玉竹褐斑病拮抗細(xì)菌的分離篩選和鑒定

畢博孟慶龍包京姍

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林　132109；2.長春市南關(guān)區(qū)中醫(yī)院，長春　130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春　130118）

玉竹褐斑病拮抗細(xì)菌的分離篩選和鑒定

畢博1，2孟慶龍2包京姍3

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林132109；2.長春市南關(guān)區(qū)中醫(yī)院，長春130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春130118）

從吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院藥植園采集的玉竹根際土壤中分離、純化獲得90株細(xì)菌，運(yùn)用平板對峙法篩選出16株對銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）具有較好拮抗作用的菌株。采用生長速率法對抑菌能力最強(qiáng)的G-27菌株進(jìn)行抗菌譜的測定，并進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其對玉竹褐斑病的防治效果。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，G-27菌株發(fā)酵液對銳頂鐮孢菌的抑制率達(dá)87.67%，同時對辣椒疫霉病菌等10種植物病菌也具有較好的抑菌作用，展現(xiàn)了較好的廣譜抑菌作用。盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，G-27對玉竹褐斑病的防治效果為70.01%和71.52%，與農(nóng)藥對照組相比均具有顯著差異（P＜0.05），其20倍稀釋的發(fā)酵液的防效仍能達(dá)到50%以上。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列分析，確定G-27為解淀粉酶芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

玉竹；銳頂鐮孢菌；拮抗；解淀粉酶芽孢桿菌；生物防治

百 合 科 玉 竹［Polygonatum odoratum（Mill.）Druce］為多年生草本植物，可藥食兩用，其功效已被世人所熟知，屬于我國大宗地道性藥材之一［1］。近些年來，伴隨著玉竹相關(guān)研究的不斷深入，玉竹藥材的市場需求量在不斷增加，大面積開采野生玉竹已無法滿足市場的供需平衡，同時野生玉竹資源的不斷減少，破壞了物種的多樣性，引發(fā)了人們的廣泛關(guān)注。為了解決玉竹的市場供需危機(jī)，其人工馴化撫育工作已經(jīng)展開，目前部分分布地區(qū)也已對玉竹實(shí)現(xiàn)了農(nóng)業(yè)化種植養(yǎng)殖生產(chǎn)，逐步成為玉竹原料供應(yīng)的主體［2］。但目前作為影響玉竹藥材安全性的重要因素，植物病害對玉竹的品質(zhì)和產(chǎn)量存在極大的影響。由銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）引起的玉竹褐斑病（Cercospora chinensis Tai）主要危害玉竹的葉片部分，出苗之后即發(fā)病，一般5月中旬至6月下旬為病情流行期，7月上旬以后基本趨于穩(wěn)定。病原菌產(chǎn)生的分生孢子可多次侵染植物葉片，造成早期葉枯而導(dǎo)致規(guī)模性減產(chǎn)［3］。

現(xiàn)階段防治玉竹真菌性病害多從農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治角度出發(fā)，周陽陽等［4］在研究玉竹病害發(fā)生規(guī)律的過程中發(fā)現(xiàn)，有機(jī)硫類和唑類殺菌劑防治玉竹褐斑病效果最優(yōu)；賈秀梅［5］認(rèn)為合理運(yùn)用50%多菌靈500倍稀釋液并結(jié)合常規(guī)的農(nóng)業(yè)防治辦法可以有效防治玉竹褐斑病；也有研究者認(rèn)為，防治玉竹褐斑病預(yù)防尤為主要，在發(fā)病前噴灑波爾多液或代森銨藥劑對于防治病害的發(fā)生具有關(guān)鍵性作用［6］。長期施加化學(xué)農(nóng)藥對土壤的微生態(tài)環(huán)境存在不利影響［7］，并且加重環(huán)境污染，也使有毒物質(zhì)在植物體內(nèi)積累［8］，降低玉竹的使用安全性和商品價值。目前對于藥用植物病害的防治，國內(nèi)外研究者已經(jīng)將目光轉(zhuǎn)向生物防治，由于其具備綠色、安全、有效的特點(diǎn)，因此也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一［9，10］。為此，本研究以銳頂鐮孢菌作為靶標(biāo)菌，從玉竹根際土壤中分離篩選防治效果較好的細(xì)菌，旨在為開發(fā)利用土壤微生物資源和綜合防治玉竹褐斑病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院藥植實(shí)驗(yàn)室提供；13種植物病原菌由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基［11］馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂22 g，pH7.0。牛肉膏蛋白胨（NB）固體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，pH7.0-7.2；NB培養(yǎng)液：配方同上但不添加瓊脂。BPY［Beef extract-Prptone-Yeast extract（Medium）］發(fā)酵液：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖5 g， NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH6.8。

