細胞無血清懸浮培養基。在實驗室已知配方的6種培養基A-F的基礎上，通過Mixture實驗篩選出BHK-21細胞無血清培養基的最優組合為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。利用響應面法針對培養基中的幾種關鍵組分進行濃度優化，確定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和鈣離子的最優濃度分別為3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。該無血清懸浮培養基能很好地支持BHK細胞懸浮生長，培養時細胞最大活細胞密度可達140.21×105個/mL，比商業培養基提高了1.95倍。采用Mixture試驗設計和響應面分析法能夠在較短的時間內開發出適合BHK-21細胞生長的無血清懸浮培養基，為采用BHK-21細胞大規模工業化生產口蹄疫疫苗奠定了基礎。

BHK-21細胞；無血清懸浮培養基；Mixture實驗設計；響應面分析

口蹄疫是一種無國界傳播的全球性傳染病，可引起巨大的經濟損失和嚴重的公共衛生問題，故常被稱為“政治經濟病”。其一旦暴發，能迅速演變為生物災害。大批的動物被撲殺銷毀，引發更為嚴重的公共衛生問題，容易造成社會的恐慌。對易感動物進行針對性的疫苗接種是控制口蹄疫傳播最有效的措施［1］。

近年來，隨著動物細胞培養技術逐漸應用于獸用疫苗的生產，動物細胞懸浮培養成為滅活口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）疫苗生產的發展方向［2，3］。憑借對病毒的高敏感性，BHK細胞自1962年建株以來已成為制備FMD疫苗所需病毒抗原的理想細胞系，被廣泛應用于FMD疫苗生產［4，5］。傳統BHK細胞大多采用轉瓶低血清貼壁的培養方式［6］。傳統的有血清培養基盡管能向細胞提供生長繁殖所必需的激素、生長因子及其他營養物質，但每個批次的血清之間存在批間差異，且血清價格昂貴，容易被病毒和支原體感染［7，8］。此外，血清中大量存在的成分復雜的蛋白質給疫苗成品后期的分離純化帶來很大的困難。無血清培養基一般是在傳統基礎培養基的基礎上添加生長因子、鐵轉運劑、維生素、微量元素以及植物蛋白水解物等來替代血清成分［9］。開發無血清懸浮培養基能夠簡化純化和下游加工，降低生產成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害，提高了細胞培養的可重復性和穩定性，避免了血清批次之間差異的影響。

Mixture和響應面都是基于合理的實驗設計方法并通過實驗得到一定數據進而解決多變量問題的一種統計學方法，被廣泛應用于動物細胞培養技術［10-13］。本實驗在現有6種培養基的基礎上先采用Mixture方法開發適用于BHK細胞高密度懸浮培養的無血清培養基，并針對幾種關鍵成分應用響應面實驗優化其濃度，旨為基于BHK細胞無血清懸浮培養生產口蹄疫疫苗提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 本實驗所用的細胞株為敘利亞倉鼠腎細胞系BHK-21（Baby Hamster Kidney cell-21）細胞，由合作企業提供。

1.1.2 培養基 商業培養基：由合作企業提供；6種基礎培養基：從實驗室已知配方的無血清培養基配方庫中挑選出6種培養基，配制結束后經Millipore公司0.22 μm微孔濾膜過濾，并分別命名為A、B、C、D、E和F。其中A、B、C為實驗室自主研發的無血清培養基，專利號分別為CN201010022834.4、CN201410513086.8和 CN200810039305.8。D、E和F為參考國內外與培養基相關的專利文獻結合BHK細胞的生長狀況計算獲得的無血清培養基，具體培養基配方，見表1。

1.1.3 主要試劑 培養基配制所用的試劑中葡萄糖、氨基酸和維生素均購自美國生命技術公司；各微量金屬鹽類物質購自美國Sigma-Aldrich公司；葡萄糖和氨含量測定試劑盒購自上海科欣生物技術研究所；乳酸濃度測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 BHK細胞在實驗培養基中的培養 將處于對數生長期，活性大于95%的BHK-21細胞移入50 mL離心管中，180×g離心5 min。棄上清，用實驗培養基重懸后加入搖瓶（125 mL，Corning）中，工作體積30 mL，置于130 r/min的搖床，在37℃，5% CO2條件下培養。每24 h取樣，計數后1 000×g離心5 min。上清置于-20℃冰箱保存，用于代謝副產物分析。

