吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸對人鼻咽癌C N E-2Z細胞增殖及其細胞核抗原表達的影響

向銀洲　彭　平　許　軍　章松勤　寧　娜

三峽大學人民醫院宜昌市第一人民醫院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000

吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸對人鼻咽癌C N E-2Z細胞增殖及其細胞核抗原表達的影響

向銀洲彭平許軍章松勤寧娜

三峽大學人民醫院宜昌市第一人民醫院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000

目的研究核轉錄因子-κB（NF-κB）特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸（PDTC）對人鼻咽癌CNE-2Z細胞生長增殖及其細胞核抗原（PCNA）的影響。方法不同濃度的PDTC（25、50、100 μmol/L）作用CNE-2Z細胞不同時間后（24、48、72 h），四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測PDTC對CNE-2Z細胞增殖的抑制效應；不同濃度的PDTC（25、50、100 μmol/L）作用于CNE-2Z細胞48 h后，流式細胞術（FCM）分析細胞周期，免疫組化（SP）法檢測不同強度PDTC作用下CNE-2Z細胞增殖細胞核抗原（PCNA）的表達情況。結果25、50、100 μmol/L PDTC處理的CNE-2Z細胞增殖活性明顯受到抑制（P＜0.05），并呈時間和劑量依賴；流式細胞術結果表明S期細胞數減少，細胞受阻于G0/G1期。與對照（無PDTC處理）比較，PDTC作用后CNE-2Z細胞PCNA表達降低（P＜0.05），并呈明顯的劑量依賴。結論PDTC具有顯著抑制人鼻咽癌CNE-2Z細胞生長的作用，是一種有潛力的抑制鼻咽癌細胞增殖的藥物。

人鼻咽癌CNE-2Z細胞；吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸；核轉錄因子-κB；增殖細胞核抗原

鼻咽癌是我國南方地區常見的頭頸部惡性腫瘤，治療以放射治療為主，目前早期鼻咽癌患者3年生存率約為90%，5年生存率為78%左右；但晚期患者生存率仍不樂觀，絕大多數患者死于腫瘤的局部復發和遠處轉移，5年生存率一直徘徊在40%左右［1］。因此在提高放療水平的同時，積極探討化學藥物治療尤為重要。核轉錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）在許多生理、病理過程中發揮著基因調控作用，如炎性反應、免疫應答、細胞增殖與凋亡等，腫瘤的發生、侵襲、轉移等過程也與NF-κB密切相關，NF-κB是一類極其重要的多功能核轉錄因子［2］。NF-κB特異性抑制劑近年在腫瘤防治中的作用受到廣泛關注，其作用機制可能是通過抑制核轉錄因子NF-κB的活化，從而間接抑制下游相關基因的表達，達到抑制腫瘤細胞的生長增殖、侵襲與轉移。本實驗中選用NF-κB的特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）作為干預因素，作用于人鼻咽癌CNE-2Z細胞，觀察PDTC對CNE-2Z細胞生長增殖及PCNA表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人鼻咽癌CNE-2Z細胞株由第三軍醫大學腫瘤研究所中心實驗室提供。胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限責任公司；DAB顯色試劑盒與SP-9000免疫組織化學試劑盒購自武漢百奧斯生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）顯色劑購于上海生物工程有限責任公司；RNA酶（RNase）、PDTC分析純、碘化丙啶（PI）、二甲基亞砜（DMSO）、RPMI1640培養基、胰蛋白酶等分別購于Hyclone、Sigma、Amresco公司。

1.2CNE-2Z細胞的培養

復蘇人鼻咽癌細胞株CNE-2Z，將復蘇后的細胞接種于100 mL培養瓶中，加入含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液，放置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的恒溫培養箱中培養。常規更換培養液，進行正常傳代，選取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3CNE-2Z細胞形態學觀察

隨機在倒置顯微鏡下選取3個視野，觀察不同濃度PDTC（濃度分別為25、50、100 μmol/L）作用于CNE-2Z細胞不同時間點（24、48、72 h）的形態學變化。CNE-2Z細胞以5×104/mL濃度接種于預置蓋玻片的6孔板中，然后每孔中滴加1 mL細胞懸液，再加入適量含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液，于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的恒溫培養箱中培養，細胞貼壁生長后分為4組，分別滴加含PDTC（25、50、100 μmol/L）的培養液；設未加PDTC為對照，繼續培養72 h后，去除培養液，用PBS洗滌3次，加入95%的乙醇室溫下固定30 min，取出蓋玻片，常規HE染色，透明樹脂封片，自然晾干，光鏡下觀察細胞形態。

