荷葉黃酮提取及對肉類腐敗菌抑菌活性研究

劉曉艷，陳海光，葉思平，陳展豪

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225）

荷葉黃酮提取及對肉類腐敗菌抑菌活性研究

劉曉艷，陳海光*，葉思平，陳展豪

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225）

研究乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間對荷葉黃酮提取得率的影響，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取荷葉黃酮的最佳工藝條件。結(jié)果表明，50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，提取溫度為70℃，料液比為1∶40（m/v），提取時(shí)間1.5 h，荷葉黃酮的得率為0.87%。測定了荷葉黃酮對5種肉類腐敗菌的抑菌效果，最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：荷葉黃酮對大腸桿菌、熒光假單孢菌、銅綠假單孢菌、酵母菌的最低抑菌濃度（MIC）分別為5.30、6.26、6.26、5.30 mg/100 mL，對大腸桿菌、熒光假單孢菌、酵母菌的最低殺菌濃度（MBC）分別為5.30、6.26、6.26 mg/100 mL。

荷葉；黃酮；提取；抑菌

荷葉（Nelumbo lotus leaf）是睡蓮科蓮屬植物蓮（Nelumbo nucifera）的葉片，是一味常用中藥。荷葉除含有普通植物所共有的碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、單寧等常規(guī)化學(xué)成分外，還含有多種生物堿和黃酮類化合物[1]。在1991年11月中華人民共和國衛(wèi)生部監(jiān)發(fā)（1991）第45號文件中，荷葉被列入第二批“既是食品又是藥品”的名單之一，其毒理方面評價(jià)為對人體基本無毒[2]。我國的荷葉資源雖然十分的豐富，但被利用的程度卻很低。

荷葉提取物的主要功能性成分是黃酮、生物堿和揮發(fā)油。其中，荷葉黃酮對意大利青霉菌（Penicillium italicum）、紅酵母（Rhodotorula）有較強(qiáng)的抑制作用[3]。荷葉生物堿對葡萄酒酵母、大腸桿菌（Escherichiacoli）；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcusbacilli）等表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性[4]。所以荷葉抑菌活性成分可作為一種廉價(jià)而安全有效的天然防腐劑，用于解決某些食品中過多使用化學(xué)防腐劑而帶來的安全問題。

本文優(yōu)化荷葉中黃酮的提取工藝，并就荷葉黃酮對5種常見的肉類食品腐敗菌的抑菌活性進(jìn)行研究，為荷葉抑菌資源的合理開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 荷葉

荷葉采摘自佛山市順德區(qū)，8月份的新鮮荷葉，淋洗瀝干后于70℃鼓風(fēng)烘干至含水率8%以下，粉碎，過18目篩，用PEP復(fù)合膜袋裝，封口扎緊置于干燥器內(nèi)，備用。

1.1.2 菌種

大腸桿菌（E.coLi），熒光假單胞菌（P.Fluorescens），銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa），蠟葉芽枝霉（Cladosporium herbarum），酵母菌（Saccharomycete）。

1.2 試劑

無水乙醇（AR）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；蘆丁：上海潛維化工有限公司；亞硝酸鈉（AR）、葡萄糖（AR）：廣州化學(xué)試劑廠；硝酸鋁（AR）：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；氫氧化鈉（AR）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨、瓊脂粉、酵母膏：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

GZX-9070ME分光光度計(jì)數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；620高速粉碎機(jī)：北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線的繪制[5]

用電子天平精密稱取0.079 g蘆丁（亦稱阿拉丁）粉，放入燒杯中。取用無水乙醇，將其配置成體積分?jǐn)?shù)為30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液，然后溶解稱取好的蘆丁，完全轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中定容，備用。

分別準(zhǔn)確量取0、1、2、4、6、8、10 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液稀釋到12.5 mL，加入0.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置5 min，再加入0.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al（NO）3溶液，搖勻，靜置6 min，再加入5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，用體積分?jǐn)?shù)30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液定容至25 mL，混勻放置10 min后，分別置于分光光度計(jì)下用510 nm可見光測量吸光度，記錄并做出曲線。