1.2.2 基礎培養基Mixture實驗設計 將處于對數生長期，活性在95%以上的BHK-21細胞接種于125 mL搖瓶，接種方式見1.2.1，工作體積為30 mL。搖床轉速為130 r/min，CO2濃度5%，溫度37℃，濕度85%。A-F分別為考察的6種培養基，每個實驗組中各培養基對應的數字為這種培養基在工作體積中所占的體積百分數。實驗共設置35個實驗組，其中2個為對照組。其中除對照組以外的實驗組所用培養基由6種培養基混合獲得。對照組的編號為33、34，所用培養基為商業培養基。接種后每24 h取樣計數，以最大活細胞密度和IVCC作為實驗的響應值，考察響應值的大小。實驗設計方案，見表2。

1.2.3 響應面實驗設計與因子最適濃度的確定 Mixture實驗發現前期谷氨酰胺（Gln）在48 h基本用盡，同時懸浮細胞存在結團現象。通過查閱文獻，研究發現Gln不僅是培養基中重要的碳源，還是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸［14-16］。同時鈣離子濃度能夠顯著影響細胞的結團現象，因此需要考察培養基中Gln和鈣離子的最優濃度。此外，牛血清白蛋白（BSA）是血清的重要替代物，酪氨酸（Tyr）也是培養基中對細胞生長狀況有顯著影響的組分［17-20］。為了進一步優化培養基，選取Tyr、Gln、BSA和鈣離子，通過在高水平和低水平之間設置5個濃度梯度，確定4種組分的最佳配比及濃度。利用Design-Expert軟件對數據進行模型分析，通過做響應曲面圖的方式進行考察。設計表見表3，其中各水平值1-5分別代表所配制的培養基中各組分對于相應濃度的倍率。

表1 基礎培養基配方表

實驗編號　A　B　C　D　E　F 1　0.083　0.083　0.083　0.083　0.583　0.083 2 0 0 0 0 1 0 3　0.583　0.083　0.083　0.083　0.083　0.083 4　0.083　0.583　0.083　0.083　0.083　0.083 5　0　0　0.5　0　0.5　0 6 0 0 0 1 0 0 7 1 0 0 0 0 0 8　0.083　0.083　0.583　0.083　0.083　0.083 9 0 1 0 0 0 0 10　0.083　0.083　0.083　0.083　0.083　0.583 11　0.083　0.083　0.083　0.583　0.083　0.083 12　0　0.5　0　0　0.5　0 13 0　0　1　0　0　0 14　0　0　0　0　0.5　0.5 15　0　0　0　0.5　0.5　0 16 0　0　0　0　0　1 17 1　0　0　0　0　0 18　0.5　0　0　0　0.5　0 19　0　0.5　0　0　0　0.5 20　0　0　0　0.5　0　0.5 21　0　0　0.5　0.5　0　0 22　0.167　0.167　0.167　0.167　0.167　0.167 23 0　0　0　0　0　1 24 0　1　0　0　0　0 25 0　0　0　1　0　0 26　0.5　0　0.5　0　0　0 27　0.5　0.5　0　0　0　0 28　0　0　0.5　0　0　0.5 29　0.5　0　0　0.5　0　0 30 0　0　1　0　0　0 31　0　0.5　0　0.5　0　0 32　0　0.5　0.5　0　0　0 33　0.5　0　0　0　0　0.5

編號　Tyr　Gln　BSA　鈣離子1 2 2 4 4 2 2 2 2 2 3 4 4 4 2 4 3 3 3 3 5 3 1 3 3 6 4 4 4 4 7 2 4 4 4 8 4 4 2 4 9 3 3 3 3 10 4　2　4　2 11 3　3　1　3 12 2　4　2　2 13 1　3　3　3 14 4　2　2　4 15 3　3　3　1 16 4　2　4　4 17 2　2　4　2 18 3　3　3　3 19 5　3　3　3 20 2　4　2　4 21 3　3　3　3 22 2　2　2　4 23 2　4　4　2 24 4　2　2　2 25 3　3　3　3 26 3　3　5　3 27 3　5　3　3 28 3　3　3　3 29 4　4　2　2 30 3　3　3　5

1.2.4 優化后培養基的驗證 用優化后關鍵組分濃度配制的無血清懸浮培養基在工作體積為30 mL的搖瓶中培養BHK-21細胞，考察并對比細胞在商業培養基和優化后的無血清培養基中的生長及代謝情況。

