普羅布考對高同型半胱氨酸血癥大鼠血管功能的保護作用

高勝利　李　莉　翟曉娟　郭任維　燕　子　高淑紅

1.山西醫科大學汾陽學院生理學教研室，山西汾陽032200；2.山西醫科大學附屬汾陽醫院心血管內科，山西汾陽032200；3.山西醫科大學生理學系，山西太原030001；4.山西醫科大學汾陽學院統計學教研室，山西汾陽032200

普羅布考對高同型半胱氨酸血癥大鼠血管功能的保護作用

高勝利1李莉2翟曉娟2郭任維2燕子3高淑紅4

1.山西醫科大學汾陽學院生理學教研室，山西汾陽032200；2.山西醫科大學附屬汾陽醫院心血管內科，山西汾陽032200；3.山西醫科大學生理學系，山西太原030001；4.山西醫科大學汾陽學院統計學教研室，山西汾陽032200

目的探討普羅布考對高同型半胱氨酸血癥大鼠內皮功能的作用及機制。方法30只大鼠隨機分為3組，對照組（10只）基礎飼料飼養，高同型半胱氨酸血癥（HHcy）組（10只）在基礎飼料上添加3%L-蛋氨酸喂養4周，普羅布考組（10只）高蛋氨酸飼料喂養4周，同時給予普羅布考150 mg/d灌胃。喂養4周時檢測各組大鼠胸主動脈血管內皮依賴性舒張功能、血漿一氧化氮（NO）、非對稱性二甲基精氨酸（ADMA）含量和內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，胸主動脈二甲基精氨酸二甲氨基水解酶（DDAH2）活性和蛋白質表達。結果HHcy組大鼠同型半胱胺酸（Hcy）含量顯著升高，與HHcy組比較，普羅布考組大鼠Hcy含量降低（P＜0.01）。給予1×10-7～1×10-5mol/L累積濃度的乙酰膽堿后，HHcy組大鼠血管張力低于對照組和普羅布考組（P＜0.05）；給予1×10-8～1×10-4mol/L累積濃度的酸化亞硝酸鈉（NaNO2）后，三組間的血管張力無明顯差別（P＞0.05）。與對照組比較，HHcy組大鼠血漿NO含量降低（P＜0.05），eNOS活性降低（P＜0.01），ADMA含量增高（P＜0.05），胸主動脈DDHA2活性降低（P＜0.01）和蛋白質水平降低（P＜0.01）；與HHcy組比較，普羅布考組大鼠血漿NO含量增高（P＜0.01），eNOS活性增高（P＜0.05），ADMA含量降低（P＜0.01），胸主動脈DDHA2活性增高（P＜0.01）和蛋白質水平增高（P＜0.05）。結論普羅布考能降低高同型半胱氨酸血癥大鼠血漿Hcy水平，改善動脈內皮依賴性舒張功能，其機制與DDAH/ ADMA/NOS/NO通路有關。

普羅布考；同型半胱氨酸；內皮依賴性舒張功能；一氧化氮；內皮型一氧化氮合成酶；非對稱二甲基精氨酸；二甲基精氨酸二甲胺水解酶2

同型半胱氨酸（Homocysteinemia，Hcy）增高是心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的一個獨立危險因素［1］，血管內皮依賴性舒張功能（endothelium dependent dilation，EDD）下降是其發病原因之一［2］。EDD功能依賴于血管內皮的結構完整和功能正常，主要由一氧化氮（nitric oxide，NO）介導，NO由內皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化而成，非對稱性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是eNOS的抑制劑，可被二甲基精氨酸二甲氨基水解酶（dimethylarginine dimethylamino-hydrolase 2，DDAH2）特異水解［3］。普羅布考（Probucol）是一種降脂藥物，具有提高DDAH2的表達、降低ADMA的活性和改善內皮功能的作用［4］。普羅布考能否降低高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）大鼠的Hcy水平，改善EDD功能，目前相關報道較為少見，對此本研究進行探討，現報道如下：

