Cry1Ab/Cry1Ah雜合蛋白構建與功能研究

徐曼蔣健束長龍張杰，宋福平，

（1東北農業大學，哈爾濱　150030；2.中國農業科學院植物保護研究所　植物病蟲害國家重點實驗室，北京　100193）

Cry1Ab/Cry1Ah雜合蛋白構建與功能研究

徐曼1蔣健2束長龍2張杰1，2宋福平1，2

（1東北農業大學，哈爾濱150030；2.中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害國家重點實驗室，北京100193）

Cry1A類殺蟲蛋白是目前應用最為廣泛的殺蟲蛋白，目前已經報道的Cry1A類殺蟲蛋白之間存在普遍的結構域交換現象。針對鱗翅目害蟲具有高活性的Cry1Ab與Cry1Ah蛋白開展研究，構建了Cry1Ab、Cry1Ah的雜合蛋白AhAhAb并測定了殺蟲活性。結果顯示，Cry1Ab、Cry1Ah的結構域交換引起蛋白殺蟲活性的顯著變化，與出發蛋白相比，雜合蛋白AhAhAb喪失了對棉鈴蟲殺蟲活性，降低了對玉米螟、小菜蛾殺蟲活性。利用生物信息學方法對Cry1Ah結構域I建模，并分析其與其他Cry1A蛋白結構及表面性質差異，分析表明Cry1Ah與Cry1Ab的結構域I有相同的碳骨架和二級結構，但是表面電勢分布有較大差異。進一步分析雜合蛋白AhAhAb與Cry1Ab、Cry1Ah之間殺蟲活性差異的原因對進一步揭示Cry1A類蛋白殺蟲特異性進化規律有重要意義。

Cry1Ah；結構域I；殺蟲活性

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種廣泛分布的革蘭氏陽性細菌，在形成芽胞的同時能產生由cry或cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），對多種害蟲有特異殺蟲活性［1，2］。目前，Bt不僅被開發成生物農藥在害蟲防治中得到應用，表達Bt Cry蛋白的轉基因抗蟲植物也已經被廣泛種植，實現了巨大的經濟效益與生態效益。其中，Cry1A是一個對鱗翅目害蟲有高活性的殺蟲蛋白家族，目前已知的Cry1A類基 因 有 cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ad、cry1Ae、cry1Af、cry1Ag、cry1Ah、cry1Ai及cry1Aj等10個模式種類，112個殺蟲基因，編碼130 kD左右的蛋白（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/ Bt/）。這些基因中cry1Ab、cry1Ac應用最為廣泛，cry1Ah是中國農業科學院植物保護研究所克隆的具有自主知識產權的殺蟲基因（專利號：ZL20041000-9918.9），其編碼的 Cry1Ah 蛋白對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、亞 洲 玉 米 螟（Ostrinia furnacalis）和水稻二化螟（Chilo suppressalis）等多種鱗翅目害蟲具有很高的毒殺活性，超過目前商業化的 cry1Ab、cry1Ac 等基因［3，4］，具有巨大的應用前景，目前正在利用其進行轉基因抗蟲植物研究［5-7］。

Cry1A類蛋白屬于典型的3個結構域蛋白（3 Domain，3D）。結構域I由7個α螺旋組成（其中6個兩性螺旋圍繞1個中心螺旋）；結構域II，也稱作β“三棱鏡”，由3個β折疊片對稱折疊形成一個“希臘鑰匙”形狀的結構；結構域III，是一種兩個反平行的β-折疊片包裹在一個類似 “果凍卷”中的結構。研究結果表明，結構域I與蛋白插入細胞膜以及形成穿孔有關，結構域II和III都與受體識別及結合有關，決定殺蟲特異性。對目前已經明確殺蟲活性蛋白的各結構域進行序列比對聚類發現，部分殺蟲活性（特別是Cry1類蛋白）可以由結構域III的重組獲得，Cry毒素結構域交換是一種殺蟲特異性進化的機制。