1.4四甲基偶氮唑藍比色法檢測PDTC對CNE-2Z細胞生長增殖的抑制作用

采用對數生長期的CNE-2Z細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，調整細胞懸液濃度為5×104/mL，每孔200 μL接種于96孔板上，同時設空白對照組、正常對照組（不含藥物）和PDTC不同濃度藥物處理組（分別為25、50、100 μmol/L），每組重復4孔，于37℃、5% CO2、飽和濕度恒溫箱中培養24 h后，吸去每孔培養液，實驗組分別滴加含不同濃度PDTC培養液，繼續培養24、48、72 h，再每孔滴加20 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h后吸去上清液，每孔滴加150 μl DMSO液，遮光振蕩10～20 min，使其溶解，用Quant酶標儀570 nm波長檢測各孔吸光度（A570），只加RPMI-1640、未接種細胞的空白對照調零。每組實驗重復3次，取平均值。計算不同濃度PDTC對CNE-2Z細胞增殖的抑制率。細胞抑制率=（1-藥物處理組吸光度/陰性對照組吸光度）×100%［3］。

1.5CNE-2Z細胞周期分析

采用流式細胞儀（FCM）檢測細胞周期.選取對數生長期CNE-2Z細胞，輕輕吹打，調整細胞濃度為1×105/mL，將細胞接種于100 mL培養瓶中，加入適量含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液，在37℃、飽和濕度、5%二氧化碳的孵箱中培養24 h，待細胞生長至70%～80%融合時，更換為含PDTC為25、50、100 μmol/L的培養液，設對照，繼續培養48 h后吸去培養液，用胰蛋白酶消化、收集細胞，PBS沖洗3次，用預冷的70%冰乙醇固定，置4℃冰箱過夜，吸去乙醇，PBS沖洗3次，調整細胞濃度為1×106/mL，加入RNase酶（20 μg/mL）200 μL消化30 min，加入碘化丙啶（20 μg/mL）1 mL，于室溫遮光染色30 min，上流式細胞儀檢測，每組重復3次，Cell Quest及Modifit軟件分析細胞周期分布。

1.6免疫組化法檢測PDTC作用下CNE-2Z細胞PCNA的表達

選取對數生長期CNE-2Z細胞，制成5.0×104/mL濃度細胞懸液，每孔2 mL接種于預置蓋玻片的6孔板中，放入37℃、飽和濕度、5%二氧化碳的恒溫箱中培養24 h，更換無血清RPMI1640培養液繼續培養24 h，去除培養液，實驗組中分別滴加濃度為25、50、100 μmol/L含PDTC的培養液，對照組滴加含10%滅活胎牛血清RPMI 1640培養液，每孔2 mL。培養48 h后吸去各孔培養液，0.01 mmol/L PBS液洗滌3次，再以乙酸-甲醛溶液（濃甲醛10 mL，冰乙酸3 mL，0.9%的氯化鈉溶液加至100 mL）固定10 min。采用SP染色檢測CNE-2Z細胞中PCNA的表達，操作按說明書步驟進行，然后用DAB染色盒染色，晾干，透明樹膠封片，光鏡下觀察CNE-2Z細胞PCNA表達。CNE-2Z細胞中PCNA陽性表達標準為細胞核中可見棕黃色顆粒。HSCORE評分：排除爬片邊沿細胞，在低倍鏡下隨機選取細胞分布均勻的視野10個，然后在高倍鏡下每個視野隨機選擇50個細胞，根據細胞核著色深淺進行PCNA蛋白表達評分：①陰性：0分，胞核不著色；②弱陽性：1分，胞核呈淡黃色；③陽性：2分，胞核呈黃色；④強陽性：3分，胞核呈深棕色。根據公式HSCORE=ΣPi（i+1）（i=0，1，2，3；Pi表示評分為i的比例）計算細胞HSCORE得分［4］。

1.7統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CNE-2Z細胞形態學觀察

倒置顯微鏡觀察細胞貼壁生長24 h后，可見CNE-2Z細胞形態呈多角形，胞體透亮，細胞輪廓清晰，折光性強，胞核大而深染，核仁明顯，可見巨核和多核細胞（圖1，封四）。加入PDTC作用后，CNE-2Z細胞的貼壁性下降，細胞皺褶增多，形態逐漸由多角形變為圓形，細胞間隙增寬；細胞結構變得模糊不清，部分細胞明顯水腫，胞漿濃縮，胞核聚集，甚至細胞破碎，可見細胞碎片。隨著PDTC濃度的增加和作用時段的延長，較多細胞懸浮于培養瓶中（圖2，封四）。HE染色光鏡觀察，PDTC作用后，CNE-2Z細胞數量顯著減少，細胞形態變為不規則形，細胞核空染，隨PDTC濃度增高，CNE-2Z細胞死亡增加。