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

L-蛋氨酸（天津天安藥業股份有限公司）；普羅布考（齊魯制藥有限公司，國藥準字H10980054）；大鼠Hcy、ADMA和eNOS酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）；β-actin一抗（北京中杉金橋生物計技術有限公司）；羊抗鼠DDAHⅡ（英國Abeam）；兔抗羊IgG-HRP（武漢博士德生物工程有限公司）；ECL化學發光劑（上海碧云天生物技術有限公司）。BL-420F生物機能實驗系統（成都泰盟生物科技有限公司）；多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），UV755B分光光度計（蘇州市萊頓科學儀器有限公司）。

1.2動物及模型制作

SD成年雌雄大鼠30只，6～8周齡，體重150～180 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：0701010。大鼠隨機分為三組：對照組、HHcy組和普羅布考組，每組10只。對照組基礎飼料飼養，HHcy組在基礎飼料上添加3%L-蛋氨酸喂養4周，普羅布考組高蛋氨酸飼料喂養4周，同時給予普羅布考150 mg/d灌胃。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠血漿Hcy含量檢測分別于喂養0、4周末眼眶采血，采用ELISA測定Hcy。

1.3.2大鼠胸主動脈內皮依賴性舒張功能檢測大鼠4周時，用25%烏拉坦腹腔注射麻醉動物后，迅速取出胸主動脈，置于預冷的Krebs-Henseleit（K-H）溶液中，制備2～3 mm的動脈環，血管環用2個金屬鉤懸置于充以K-H溶液中，一端與張力換能器相連，持續通以95%O2+5%CO2的混合氣體，以BL-420F生物機能實驗系統進行記錄和數據處理。以去氧腎上腺（PE，10 μmol/L）誘發最大收縮幅度為100%，以加入藥品后的血管舒張幅度與最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。以累積給予1×10-9～1×10-5mol/L的乙酰膽堿（ACh）反映內皮依賴性舒血管功能；以累積給予1×10-8～1×10-4mol/L的酸化亞硝酸鈉（NaNO2）反映非內皮依賴性舒血管功能。

1.3.3大鼠血漿NO、ADMA含量及eNOS活性檢測大鼠4周時，眼眶采血，3000 r/min，離心15 min，分離血漿。NO測定采用硝酸還原酶法，ADMA及eNOS含量采用ELISA測定。

1.3.4大鼠胸主動脈DDHA2活性檢測參照文獻［5］，將大鼠胸主動脈環剪碎加入冰的磷酸緩沖液（0.1 mol/L pH6.5）制成5%的組織勻漿，取50 μL上清與1 mmol/L ADMA反應，并與二乙酰單肟（0.8%）和安替比林（0.5%）共孵育100 min，用UV755B分光光度計測定466 nm吸光度值，計算L-胍氨酸生成量反映DDAH2的活性。以對照組的DDAH2活性定為100%，其他各組的DDAH的活性以與對照組的百分比表示。1.3.5大鼠胸主動脈DDHA2蛋白質水平檢測采用Western-blotting方法，將胸主動脈按1 mg組織加入10 μL含有多種蛋白酶抑制劑的組織裂解液，冰上裂解、勻漿，4℃離心后取上清，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量后行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，分別加入β-actin一抗（1∶1000）和DDAH 2一抗（1∶2500），4℃孵育過夜，結合HRP二抗（1∶500）孵育2 h，加入ECL化學發光劑，暗室曝光，顯影和定影。膠片掃描結果采用Quantity-one軟件分析，將目的條帶的光密度值與其相對應的內參β-actin的光密度值比較，所得比值代表該目的蛋白的相對含量。

1.4統計學方法

采用SPSS 20統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠血漿Hcy含量

喂養0周時，三組大鼠Hcy含量差異無統計學意義（P＞0.05）。喂養4周時，與對照組比較，HHcy組和普羅布考組大鼠Hcy含量顯著升高。與HHcy組比較，普羅布考組大鼠Hcy含量降低，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1　三組大鼠血漿Hcy含量變化比較（μmol/L，±s）

表1　三組大鼠血漿Hcy含量變化比較（μmol/L，±s）

與對照組比較，*P＜0.01；與HHcy組比較，#P＜0.01；HHcy：高同型半胱氨酸血癥；Hcy：同型半胱氨酸

組別只數0周4周對照組HHcy組普羅布考組P值10 10 10 10.36±1.32 11.24±2.04 10.59±3.12＞0.05 12.03±2.35 32.55±3.38*22.23±2.87*#＜0.05