1.1.3 主要試劑和儀器 50%多菌靈（吉林市綠盛農(nóng)藥化工有限公司），DNA Marker和PCR擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa公司），PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工），細(xì)菌通用引物（長春聯(lián)星生物技術(shù)有限公司合成），其他常規(guī)分析純試劑購自北京化工廠等。UV-1700型紫外/可見分光光度計（SHIMADZU），GAPS-9700型 PCR儀（AB App lied Biosystems），HPG-320H型人工氣候箱（哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司），DYCP-31DN水平電泳儀（北京市六一儀器廠），GIS-2010型凝膠成相系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 土壤細(xì)菌菌株的分離、純化、保存 運(yùn)用五點(diǎn)采樣法，從吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院藥植園采集玉竹根際土樣若干，土壤經(jīng)風(fēng)干后過20目篩備用。稱取樣品10 g，將其裝入含有90 mL去離子無菌水的三角瓶中，充分振蕩30 min，混勻后靜置5 min。無菌條件下取1 mL上清液，加入9 mL 0.05%十二烷基苯磺酸鈉液，于恒溫箱30℃保溫10 min后取液1 mL，加入9 mL無菌水，按10-3、10-4和10-5梯度制成稀釋液。分別吸取100 μL各稀釋液，涂布于NB平板上，每處理3次重復(fù)，置于人工氣候箱內(nèi)32℃培養(yǎng) 24 h。菌株純化、編號，4℃保藏備用。

1.2.2 發(fā)酵液制備 將4塊直徑為8 mm的細(xì)菌菌餅接入含無菌 NB培養(yǎng)液的錐形瓶（裝液量100 mL/250 mL），190 r/min，30℃振蕩培養(yǎng)24 h；取2% NB種子液接入含有無菌 BPY發(fā)酵液的三角瓶（裝液量50 mL/200 mL），185 r/min，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，所得BPY菌株發(fā)酵液（如下簡稱BPY）保存?zhèn)溆谩Ｈ缟习l(fā)酵液均調(diào)至含菌量約為108CFU/mL。

1.2.3 拮抗菌株的活性測定

1.2.3.1 初篩 采用濾紙片法［12］，每處理3個重復(fù)，以不接供試細(xì)菌為對照，30℃培養(yǎng)6-7 d后待對照組菌落長滿平板，測量處理菌落直徑。計算抑制率，從中選取抑制率較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3.2 復(fù)篩 將初篩得到的菌株制備NB種子液后，以5%接種量接種到BPY中（裝液量50 mL/200 mL），34℃、185 r/min搖床培養(yǎng)24 h，所得發(fā)酵液備用。采用牛津杯法［13］，每處理3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)7 d后測量處理菌落直徑并計算其抑菌率。

1.2.3.3 抑菌譜測定 用生長速率法［14］對活性菌株進(jìn)行抑菌譜測定。

抑菌率（%）=［（A-B）/（A-8）］×100%其中，A為病原菌正常生長直徑，B為被拮抗后病原菌直徑，數(shù)字為病原菌菌餅直徑。

1.2.4 室外盆栽防病試驗(yàn)

1.2.4.1 盆栽方法 采用盆缽種植方式，將營養(yǎng)土：蛭石按照3∶1體積比配制基質(zhì)填裝于15 cm×20 cm育苗盆缽中。取當(dāng)年生粗壯玉竹分支，將其表面消毒洗凈（50℃水中浸泡5 min）后浸泡于預(yù)先配置好的菌株發(fā)酵液（菌量約為108CFU/mL）中，25-30 min后取出移栽于裝有育苗土的花盆中，每盆4株，5盆1組，每組3次重復(fù)。定苗后進(jìn)行灌根接種。