1.2.5 細胞計數 由于細胞存在一定結團的現象，因此計數前需先用少量胰酶消化5 min。以臺盼藍染色消化好的細胞，用血球計數板計活細胞數，并計算活細胞密度和比生長速率。

1.2.6 葡萄糖、氨和乳酸濃度的測定 采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，脲酶-波氏比色法測定氨含量，氧化酶法測定乳酸濃度，均按試劑盒說明書操作。

1.2.7 數據處理

（2）活細胞密度對時間積分：IVCC=∫Xvdt（公式2）式中，IVCC（Integral of viable cell concentration over time）為活細胞密度對時間的積分（108cells·d/L）。

2 結果

2.1 基礎培養基Mixture篩選實驗

34種培養基培養的細胞最大活細胞密度和IVCC兩組響應值，見表4。根據響應值的大小分析6種培養基的不同配比對響應值的影響，結果表明培養基C對細胞的最大活細胞密度和IVCC的影響顯著強于其他幾種培養基。利用Design-Expert軟件篩選得出BHK-21細胞無血清培養基的最優組合為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。

表4 基礎培養基Mixture實驗結果

分析各組分對2個響應值的影響后擬合出的線性方程為：最大活細胞密度= 23.67A +11.79B+ 38.30C+34.33D+23.04E+43.63F+14.61AB+132.47 AC-27.36AD+5.14AE+48.41AF+91.41BC+20.77BD +42.67BE+24.74BF+79.23CD+166.93CE+46.40CF +4.09DE+59.57DF+82.07EF；IVCC=114.33A+52.9 6B+154.99C+130.42D+95.06E+149.33F+66.86AB+ 238.42AC-61.05AD-4.23AE+110.29AF+243.46BC+ 164.16BD+152.41BE+121.59BF+347.55CD+624.29 CE+77.22CF+32.65DE+100.95DF +170.36EF。

2.2 響應面實驗結果

利用響應面分析方法對Tyr、Gln、BSA和鈣離子進行定量優化的結果，見表5，響應面圖見圖1和圖2。以72 h內細胞生長獲得的最大活細胞密度和IVCC作為考察對象，對培養基中Gln、Tyr、BSA和鈣離子進行最優化分析得出，其最優濃度分別為基礎培養基中相應濃度的1倍、4倍、1倍、和1倍，濃度分別為3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。擬合得到多元回歸模型：最大活細胞密度=17.66Tyr +54.95Gln+20.60BSA +3.33Ca2+-1.93TyrGln-3.11Tyr-BSA+2.35TyrCa2+-2.74GlnBSA-2.29GlnCa2+-2.85 BSACa2+-3.78Tyr2-4.63Gln2+1.11BSA2+0.49（Ca2+）2-62.01；IVCC=64.72-15.30Tyr+17.06Gln+5.95BSA-2.60Ca2+-0.07TyrGln-1.86TyrBSA+2.22TyrCa2+-0.68GlnBSA-0.44GlnCa2+-1.70BSACa2++0.30Tyr2-1.66Gln2+1.30BSA2+0.0083（Ca2+）2。

2.3 BHK細胞在優化后培養基中的生長及代謝情況

將優化后的培養基用于培養BHK懸浮細胞，并和商業培養基中細胞的生長和代謝情況進行對比，結果如圖3所示。其中圖3-A、圖3-B兩圖為商業培養基中細胞的生長和代謝情況，圖3-C、圖3-D兩圖為優化后培養基中細胞的生長和代謝情況。

生長方面，接種后商業培養基中細胞幾乎沒有經過延滯期即進入對數生長期，此時比生長速率最大，約為0.75 d-1。隨后比生長速率迅速下降，至108 h細胞比生長速率下降至0 d-1，即進入生長穩定期。穩定期維持時間很短，之后比生長速率持續下降，即進入細胞衰亡期。

表5 響應面實驗結果

培養至96 h細胞密度達到最大值，為71.92×105cells/mL，之后細胞密度下降。以最優化的Tyr、Gln、BSA和鈣離子濃度配制的無血清懸浮培養基培養BHK懸浮細胞同樣在96 h獲得最大活細胞密度140.21×105cells/mL，約為商業培養基的1.95倍，較商業培養基提高了94.95%。此外，優化后培養基中細胞的穩定期大概能夠維持72 h左右，較商業培養基延長了48 h。因此，優化后的培養基能夠改善后期細胞的維持狀況，提高細胞可獲得的最大活細胞密度。