2.2大鼠主動脈內皮依賴性舒張功能

給予1×10-7～1×10-5mol/L累積濃度的Ach后，HHcy組大鼠血管張力低于對照組和普羅布考組（P＜0.05），見圖2A；給予1×10-8～1×10-4mol/L累積濃度的酸化NaNO2后，三組間的血管張力比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2B。

A：給予累積濃度的Ach后大鼠血管張力；與對照組比較，**P＜0.05；與普羅布考組比較，##P＜0.05；B：給予累積濃度的酸化NaNO2后大鼠血管張力；Ach：乙酰膽堿；NaNO2：酸化亞硝酸鈉

2.3大鼠血漿NO、eNOS及ADMA含量

與對照組比較，HHcy組大鼠血漿NO含量降低（P＜0.05），eNOS活性降低（P＜0.01）；與HHcy組比較，普羅布考組血漿NO含量增高（P＜0.01），eNOS活性增高（P＜0.05）。HHcy組大鼠血漿ADMA含量與對照比較，明顯增高（P＜0.05）；與HHcy組比較，普羅布考組降低（P＜0.01）。見表2。

2.4大鼠胸主動脈DDHA2活性

與對照組比較，HHcy組大鼠胸主動脈DDHA2活性降低（P＜0.01）；與HHcy組比較，普羅布考組大鼠胸主動脈DDHA2活性增高（P＜0.01）。見表2。

表2　三組大鼠血漿NO、eNOS及ADMA含量及胸主動脈活性比較（x±s）

2.5大鼠胸主動脈DDHA2蛋白質水平

與對照組比較，HHcy組大鼠胸主動脈DDHA2蛋白質水平降低（P＜0.01）；與HHcy組比較，普羅布考組大鼠胸主動脈DDHA2蛋白質水平增高（P＜0.05）。見圖2。

圖2　DDHA2蛋白質的表達和DDHA2/β-actin比值

3　討論

Hcy是蛋氨酸代謝的中間產物，是CVD的一個獨立危險因素，一般認為血漿Hcy為5～15 μmol/L為正常，16～30 μmol/L為輕度HHcy，31～100 μmol/L為中度HHcy，Hcy＞100 μmol/L為重度HHcy。高劑量蛋氨酸飼養大鼠喂養可以導致血漿Hcy水平增高，本實驗中HHcy組采用3%L-蛋氨酸喂養，4周后Hcy水平達到（32.55±3.38）μmol/L，說明成功制備高同型半胱氨酸血癥大鼠模型。普羅布考具有調血脂和抗氧化作用，能否降低Hcy目前仍然存在著爭議。在本研究中，普羅布考組較HHcy組血漿Hcy降低（P＜0.01），說明普羅布考具有降低Hcy的作用，與李玲等［6］的研究結果一致，而臨床研究也證實了普羅布考具有降低Hcy的作用［7］，考慮與普羅布考阻斷低密度脂蛋白膽固醇氧化，抑制氧化應激，減少氧化低密度脂蛋白膽固醇的生成，降低氧自由基濃度，影響Hcy代謝有關。

血管EDD功能是動脈粥樣硬化和CVD的始動因素，Hcy可以導致EDD功能損傷［8］。EDD功能由NO介導，而NO由eNOS催化而成，ADMA是NOS的內源性抑制劑，ADMA主要通過DDAH2水解代謝。在本研究中，HHcy大鼠胸主動脈EDD功能下降，其血漿NO濃度下降、eNOS活性降低、ADMA水平升高，胸主動脈eNOS活性下降，DDAH2蛋白質表達下降，說明Hcy損傷內皮EDD功能與DDAH/ADMA/NOS/ NO通路有關，其原因可能是由于DDAH2活性中心包含一個活性必需的游離半胱氨酸殘基，Hcy的半胱氨酸殘基與此半胱氨酸殘基形成二硫鍵，導致DDAH2失活，ADMA降解減少血漿濃度升高［9］，抑制了eNOS使NO合成減少，最終導致EDD功能功能下降［10］，與張敬各［11］的研究結果一致。