通過序列比對發現，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah三個蛋白之間有共同的結構域II（序列一致性大于97%）；Cry1Ab、Cry1Ac有共同的結構域I（序列一致性為98%）；而Cry1Ac、Cry1Ah有共同的結構域III（序列一致性為100%）。Cry1Ab結構域III與Cry1Ac、Cry1Ah不同，但是在Cry1A家族中比較常見，與Cry1Aa、Cry1Ae、Cry1Af等蛋白結構域III序列一致性大于97%；Cry1Ah結構域I比較獨特，不僅與Cry1Ab、Cry1Ac不同，與所有報道的Bt殺蟲蛋白的結構域I差異都較大（序列一致性都小于72%）。本研究通過同源建模的方法比較Cry1Ab和Cry1Ah結構域I結構、表面電荷分布特點；進一步構建Cry1Ab和Cry1Ah的雜合蛋白并測定殺蟲譜，分析結構交換對Cry1Ab和Cry1Ah殺蟲活性的影響，旨在對進一步揭示Cry1A類蛋白殺蟲特異性進化規律奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和質粒 本研究所用到的菌株和質粒，見表1。

表1 菌株與質粒

1.1.2 培養基及生化試劑 LB培養基：1.0% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1.0% 氯化鈉，pH7.0。ZYP-5052培養基和50×5052誘導劑。Primer star高保真DNA聚合酶購自寶生物工程大連有限公司（TaKaRa/Japan），限制性內切酶、DNA連接試劑盒、DNA回收試劑盒等購自Axygen公司（Axygen/USA）。

1.1.3 供試昆蟲 敏感種群小菜蛾由本實驗室提供；棉鈴蟲、亞洲玉米螟分別由中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲組和玉米害蟲組提供；甜菜夜蛾由武漢科諾公司提供。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質序列與結構分析 首先將要分析蛋白氨基酸序列提交NCBI保守結構與數據庫（Conserved Domain Database，CDD）進行比對，獲取蛋白中對應Endotoxin_N，Endotoxin_M，Endotoxin_C三個結構域的氨基酸序列，并通過BLAST的方法比較殺蟲蛋白氨基酸序列間的一致性。進一步利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）對3個結構域對應氨基酸序列進行自動建模，獲得的三維結構進一步用PyMOL軟件包進行結構比對與表面特性分析。

1.2.2 雜合蛋白構建 采用無縫克隆的方法構建Cry1Ah與Cry1Ab雜合蛋白AhAhAb，雜合蛋白具備Cry1Ah結構域I和結構域II、Cry1Ab結構域III，引物Cry1AhF和AhAhAbR用于擴增Cry1Ah結構域I和結構域II，引物AhAhAbF和Cry1AbR用于擴增Cry1Ab結構域III，表達載體是pET21b。雜合蛋白載體構建引物序列，見表2。

表2 雜合蛋白載體構建引物序列

1.2.3 雜合蛋白表達與分析 方向正確的重組質粒轉入表達菌株Rosetta（DE3），進行IPTG誘導表達，誘導表達條件見參考文獻［8］。在20 mmol/L Tris·Cl（pH8.0）緩沖液中進行細胞破碎，然后可溶組分和不可溶組份分別進行SDS-PAGE分析，蛋白電泳樣品制備與SDS-PAGE分析方法參見文獻［9］。蛋白定量后進行活性測定，棉鈴蟲、亞洲玉米螟、小菜蛾、甜菜夜蛾的生物測定方法參照文獻［10-12］。此外，利用Image-J軟件包對照片中試蟲的身長進行測定，比較發育情況。

2 結果

2.1 Cry1Ah與Cry1Ab、Cry1Ac序列比較

通過NCBI保守結構與數據庫（Conserved domain database，CDD）進 行 比 對 分 析 發 現，Cry1Ah1蛋白的結構域I、結構域II、結構域III分別位于第57-275位、第280-481位、第491-629位氨基酸。分別將Cry1Ah1全長蛋白、3個結構域核心活性區及3個獨立結構域與Cry1Ab、Cry1Ac進行比較發現，Cry1Ah1的Endotoxin_N結構域與Cry1Ab、Cry1Ac不同，而Cry1Ab的Endotoxin_C與Cry1Ac、Cry1Ah差異較大，3個蛋白的Endotoxin_M一致性大于98%（表3）。