1.2.4.2 防病測定 保護(hù)作用測定：在玉竹苗根莖部分別灌澆10 mL BPY發(fā)酵液，24 h后接種10 mL銳頂鐮孢菌孢子懸浮液（5×104孢子/mL）；治療作用測定：先接種銳頂鐮孢菌孢子懸浮液10 mL，24 h 后再灌注等量BPY菌株發(fā)酵液。藥劑對照為50%多菌靈500倍液，空白對照為清水，每處理重復(fù)3次。接種病菌 25-30 d后調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)和防治效果。

玉竹褐斑病發(fā)病程度參考郭巧生［15］的方法分為5級。0級：未發(fā)病；1級：病斑面積占總?cè)~面積10%以下；2級：病斑面積占總?cè)~面積11%-20%；3級：病斑面積占總?cè)~面積21%-40%；4級：病斑面積占總?cè)~面積41%-60%；5級：病斑面積占總?cè)~面積60%以上。病情參數(shù)和防效分別按照下列公式計算［16］：

病情參數(shù)=［∑（病級植株數(shù)×代表值）/（總植株數(shù)×最高病級代表值）］×100

防效（%）=（對照病情參數(shù)-處理病情參數(shù)）/對照病情參數(shù)×100%。

1.2.5 菌株鑒定

1.2.5.1 菌落形態(tài)與生理生化試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法參閱《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［17］。對劃線于固體培養(yǎng)基的菌株進(jìn)行表態(tài)觀察，并通過革蘭氏染色觀察菌株個體形態(tài)特征。生理生化實(shí)驗(yàn)包括：硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、耐鹽性培養(yǎng)（2 %、5%、7%和10%）、運(yùn)動性、接觸酶反應(yīng)、明膠液化、淀粉水解、檸檬酸鈉鹽利用、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)（V-P反應(yīng)）、碳水化合物利用（D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇）。

1.2.5.2 16S rDNA基因序列分析 PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA序列［18，19］，通用引物［20］為16S1F和16S1R。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）為：基因組DNA 2 μL、dNTP（10 mmol/L）2 μL、10×Buffer 5 μL、16S1F 2 μL、16S1R 2 μL、Taq酶（2.5 U/μL）2 μL、雙蒸水35 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，58℃ 30 s，70℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。純化后的 PCR 產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。序列登陸GenBank獲得登錄號并且進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用Clustal X［21］進(jìn)行多重比對后，利用MEGA5.1軟件以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用 DPS 9.50標(biāo)準(zhǔn)版統(tǒng)計處理原始數(shù)據(jù)，Duncan氏新復(fù)極差法分析差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及拮抗菌株的篩選

從玉竹的根際土壤中共分離得到細(xì)菌90株。運(yùn)用平板對峙法，以銳頂鐮孢菌為標(biāo)靶菌株，測定供試細(xì)菌對病原真菌的拮抗能力。其中8株細(xì)菌對銳頂鐮孢菌的抑制率在50% 以上，菌株G-27和G-36抑制率均在70% 以上，G-27的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌率高達(dá)87.67%（圖1），經(jīng)過多次驗(yàn)證后其抑菌效果仍然較為穩(wěn)定（表1）。

圖1 G-27對銳頂鐮孢菌拮抗抑制效果

2.2 菌株G-27的抑菌譜

菌株G-27對16種致病菌的拮抗結(jié)果表明，G-27對南瓜枯萎病菌、稻瘟病菌、楊樹潰瘍病菌等5種病原菌無明顯抑制作用，對油菜菌核病菌等4種供試真菌的抑制作用小于50%，對銳頂鐮孢菌、辣椒疫霉病菌、玉米小斑病菌等7種病原菌的抑制作用為 52%-87%，其中對銳頂鐮孢菌的抑制作用為87.67%，說明菌株G-27的抑菌譜較寬（表2）。