普羅布考具有調節血脂、抗氧化、穩定動脈粥樣硬化斑塊和改善血管內皮功能等作用，作為一種獨特的抗動脈粥樣硬化藥物應用于臨床［12-13］。研究表明，普羅布考可以改善動脈粥樣硬化大鼠內皮依賴性舒張功能不全［14］。在本實驗中，與HHcy組比較，普羅布考組大鼠EDD功能增強（P＜0.01），說明普羅布考可以改善HHcy大鼠胸主動脈的EDD功能。已有研究證實，普羅布考具有提高DDAH2的表達、改善內皮細胞DDAH活性，降低ADMA水平的作用［4，15］。本研究中，普羅布考治療組血漿NO、eNOS活性均增高，而ADMA水平下降，胸主動脈DDAH2蛋白質表達增高。說明普羅布考通過增加DDAH2表達，降低ADMA水平，增加eNOS的活性，增加了NO，改善了EDD功能。說明了普羅布考可以提高HHcy大鼠主動脈DDAH2的表達，通過DDAH/ADMA/NOS/NO通路改善內皮EDD功能。由此可見，普羅布考不僅可以降低Hcy水平，而且可以通過DDAH/ADMA/NOS/NO通路改善HHcy大鼠都這么內皮EDD功能，為臨床應用普羅布考預防和治療HHcy提供理論依據。

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Protective effects of Probucol on endothelial function in rats with hyperhomocysteinemia

GAO Shengli1LI li2ZHAI Xiaojuan2GUO Renwei2YAN Zi3GAO Shuhong4
1.Department of Physiology，Fenyang College of Shanxi Medical University，Shanxi Province，Fenyang032200，China；2.Department of Cardiovascular Medicine，Fenyang Hospital of Shanxi Medical University，Shanxi Province，Fenyang 032200，China；3.Department of Physiology，Shanxi Medical University，Shanxi Province，Taiyuan030001，China；4.Department of Statistics，Fenyang College of Shanxi Medical University，Shanxi Province，Fenyang032200，China

Objective To investigate the effect and mechanism of Probucol on endothelial function in hyperhomocysteinemia rats.Methods 30 rats were randomly divided into three groups.Control group（10 rats）were feed in the basal diet；HHcy group（10 rats）in the basal diet added 3%L-methionine diet for 4 weeks；Probucol group（10 rats）of high methionine diet for 4 weeks，and was treated with Probucol 150 mg/d orally.Thoracic aortic EDD，plasma NO，ADMA content and eNOS activity of rats in each group were detected in 4 weeks；DDAH2 activity and protein expression in thoracic aorta were detected in 4 weeds.Results The content of Hcy in the rats of the HHcy group increased significantly，compared with the HHcy group，the Hcy content in the Probucol group rats was decreased（P＜0.01）.Given 1× 10-7-1×10-5mol/L Cumulative concentration of ACh，vascular tension in HHcy group rats were lower than control group and Probucol group（P＜0.05）；after given the cumulative concentration NaNO21×10-8-1×10-4mol/L，vascular tension between the three groups had no difference（P＞0.05）.Compared with the control group，plasma NO content was reduced（P＜0.05），eNOS activity was lower（P＜0.01），the ADMA content was increased（P＜0.05），aortic DDHA2 activity was decreased（P＜0.01）and protein level was decreased in HHcy group（P＜0.01）.Compared with HHcy group，plasma NO content were increased（P＜0.01），eNOS activity was increased（P＜0.05），the ADMA content were decreased（P＜0.01），the thoracic aortic DDHA2 ac-tivity was increased（P＜0.01）and protein level was increased（P＜0.05）in Probucol group.Conclusion Probucol can reduce the level of plasma Hcy in hyperhomocysteinemia rats，improve thoracic aorta endothelial dependent diastolic function，its mechanism is related to the DDAH/ADMA/NOS/NO pathway.

Probucol；Homocysteine；Endothelium dependent dilation；Nitric oxide；Endothelial nitric oxide synthase；Asymmetric dimethylarginine；Dimethylarginine dimethylamino-hydrolase 2

R589.2

A

1673-7210（2015）09（a）-0023-04

2015-04-28本文編輯：任念）

高勝利（1975-），男，碩士；研究方向：動脈粥樣硬化。