2.2不同濃度PDTC處理后CNE-2Z細胞增殖的抑制率

不同濃度PDTC處理的CNE-2Z細胞增殖活性明顯受到抑制（P＜0.05），并呈時間和劑量依賴。見表1。

表1　不同濃度PDTC處理后CNE-2Z細胞增殖的抑制率（n=4，%，±s）

表1　不同濃度PDTC處理后CNE-2Z細胞增殖的抑制率（n=4，%，±s）

注：與對照同時間比較，aP＜0.05；與25 μmol/L比較，bP＜0.05；與50 μmol/L比較，cP＜0.05；與同組24 h比較，dP＜0.05；與同組48 h比較，eP＜0.05；PDTC：吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸

PDTC濃度（μmol/L）24 h48 h72 hP值0（對照）25 50 100 P值0 0 0-19.54±3.47a26.64±2.78ab37.59±3.19ac＜0.05 30.23±4.12ad37.24±4.53abd47.50±4.05acd＜0.05 34.20±3.21ae44.15±3.08abe59.47±2.89ace＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 -

2.3不同濃度PDTC對CNE-2Z細胞周期的影響

不同濃度PDTC作用24 h后，隨著藥物濃度增加，S期細胞所占比例逐漸下降（P＜0.05），G0/G1期細胞所占比例逐漸增高（P＜0.05），細胞主要呈現G0/G1期阻滯。見表2。

表2　不同濃度PDTC對CNE-2Z細胞周期的影響（n=4，%，±s）

表2　不同濃度PDTC對CNE-2Z細胞周期的影響（n=4，%，±s）

注：與對照比較，**P＜0.05

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2.4不同濃度PDTC作用于CNE-2Z細胞后PCNA蛋白的表達

對數期生長的CNE-2Z細胞，可見細胞核有明顯棕色或棕黃色顆粒著色，PCNA蛋白表達強陽性（圖3，封四）。PDTC作用后，CNE-2Z細胞胞核棕黃色顆粒減少，隨著PDTC濃度增高，細胞核棕黃色顆粒顏色變淺（圖4，封四），表明PCNA表達減弱。不同濃度的PDTC（0、25、50、100 μmol/L）作用48 h后，PCNA蛋白的表達評分為（2.92±0.10）、（2.22±0.18）、（1.45± 0.22）、（1.02±0.15）分，隨著PDTC濃度增高，PCNA蛋白的表達評分逐步降低（P＜0.05），呈現一定的劑量依賴。

3　討論

NF-κB是一種重要的多功能核轉錄因子，是由P65和P50構成的雜二聚體，在人體的應激、免疫應答、炎性反應等方面以及腫瘤的形成、侵襲、擴散等方面發揮著重要的基因調控作用。研究發現NF-κB能夠顯著促進腫瘤細胞生長增殖，抑制細胞凋亡，其抗凋亡機制極可能是通過調控其靶基因相關因子，如腫瘤壞死因子、集落刺激因子、白介素-1、白介素-2等，使NF-κB過度表達，導致腫瘤細胞無限制生長，出現細胞增殖，細胞凋亡減少，促使腫瘤發生、侵襲和擴散［5］. NF-κB還可以通過直接干擾與細胞周期相關的因子如IL-2等，使細胞的DNA合成異常加速，從而導致腫瘤細胞增殖而形成腫瘤［6］。有研究發現PDTC和順鉑在體外聯合應用后，對人鼻咽癌細胞株CNE-2Z抑制效應增加，中效濃度比單用藥要小，這說明PDTC可能具備化療增敏作用［7］。

PCNA是一種分子量為36 kD的蛋白質，是DNA復制時聚合酶δ的輔助蛋白，在細胞核內合成，并存在于細胞核內。PCNA影響著細胞的增殖周期，在細胞DNA合成、細胞有絲分裂中發揮著重要作用。PCNA存在可溶性和不溶性兩種，不溶性PCNA可以在DNA復制中起作用，同時調控細胞增殖及細胞周期，研究發現其在G0/G1期細胞中表達不明顯，在G1晚期，其表達顯著增加，S期表達達最高峰，G2/M期則明顯下降［8］。PCNA表達的量的變化與DNA合成一致，其在細胞核內陽性表達的強弱與細胞增殖活性密切相關，其活性越高，細胞與細胞間張力越大，黏附性越小，容易促使腫瘤細胞向遠處轉移、侵襲和擴散。因此PCNA的表達強度可以比較客觀地反映腫瘤細胞的增殖活性，是一種能夠準確、簡便評估腫瘤細胞增殖能力的重要指標［9］。

NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸（PDTC）是一種強抗氧化劑，能夠特異性抑制多種腫瘤細胞NF-κB的活化，其作用機制主要為：①NF-κB活性亞單位P65的表達能夠被特異性抑制；②可能通過抑制NF-κB抑制蛋白（IκB）的降解，從而減少了NF-κB的核移位［10］。江從軍等［11］研究發現，特異性阻斷NF-κB的活化可顯著抑制體外實體瘤細胞的生長，腫瘤的發生率大大降低。Gao等［12］研究發現NF-κB抑制劑PDTC通過可下調血管內皮因子（VEGF）的表達，減少路易斯肺癌小鼠腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的形成；Li等［13］發現NF-κB信號途徑與視網膜細胞瘤的生物學行為也有關系。研究發現PDTC對腎癌、肝癌、喉癌細胞有顯著的抑制作用［14-16］；對胃癌、白血病、宮頸癌細胞有明顯抑制生長作用［17-19］，對人鼻咽癌細胞的轉移與預后也有較大影響［20］。

本研究中采用NF-κB特異性抑制劑PDTC以不同濃度作用于人鼻咽癌CNE-2Z細胞后，發現PDTC能顯著抑制CNE-2Z細胞生長增殖，表現為細胞黏附性下降，細胞間隙增寬，部分細胞胞核聚集，胞質濃縮，甚至出現細胞碎裂。在增加PDTC濃度和延長作用時間后，大量細胞懸浮于培養瓶中。HE染色結果顯示，PDTC干預后，CNE-2Z細胞數量明顯減少，形態變為圓形或橢圓形，細胞內出現大顆粒物質及空泡；隨著PDTC濃度遞增，死亡細胞明顯增多。MTT試驗表明，CNE-2Z細胞的增殖代謝能夠顯著地被PDTC抑制，同時也具有一定的劑量和時間依賴。經PDTC作用24 h后，分析CNE-2Z細胞的周期，發現與對照細胞相比，PDTC作用的細胞G2/M期和S期細胞明顯減少（P＜0.05），而G0/G1期細胞顯著增多（P＜0.05），CNE-2Z細胞生長過程明顯受阻于G0/G1期。免疫組化結果顯示，PDTC作用于CNE-2Z細胞后，PCNA蛋白表達下降，濃度越高，細胞核著色越淺。

綜上所述，PDTC能顯著抑制人鼻咽癌CNE-2Z細胞生長增殖，其機制可能是PDTC阻斷NF-κB活化，下調PCNA表達，抑制細胞DNA合成和有絲分裂，減少細胞的生長增殖；改變細胞周期分布，使CNE-2Z細胞受阻于G0/G1期等，促進細胞凋亡，抑制了CNE-2Z細胞生長增殖。PDTC在腫瘤生長增殖方面的作用，使其可能成為腫瘤治療的新靶點。

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Effects of pyrrolidine dithiocarbamate on proliferation and nuclear antigen expression of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z

XIANG YinzhouPENG PingXU JunZHANG SongqinNING Na
Department of Otolaryngology，the People's Hospital of China Three Gorges University the First People's Hospital of Yichang City，Hubei Province，Yichang443000，China

Objective To explore the effects of pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC），a specific inhibitor of NF-κB on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z and its effect on proliferation cell nuclear antigen（PCNA）expression.Methods CNE-2Z cells were respectively treated with different concentration（25，50，100 μmol/L）PDTC and different time（24，48，72 h）.The inhibition effects of cell proliferation were assayed by four methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric（MTT）method.Cell cycle was analyzed by flow cytometry and the expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）was detected by immunocytochemical method after treating CNE-2Z cells with different concentration PDTC（25，50，100 μmol/L）after 48 h.Results The proliferation activity of CNE-2Z cells dealed with 25，50，100 μmol/L PDTC was inhibited obviously（P＜0.05），and it showed a time-dependent and dose-dependent manner.FCM result showed that the cell population reduced in S phase and the cell cycle was arrested in G0/G1phase.Compared with the control（no PDTC），the expression of PCNA of CNE-2Z cells was down regulated after PDTC dealed with（P＜0.05），and it showed a dose-dependent manner.Conclusion The growth of CNE-2Z can be inhibited and the expression of PCNA in CNE-2Z can could be down-regulated by PDTC.PDTC may be a potential chemotherapeutics for the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line.

Human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z；Pyrrolidine dithiocarbamate；NF-κB；Proliferation cell nuclear antigen

R286.91

A

1673-7210（2015）09（a）-0011-05

2015-05-18本文編輯：蘇暢）

湖北省宜昌市醫療衛生科研項目（AL4301-16）。

向銀洲（1971.3-），男，碩士，副主任醫師；研究方向：頭頸腫瘤基礎與臨床。