表1 細(xì)菌對銳頂鐮孢菌生長的抑制作用

表2 菌株G-27對病原真菌的抑制作用

2.3 菌株G-27對玉竹褐斑病的盆栽防效

結(jié)果顯示，G-27菌株 BPY發(fā)酵液對玉竹褐斑病的保護(hù)及治療作用分別為 70.01%和71.52%，10倍和20倍菌株發(fā)酵稀釋液的保護(hù)和治療作用分別可達(dá)66%和60% 以上，顯著性差異結(jié)果（表3）顯示，菌株G-27發(fā)酵液處理對玉竹褐斑病的防治優(yōu)于農(nóng)藥組（P＜0.05）。

表3 菌株G-27對玉竹褐斑病的防治效果

2.4 菌株G-27的形態(tài)學(xué)特征及理化特性

形態(tài)觀察結(jié)果顯示，G-27菌落不規(guī)則，邊緣不整齊、乳黃色、中心隆起、表面較濕潤、半透明。鏡檢呈桿狀，大小為（0.4-0.5）×（2.5-2.7）μm，具鞭毛，G+，有芽孢，具有典型的芽孢桿菌特征（表4）。

表4 生防菌G-27理化特征

菌株G-27可在20-35℃的溫度下生長，其最適生長溫度為30℃。其生長pH范圍為6.5-7.5，最適生長pH為7.0。菌株G-27屬需氧生長；硝酸鹽還原反應(yīng)生成紅色化合物；接觸酶測定為陰性；脂肪酶反應(yīng)為陽性；酪蛋白、酪氨酸反應(yīng)呈陰性；能利用D-葡萄糖、D-木糖；淀粉水解實(shí)驗(yàn)鏡檢有糊精生成；明膠液化呈陽性；檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基呈酸性（綠色）；VP（pH7.0）測定生成紅色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇呈陰性；在加入5%-10%的NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上均能生長。由此說明菌株G-27的生理生化特性與芽孢桿屬菌較為接近（表5）。

2.5 16S rDNA序列分析

經(jīng)16S rDNA測序分析，擴(kuò)增后菌株G-27的序列長度為1 475 bp，將這一序列提交至GenBank 后，獲得注冊號KC511118。將G-27的16S rDNA 序列進(jìn)行BLAST比對后結(jié)果顯示，與報道菌種解淀粉酶芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens strain BCRC 11601（登錄號NR_116022.1）的相似性為99%；以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖2）顯示，G-27菌株與B. amyloliquefaciens（登錄號FN597644.1）處于同一分支，相似性達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征結(jié)果，菌株G-27可鑒定為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens。

圖2 菌株G-27的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

植物的體內(nèi)、體表及根莖葉等部位都存在病原菌和對植物有益的腐生微生物系統(tǒng)，它們之間存在著拮抗、寄生和競爭等各種各樣的關(guān)系［8］。而目前國內(nèi)外對于植物病害生物防治的相關(guān)研究工作，均是基于植物腐生微生物與病原菌之間的相互關(guān)系這一原理展開的，其中通過人工分離篩選的辦法從自然生境獲取生防菌源是實(shí)現(xiàn)生物防治的重要一環(huán)。普遍認(rèn)為用作防治植物病害的理想生防菌源應(yīng)具備如下特點(diǎn)［22］：（1）可強(qiáng)烈抑制或破壞病原菌生長和繁殖；（2）具備多種防病機(jī)制；（3）特異性明顯，對包括動植物及有益微生物的非標(biāo)靶生物不存在傷害；（4）規(guī)定濃度下可以將病害控制在允許范圍內(nèi)；（5）具備實(shí)際市場應(yīng)用性。