表3 Cry1Ah1與Cry1Ab13、Cry1Ac1序列比較/%

2.2 Cry1Ah與Cry1Ab結構域I比較

由于Cry1Ah1與Cry1Ab13除結構域I差異外，兩者結構域III還存在較大差異，因此可以通過構建Cry1Ah1與Cry1Ab13雜合蛋白來分析Cry1Ah1結構域I對Cry1A殺蟲蛋白活性的影響。利用SWISS-MODEL自動建模功能分別獲得了Cry1Ah1與Cry1Ab13結構域I以及3個結構域核心活性區的結構信息（圖1），通過分子疊合比對發現，盡管Cry1Ah1與Cry1Ab13序列存在較大差異（31%），但是兩者結構域I的碳骨架沒有差異（圖1）。進一步分析了結構域I的表面結構與表面靜電勢分布，結果顯示盡管兩個蛋白結構域I的碳骨架沒有差異，由于氨基酸序列以及氨基酸側鏈基團不同，兩個蛋白的結構表面以及電勢分布都有所不同（圖2）。

圖1 Cry1Ah1與Cry1Ab13結構域I碳骨架及二級結構比較

圖2 Cry1Ah1與Cry1Ab13結構域I表面結構以及靜電勢分布比較

2.3 Cry1Ah與Cry1Ab雜合蛋白構建與表達

由于Cry1Ah1與Cry1Ab13結構域I、結構域II、結構域III的氨基酸序列一致性分別為69%、98%和42%，進一步構建了AhAhAb雜合蛋白。圖3顯示，雜合蛋白AhAhAb含有了源于Cry1Ah1的結構域I、結構域II，源于Cry1Ab13結構域III；進一步將構建好的重組質粒轉化BL21 Rosetta（DE3）進行誘導表達，結果（圖4）顯示AhAhAb細胞不可溶組分明顯出現約76 kD的目標蛋白條帶，而可溶組分中未檢測到目標蛋白條帶。

圖4 雜合蛋白表達產物的SDS-PAGE分析

2.4 生物活性測定

對AhAhAb蛋白進行了小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲、甜菜夜蛾的殺蟲活性測定，結果（圖5）顯示，雜合蛋白AhAhAb對棉鈴蟲在100 ppm時無發育抑制或致死活性；在高濃度（100 ppm）時對甜菜夜蛾有發育抑制活性，處理組存活的試蟲平均體長為對照組的79%；對小菜蛾活性較低，LC50為10.99 ppm，95% 置信區間為（4.57-23.38）；對玉米螟的活性較低，LC50為13.66 ppm，95% 置信區間為（8.51-27.40），并且主要活性表現為發育抑制，在蛋白濃度為10.00 ppm時，只有7%的試蟲有較好的發育。

圖5 AhAhAb蛋白對甜菜夜蛾發育抑制活性

3 討論

Bt不僅可以殺滅多種農業害蟲，而且其殺蟲活性具有高度的特異性，對非靶標生物安全無害。Bt這種高度特異的殺蟲活性主要由其編碼的Cry蛋白決定的，因此研究Cry蛋白殺蟲特異性及其進化規律對Cry蛋白改良與應用有重要意義。本研究針對鱗翅目害蟲高效的Cry1Ab13與Cry1Ah1開展研究，分析雜合蛋白的殺蟲譜，對理解Cry1A蛋白殺蟲特異性的進化有重要意義。

為了研究Cry蛋白殺蟲機制，目前已有多個殺蟲蛋白（Cry1［13］、Cry2［14］、Cry3［15］、Cry4［16］以及Cry8［17］）的三維結構通過X射線晶體衍射的方法被解析出來，它們的結構非常相似，都有3個結構域。本研究利用同源建模的方法分析Cry1Ab13與Cry1Ah1的結構域I發現，兩者具有相同的碳骨架，但是蛋白表面結構和電荷分布都有所不同，這可以為進一步分析雜合蛋白活性變化的原因提供結構信息依據。