1.4.2 荷葉黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎干燥荷葉1 g→用浸提劑冷凝回流提取→冷卻→抽濾→除雜→浸提劑定容

1.4.3 荷葉黃酮抑菌試驗(yàn)

1.4.3.1 抑菌圈的測定[6]

用移液槍吸取上述各種菌懸液2 μL，加入到以固定好牛津杯的培養(yǎng)基上，并涂布均勻，將牛津杯拔出，往牛津杯洞里注入200 μL 3種不同濃度的樣品溶液，作3個(gè)平行，另作一個(gè)生理鹽水作空白對照，于37℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)（其中細(xì)菌為24 h，真菌為48 h），然后取出，測定抑菌圈大小，并與牛津杯直徑作比值。每菌作3次重復(fù)。

1.4.3.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定[7]

荷葉黃酮提取液經(jīng)過提取濃縮后，提取液濃度為0.496 mg/mL，把荷葉黃酮提取液按不同體積（1 000、1 300、1 700、2 000 μL）加入到已滅菌的培養(yǎng)皿中，然后往培養(yǎng)皿中加入15mL的相應(yīng)的培養(yǎng)基，并迅速晃動(dòng)混合均勻，配制成質(zhì)量濃度分別為3.1、4.06、5.3、6.25 mg/100 mL的荷葉黃酮溶液的系列培養(yǎng)基。取供試菌液100 μL置于了培養(yǎng)基表面并涂布均勻。混合后置于恒溫箱中培養(yǎng)（細(xì)菌在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，真菌在28℃下恒溫培養(yǎng)48 h），以未加黃酮提取液的培養(yǎng)基作為對照。觀察抑菌現(xiàn)象，以不長菌的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.4.3.3 最低殺菌濃度（MBC）的測定[8]

將提取物的濃度高于及等于MIC的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察菌體的生長情況，以仍無菌生長的最低添加量為該提取物的MBC值。

1.5 數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)試驗(yàn)測定均重復(fù)3次，用Excel軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線的測定

2.1.1 檢測波長的選擇

用440 nm至715 nm波長對標(biāo)準(zhǔn)蘆丁樣液進(jìn)行掃描，結(jié)果表明其在510 nm處有波峰。故選擇510 nm作為最佳波長測定提取物的吸光度，如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光波峰Fig.1 Rutin absorption wavelength scan

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線

標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線見圖2。

從圖2中可以看出，該蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線是以蘆丁濃度作為x軸，吸光度作為y軸的，回歸方程為y= 11.257x+0.000 6，回歸系數(shù)R2為0.999 9的直線。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Rutin standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對荷葉黃酮得率的影響

乙醇濃度對荷葉黃酮得率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對提取黃酮得率的影響Fig.3 Effect of Ethanol Concentration on the yield of flavonoid

由圖3可以看出，隨著乙醇濃度的增加，黃酮提取率增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，黃酮類化合物溶解度最大，黃酮得率最高；隨著濃度的增加，提取效果反而降低由于黃酮是一大類物質(zhì)，部分是水溶性的，部分是醇溶性的[9]。這是由于存在一些醇溶性的雜質(zhì)，這些成分與黃酮類化合物競爭并同乙醇-水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的減少，黃酮得率減少。故本試驗(yàn)選擇乙醇濃度為40%～60%（體積分?jǐn)?shù)）范圍內(nèi)較為合適。

2.2.2 料液比對荷葉黃酮得率的影響

不同的液料比會(huì)影響到提取溶劑對活性物質(zhì)的溶解情況。液料比過低，活性物質(zhì)不能充分溶解，影響到提取率。液料比過高，雖然能充分溶解活性物質(zhì)，但工藝成本受到影響。

料液比對荷葉黃酮得率的影響見圖4。

圖4 料液比對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of Solid-Liquid Rat on the yield of flavonoid