細(xì)菌作為生防菌防治植物病害主要是利用其強(qiáng)力的競爭機(jī)制，其中芽孢桿屬（Bacillus spp.）細(xì)菌由于具有抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用作生防菌源。李德全等［23］應(yīng)用枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 916菌株防治大田水稻紋枯病效果顯著；秦娟娟等［24］利用枯草芽孢桿菌（B. subtilis）研制的固態(tài)菌劑對辣椒疫病的防治效果顯著；國外利用短小芽孢桿菌（B. pumilis）防治植物病害也起到了較好的效果［10］。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了解淀粉酶芽孢桿菌B. amyloliquefaciens G-27對銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）具有明顯的抑菌效果，抑菌率高達(dá)87.67%，抗菌譜實(shí)驗(yàn)證明其對多種植物病害具有一定拮抗抑制作用，拮抗廣譜性強(qiáng)；對玉竹褐斑病的盆栽實(shí)驗(yàn)顯示，施加B.amyloliquefaciens G-27菌株發(fā)酵液對玉竹褐斑病的防病效果優(yōu)于農(nóng)藥對照組（P＜0.05），保護(hù)和治療作用效果分別為70.01%和71.52%，以拮抗細(xì)菌發(fā)酵液代替常用化學(xué)農(nóng)藥，顯著降低了植株的病情指數(shù)，取得了良好效果。Bacon等［25］認(rèn)為，芽孢桿屬菌株分泌的抗生素、生物素等次生代謝產(chǎn)物也是體現(xiàn)其防病作用的重要機(jī)制，有關(guān)B. amyloliquefaciens G-27產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)分離純化及其抗菌物質(zhì)的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究，其實(shí)際應(yīng)用價值也仍需進(jìn)行大田試驗(yàn)后方能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過對玉竹根際土壤中細(xì)菌進(jìn)行分離、初篩和復(fù)篩，獲得1株對銳頂鐮孢菌的菌絲生長具有較強(qiáng)抑制活性的細(xì)菌菌株G-27，其抑制率為87.67%；其對辣椒疫霉病菌、玉米小斑病菌等11株植物病原菌同樣具有拮抗抑制作用，具備廣譜抑菌能力。菌株G-27發(fā)酵液對玉竹褐斑病的防病效果優(yōu)于農(nóng)藥對照組（P＜0.05），保護(hù)和治療作用效果分別為70.01%和71.52%。利用傳統(tǒng)分類方法和16S rDNA序列測定對菌株進(jìn)行了鑒定，將菌株G-27鑒定為解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens。

［1］ 國家藥典委員會. 中國藥典：一部［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：57-58.

［2］ 彭秧錫， 劉士軍， 郭軍， 等. 玉竹的研究開發(fā)現(xiàn)狀與展望［J］.食品研究與開發(fā)， 2005， 26（6）：120-122.

［3］ 吳社高， 吳明志. 玉竹病害種類及藥劑防治技術(shù)［J］. 中國植保導(dǎo)刊， 2005， 25（2）：27-28.

［4］ 周陽陽， 楊洪一. 玉竹銳頂鐮孢菌的生物學(xué)特性及藥劑防治［J］.中國農(nóng)學(xué)通報， 2010， 26（9）：315-318.

［5］ 賈秀梅. 玉竹常見病害的發(fā)生及綜合防治［J］. 特種經(jīng)濟(jì)動植物，2011（10）：51-52.

［6］ 常紀(jì)良. 玉竹主要病蟲害及綜合防治措施［J］. 特種經(jīng)濟(jì)動植物，2008（5）：52.

［7］ Kalia A， Gosal SK. Effect of pesticide app lication on soil microorganisms［J］. Archives of Agronomy and Soil Science，2011， 57（6）：569-596.

［8］吳敏. 農(nóng)藥污染對土壤的影響及防治措施［J］. 耕作與栽培，2003（6）：49-50.

［9］Matar SM， El-Kazzaz SA， Wagih EE， et al. Antagonistic and inhibitory effect of Bacillus subtilis against certain plant pathogenic fungi， I［J］. Biotechnology， 2009， 8（1）：53-61.

［10］Akhtar MS， Shakeel U， Siddiqui ZA. Biocontrol of Fusarium wilt by Bacillus pumilus， Pseudomonas alcaligenes， and Rhizobium sp. on lentil［J］. Turk J Biol， 2010， 34（1）：1-7.

［11］方中達(dá). 植病研究方法［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998.

［12］單文榮， 李俊霞， 劉花粉. 濾紙片法篩選不同活性物對棉花黃萎病菌抑制效果研究［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2010， 26（19）：285-289.

［13］賈鳳安， 陳亮， 陳立， 等. 大棚甜瓜三種主要真菌病害拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定［J］. 植物保護(hù)學(xué)報， 2010（6）：505-510.

［14］王彩霞， 張清明， 李桂舫， 等. 蘋果樹腐爛病拮抗細(xì)菌菌株BJ1的鑒定及其抑菌作用［J］. 植物保護(hù)學(xué)報， 2012， 39（5）：431-437.