對目前已經明確殺蟲活性蛋白的各結構域進行序列比對聚類發現，部分殺蟲活性多樣性（特別是 Cry類蛋白）可以由結構域III的重組獲得，Cry毒素結構域交換是一種新的殺蟲特異性進化的機制。例如：Cry1Ca和Cry1Cb以及Cry1Ea和Cry1Eb等蛋白的結構域I和II非常相似，而序列分析發現Cry1Ca和Cry1Ea的結構域III有共同的起源，Cry1Cb和Cry1Eb結構域III也由相同的序列變異而來，與Cry1Be的結構域III極為相似。進一步的人工雜合蛋白構建的研究也支持這一結論，一些Cry1蛋白（如Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ba和Cry1Ea）對甜菜夜蛾低或無活性，當它們的結構域III被Cry1Ca取代后，則變得具有活性［18］。此外，進一步的研究認為，結構域I交換會引起殺蟲蛋白在靶標害蟲中腸道細胞形成孔洞大小的不同，不會影響蛋白的殺蟲特異性［19］。本研究涉及的Cry1Ac、Cry1Ab與Cry1Ah蛋白之間也存在結構域交換的情況（Cry1Ab、Cry1Ac有相似的結構域I和II、不同的結構域III；Cry1Ac、Cry1Ah有相似的結構域II和III、不同的結構域I），這些變化沒有影響蛋白對主要農業害蟲小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲的殺蟲譜［20］。本研究構建的雜合蛋白AhAhAb與Cry1Ab相比，有相似的結構域II和III、不同的結構域I，殺蟲活性測定結果顯示，雜合蛋白喪失了對棉鈴蟲的殺蟲活性，改變了對玉米螟活性類型。然而，Cry1Ac與Cry1Ah之間同樣有相似的結構域II和III、不同的結構域I，但是兩者在這3種試蟲的殺蟲譜上卻沒有差異，只是活性強度略有不同。這些數據顯示，3D Cry蛋白殺蟲特異性不僅可能與結構域II、結構域III有關，還有可能與包括結構域I在內的3個結構域的組合有關。本研究數據顯示，盡管Cry1Ah結構域I碳骨架和二級結構其他Cry1A蛋白一致，然而由于氨基酸序列的差異，結構域I的表面基團及電勢分布有較大差異［21］。3D Cry蛋白中3個結構域兩兩之間都有接觸，包括結構域I在內的不同的結構域組合都會影響蛋白結構表面微環境的變化，這些變化可能會對Cry蛋白的性質產生影響。進一步分析雜合蛋白AhAhAb與Cry1Ab、Cry1Ah之間殺蟲活性變化的原因對進一步揭示Cry1A類蛋白殺蟲特異性進化規律有重要意義。

4 結論

本研究針對鱗翅目害蟲具有高活性的Cry1A類蛋白開展研究，構建了Cry1Ab、Cry1Ah的雜合蛋白AhAhAb并測定了殺蟲譜，結果顯示Cry1Ab，Cry1Ah的結構域交換引起蛋白殺蟲譜的顯著變化。

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（責任編輯 狄艷紅）

Creation of Cry1Ab/Cry1Ah Hybrid Proteins and Its Functional Analysis

Xu Man1Jiang Jian2Shu Changlong2Zhang Jie1，2Song Fuping1，2
（1. Northeast Agricultural University，Harbin150030；2. State Key Laboratory of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193）

Cry1A is the most widely used insecticidal protein， and the domain swapping in the reported Cry1A family frequently occurs. In this paper， we investigated the Lepidoptera pests’ highly active protein Cry1Ab and Cry1Ah， and constructed the hybrid protein AhAhAb from Cry1Ab/Cry1Ah and bioassayed the activities. The results showed that the domain swapping of two proteins Cry1Ab and Cry1Ah resulted in the insecticidal activities significantly changed. Compared with the origin proteins， hybrid protein AhAhAb lost the insecticidal activity to Heliothis armigera， caused the insecticidal activity to Ostrinia nubilalis， Plutella xylostella reduced. We then modeled Cry1Ah domain I， and compared the structure and the surface properties with other Cry1A proteins by bioinformatics methods. The results indicated that domain I of Cry1Ah and Cry1Ab had identical carbon skeleton and secondary structure but varied surface and potential distribution. The further studies on the reasons of the activity’s difference between hybrid protein AhAhAb and Cry1Ab or Cry1Ah will give enlightenment for unclosing the evolution pattern of insecticidal specificity of Cry1A family proteins.

Cry1Ah；domain I；insecticidal activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.012

2015-03-06

國家轉基因專項（2014ZX0800912B，2014ZX08009003-001-004）

徐曼，女，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學；E-mail：dianxin5@126.com

宋福平，男，研究員，研究方向：蘇云金芽胞桿菌；E-mail：fpsong@ippcaas.cn