代謝方面，商業培養基中BHK細胞生長過程累積消耗18.88 mmol/L葡萄糖，累積產生乳酸19.47 mmol/L，乳酸對葡萄糖的得率約為1.03 mmol/mmol，整個培養過程共產生氨11.91 mmol/L。而優化后培養基中細胞生長過程累積消耗葡萄糖41.16 mmol/L，累積產生乳酸25.27 mmol/L，乳酸對葡萄糖的得率約為0.61 mmol/mmol，整個培養過程共產生氨11.09 mmol/L。對比可見，優化后的培養基增加了培養基中的葡萄糖含量，且乳酸對葡萄糖的得率降為商業培養基的59.22%，這說明更多的葡萄糖用于細胞的生長。

3 討論

本研究采用了Mixture實驗和響應面分析相結合的方法開發適于BHK細胞懸浮培養的無血清培養基。結果顯示，該組合方法能快速地利用現有的培養基開發出適合細胞生長的培養基，并能夠針對關鍵組分進行濃度優化進而獲得理想的培養基配方，是一種簡便高效的培養基開發方法。

通過Mixture實驗以最大活細胞密度和IVCC為考察指標初步篩選出能夠維持BHK細胞生長的基礎培養基，并確定6種培養基的混合比例分別為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。針對Tyr、Gln、BSA和鈣離子進行響應面實驗設計和分析確定4種物質的最佳添加比例和濃度，并最終確定一種適合BHK細胞懸浮培養的無血清培養基。將優化后的培養基和商業培養基比較發現，優化后的無血清培養基培養的BHK懸浮細胞最大活細胞密度較商業培養基提高了94.95%，且乳酸對葡萄糖的得率降為商業培養基的59.22%。表明該培養基優化過程已成功使BHK細胞生長擺脫了對血清的依賴，為采用BHK細胞大規模生產口蹄疫疫苗奠定了數據基礎。

4 結論

本研究通過Mixture實驗法確定各種培養基的最優混合方式，并利用響應面法確定關鍵組分的最優濃度，最終開發出適于BHK細胞懸浮培養的無血清培養基。優化后的培養基能改善細胞的生長狀況，符合大規模生產的需要。

圖1 四種關鍵組分對BHK細胞最大活細胞密度影響的響應面圖

圖2 四種關鍵組分對BHK細胞IVCC影響的響應面圖

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圖3 BHK細胞在商業培養基和優化后培養基中的生長和代謝情況

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（責任編輯 狄艷紅）

Optim ization of Suspended Serum-free M edium for BHK-21 Cells by Combining M ixture w ith Response Surface Analysis

Wang Liang Liu Xuping Tan Wensong
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai200237）

This study is to optimize the suspended serum-free medium for BHK-21 cells by combining Mixture experiment design with response surface analysi（sRSA）. Based on 6 media A-F of known formulation in the laboratory， the optimal combination of the medium with A：B：C：D：E：F = 0：0：11：0：9：0 was screened by the Mixture test. The contents of several key constituents in the medium were optimized by RSA， and the optimal concentrations of glutamine， tyrosine， bovine serum albumin（BSA）and calcium ion were 3 mmol/L， 2.5 g/L， 0 g/L and 0 mmol/L respectively. The serum-free medium effectively supported the suspending growth of BHK cells. The maximum viable cell density of BHK cells in cell suspension culture reached 140.21×105cells/ml， which was 1.95 times in basal medium. The suspended serum-free medium for BHK-21 cells was developed by combining Mixture experiment design with RSA， which lays a foundation for the industrial production of footand-mouth disease（FMD）vaccine while using BHK-21 cells.

BHK-21 cells；suspended serum-free medium；Mixture experiment design；response surface analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.009

2015-06-10

國家自然科學基金項目（21206040，21406066），國家“863”計劃項目（2012AA02A303），國家重大專項（2013ZX10004003-003-003），中央高校基本科研業務費（WF1214035）

汪梁，女，碩士研究生，研究方向：動物細胞的大規模培養；E-mail：aaa098503013@163.com

劉旭平，E-mail：xupingliu@ecust.edu.cn；譚文松，E-mail：wstan@ecust.edu.cn