從圖4中可看出，隨料液比的增大，黃酮得率增加，但料液比達(dá)到1∶30 g/mL，隨著固液比的提高荷葉黃酮提取效果的提高已不是很明顯，這是由于存在一些雜質(zhì)，如單寧酸以及一些色素的溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭并同乙醇-水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的減少，考慮到提取工藝成本，考慮提取范圍在1∶25 g/mL～1∶35 g/mL范圍內(nèi)。

2.2.3 提取時(shí)間對荷葉黃酮得率的影響

浸提時(shí)間影響到溶劑與不同細(xì)胞位置活性物質(zhì)的接觸，并將其溶解提取出來。浸提時(shí)間越長，溶劑能夠充分滲透到組織中，與活性物質(zhì)充分接觸溶解，從而提高產(chǎn)率[10]。

浸提時(shí)間對荷葉黃酮得率的影響見圖5。

圖5 提取時(shí)間對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of Extraction Time on the yield of flavonoids

從圖5可看出，在一定時(shí)間內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，黃酮得率增大，但提取時(shí)間達(dá)到1.5 h后隨著時(shí)間增加，黃酮的得率減少，致使這一現(xiàn)象的可能原因是隨著時(shí)間的推移有些在乙醇溶液中對熱不穩(wěn)定的黃酮類物質(zhì)分解或轉(zhuǎn)化引起黃酮含量反而降低[11]，因此最終確定提取時(shí)間在0.5 h～1.5 h范圍內(nèi)，黃酮得率較高。對產(chǎn)率的影響是浸提時(shí)間的作用之一，另一個(gè)方面需要考慮的是，浸提時(shí)間過長還會(huì)導(dǎo)致黃酮產(chǎn)物的表異構(gòu)化作用。Row K H和Jin Y[12]在提取韓國茶葉中兒茶素的試驗(yàn)中指出，浸提溫度80℃，浸提時(shí)間4 h的條件下部分兒茶素有表異構(gòu)化現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.2.4 提取溫度對荷葉黃酮得率的影響

溫度是物體分子平均動(dòng)能的標(biāo)志，一個(gè)物體的溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)就越劇烈。物體內(nèi)部分子的平均動(dòng)能就越大，物體溫度的升到或降低。標(biāo)志著物體內(nèi)部的分子熱運(yùn)動(dòng)的平均動(dòng)能增加或減少。

提取溫度對荷葉黃酮得率的影響見圖6。

圖6 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.6 Effect of Temperature on the yield of flavonoids

從圖6中可以看出，隨著提取溫度的升高，黃酮提取率增加，當(dāng)溫度達(dá)到70℃后，黃酮得率變化不大，逐漸趨于平衡。考慮到提取工藝成本等原因，因此最終確定提取溫度為60℃～80℃范圍內(nèi)。Sun J等[12]在提取水果中多酚類物質(zhì)試驗(yàn)中指出，更高的浸提溫度可以獲得更高的多酚類產(chǎn)物得率，其原因可能是高溫溶劑會(huì)促進(jìn)細(xì)胞壁上的多糖類物質(zhì)分散到溶劑體系，弱化了細(xì)胞壁的完整性，使得溶劑更易與多酚類物質(zhì)接觸，從而導(dǎo)致得率上升。

2.2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果及有關(guān)資料介紹，確定以乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度等4種因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Factor and level of orthogonal experiment and the Result

從表1可看出，4個(gè)因子中提取時(shí)間對黃酮提取率影響最大，由極差數(shù)據(jù)R可見，各因子對黃酮含量的影響主次順序依次為提取時(shí)間（C）＞提取溫度（B）＞乙醇濃度（D）＞料液比（A）；從表1直觀上可看出，最優(yōu)工藝條件為A3B1C3D2，即用50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，提取溫度為70℃，料液比為1∶40（g/mL），提取時(shí)間1.5 h為合適，在此條件下，荷葉黃酮的得率為0.87%。