［15］郭巧生. 藥用植物栽培學(xué)［D］. 北京：高等教育出版社，2009.

［16］楊信東， 高潔， 馬貴龍， 等. 植物病害疫情控制效果計算公式的改進(jìn)［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 1999， 21（3）：46-48.

［17］東秀珠， 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［D］. 北京：科學(xué)出版社， 2001.

［18］Marshall SM， Melito PL， Woodward DL， et al. Rapid identification of Campylobacter， Arcobacter， and Helicobacter isolates by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the 16S rRNA gene［J］. J Clin Microbiol， 1999， 37（12）：4158-4160.

［19］Lim CY， Lee KH， Cho MJ， et al. Detection of Helicobacter pylori in gastric mucosa of patients with gastroduodenal diseases by PCR-restriction analysis using the RNA polymerase gene（rpoB）［J］. Journal of Clinical Microbiology， 2003， 41：3387-3391.

［20］劉瑋琦， 茆振川， 楊宇紅， 等. 應(yīng)用16S rRNA 基因文庫技術(shù)分析土壤細(xì)菌群落的多樣性［J］. 微生物學(xué)報， 2008， 48（10）：1344-1350.

［21］Thompson JD， Gibson TJ， Plewniak F， et al. The CLUSTAL_ X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］. Nucleic Acids Research， 1997， 25：4876-4882.

［22］Wood RKS， Tveit M. Control of plant diseases by use of antagonistic organisms［J］. Tveit Botanical Review， 1955， 21（8）：441-492.

［23］李德全， 陳志誼， 劉永鋒， 等. 生防菌Bs-916離子注入突變高效菌株篩選及抑菌防病效果［J］. 植物保護(hù)學(xué)報， 2006， 33（2）：141-145.

［24］秦娟娟， 閆淑珍， 劉佳. 植物內(nèi)生細(xì)菌固體菌劑對辣椒的促生和防病作用［J］. 植物保護(hù)學(xué)報， 2010， 37（4）：325-330.

［25］Bacon CW， Yates IE， Hinton DM， et al. Biological control of Fusarium moniliform in maize［J］. Environ， Health Perspect，2001， 109（suppl. 2）：325-332.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation，Screening and Identification of Bacteria Antagonistic to Cercospora chinensis

Bi Bo1，2Meng Qinglong2Bao Jingshan3
（1. Jilin Agriculture Science and Technology University，Jilin132109；2. Traditional Medicine Hospital of Nanguan District，Changchun 130118；3. College of Chinese Medicines，Jilin Agricultural University，Changchun130118）

Using the plate confrontation assay， 16 strains with antagonistic effects on Fusarium acuminatum were screened from 90 bacteria isolated from the rhizosphere of Polygonatum odoratum growing in medicinal garden of Jilin Agriculture Science and Technology University. The growth speed rate method was used for measuring the antimicrobial spectrum of G-27 owing the optimal bacteriostasis in vitro， and pot trails were carried out to assess its control effect to Cercospora chinensis in vivo. The results indicated that the inhibition rate of strain G-27 fermentation broth to F. acuminatum was 87.67%. Additionally， it had promising antimicrobial effect to over 10 kinds of plant pathogens， for example， Phytophora capsici， indicating it had broad-spectrum antimicrobial effects. The strain G-27 had significant control efficacy（P＜0.05）compared with the pesticides treatments， and the protective and the therapeutic efficacy of the aseptic filtrate of G-27 reached 70.01% and 71.52% with no dilution， even control efficacy of the 20 times dilution of fermentation broth exceeded 50% in pot trails. According to morphologic， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， strain G-27 was identified as Bacillus amyloliquefaciens.

Polygonatum odoratum；Fusarium acuminatum；antagonistics；Bacillus amyloliquefaciens；bio-control

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.021

2015-01-27

吉林省教育廳“十二五”科研規(guī)劃資助項(xiàng)目［教科合字（2012）301號］

畢博，男，博士研究生，講師，研究方向：藥用植物栽培；E-mail：17470823@qq.com

包京姍，女，研究方向：藥用植物栽培；E-mail：baojingshan@163.com