2.3 荷葉黃酮的抑菌特性研究

2.3.1 荷葉黃酮的抑菌圈

荷葉黃酮抑菌圈的測定結(jié)果見表2。

表2 荷葉黃酮抑菌圈的測定Table 2 Lotus leaves flavonoid antibacterial activity

由表2的抑菌圈的大小可以說明，荷葉黃酮對肉類常見腐敗菌大腸桿菌（E.coLi）、熒光假單孢菌（P. Fluorescens）、銅綠假單孢菌（P.Aeruginosa）、酵母菌（Saccharomycete）都有一定的抑菌作用，并且隨著提取物濃度的增大，抑菌作用增強(qiáng)。在試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)所試的濃度下，荷葉黃酮的乙醇提取液對蠟葉芽枝霉（Cladosporium herbarum Link et Fries）的抑制作用不明顯。

2.3.2 荷葉黃酮的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度

荷葉黃酮的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度見表3。

表3 荷葉黃酮最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）測定Table 3 The MIC and MBC of lotus leaves flavonoid

表3表明荷葉黃酮對肉類常見腐敗菌大腸桿菌（E.coLi）、熒光假單孢菌（P.Fluorescens）、銅綠假單孢菌（P.Aeruginosa）、酵母菌（Saccharomycete）的最低抑菌濃度（MIC）分別為5.30 mg/100 mL、6.26 mg/100 mL、6.26 mg/100 mL、5.30 mg/100 mL，對大腸桿菌（E.coLi）、熒光假單孢菌（P.Fluorescens）、酵母菌（Saccha-romycete）的最低殺菌濃度（MBC）分別為5.30、6.26、6.26 mg/100 mL。

3 結(jié)論與討論

通過正交試驗(yàn)確定了由荷葉中提取出黃酮類化合物的最佳工藝條件，體積分?jǐn)?shù)為50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，提取溫度為70℃，料液比為1∶40（g/mL），提取時(shí)間1.5 h。在此條件下，荷葉黃酮的得率為0.87%。

荷葉黃酮對肉類常見腐敗菌大腸桿菌（E.coLi）、熒光假單孢菌（P.Fluorescens）、銅綠假單孢菌（P.Aeruginosa）、酵母菌（Saccharomycete）有一定的抑菌作用，并且隨著提取物濃度的增大，抑菌作用增強(qiáng)，在同一濃度下對不同菌的抑菌效果不同。最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：荷葉黃酮對大腸桿菌（E.coLi）、熒光假單孢菌（P.Fluorescens）、銅綠假單孢菌（P.Aeruginosa）、酵母菌（Saccharomycete）的最低抑菌濃度（MIC）分別為5.30、6.26、6.26、5.30 mg/100 mL，對大腸桿菌（E.coLi）、熒光假單孢菌（P.Fluorescens）、酵母菌（Saccharomycete）的最低殺菌濃度（MBC）分別為5.30、6.26、6.26 mg/100 mL。在本試驗(yàn)所試的濃度下，荷葉黃酮的乙醇提取液對蠟葉芽枝霉（Cladosporium herbarum Link et Fries）的抑制作用不明顯。

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Study on the Extraction and Antibacterial Activity of Lotus Leaves Flavonoid

LIU Xiao-yan，CHEN Hai-guang*，YE Si-pin，CHEN Zhan-hao
（College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China）

The effect of ethanol concentration，extracting time，temperature as well as solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoid from lotus leaves was studied in the paper.The optimized parameters were gotten by using the single factor and orthogonal design.It was shown that 50% （voluem ratio）of the ethanol concentration，70℃，solid-liquid ratio 1∶40（g/mL）and 1.5 h，the extraction rate of flavonoid reached 0.87%. The antibacterial activity of lotus leaves Flavonoid to 5 bacteria in meat was studied.It was shown that the minimum inhibition concentration （MIC）of lotus leaves flavonoid to E.coli，P.Fluorescens，Cladosporium herbarum and Saccharomycete were 5.30，6.26，6.26，5.30 mg/100 mL.The minimum bactericidal concentration（MBC）were 5.30，6.26，6.26 mg/100 mL.

Lotus leaves；flavonoid；extraction；antibacterial

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.008

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B010500017）

劉曉艷（1978—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

*通信作者：陳海光（1966—），男（漢），教授，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

2013-11-22