加壓毛細管電色譜測定乳及乳制品中三聚氰胺

郭啟雷，史海良，趙麗，楊紅梅，王浩

（國家食品質量安全監督檢驗中心，北京100094）

加壓毛細管電色譜測定乳及乳制品中三聚氰胺

郭啟雷，史海良，趙麗，楊紅梅，王浩

（國家食品質量安全監督檢驗中心，北京100094）

研究建立利用加壓毛細管電色譜（pCEC）測定乳及乳制品中三聚氰胺的分析方法。樣品采用2%三氯乙酸水溶液超聲提取，陽離子固相萃取柱（MCX）凈化，提取液經C18反相毛細管電色譜柱分離，流動相乙腈-10 mmol/L辛烷磺酸鈉溶液（pH 3.0）=15+85，泵流速0.05 mL/min，分離電壓-2 kV，紫外檢測器240 nm檢測。該方法在1.0 mg/kg～100 mg/kg質量濃度范圍內線性關系良好（R2=0.999），在牛奶和酸奶中的定量限為2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限為10 mg/kg，加標回收率為78.9%～93.5%，相對標準偏差小于5%。

加壓毛細管電色譜；乳及乳制品；三聚氰胺

目前檢測三聚氰胺的方法主要有氣相色譜-質譜法（GC-MS）[1-2]、高效液相色譜法（HPLC）[3-4]和液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）[5-6]等。其中GC-MS法樣品需要衍生化，操作比較復雜；HPLC法是目前最常用的分析方法；HPLC-MS/MS靈敏度高，抗干擾能力強，但儀器購置、維護成本較高。毛細管電色譜（Capillary Electro-Chromatography，CEC）是將毛細管柱內填充或鍵合固定相，以電滲流為驅動力，結合了微徑高效液相色譜與毛細管電泳兩者的特點，具有高柱效、快速分離、高選擇性、高精度以及試劑和樣品用量少等優點，但單純的CEC模式易產生氣泡、干柱等問題[7]。而加壓毛細管電色譜（Pressurized Capillary Electro-Chromatography，pCEC）通過微型液相色譜泵在毛細管電色譜柱一端施加壓力，壓力的引入使CEC分離過程受pH和緩沖液的限制相對減少，可有效地解決CEC的氣泡問題，且能實現梯度洗脫；用電滲流和泵壓同時驅動流動相，溶質依據它們在流動相與固定相中分配系數的不同和自身電泳淌度的差異得到分離，對復雜樣品顯示出極大的分離能力[7]。pCEC技術近年來開始應用于食品安全領域[8-10]，本研究建立了應用pCEC分析乳及乳制品中三聚氰胺的新方法，與HPLC1mL/min的流速以及UPLC、LC-MS/MS采用的0.2 mL/min流速相比，pCEC采用0.05 mL/min的流速極大地減少了有機溶劑的使用，經濟、環保。在定性方面，pCEC可以通過施加不同的電壓進一步判斷樣品中是否含有三聚氰胺，在不采用LC-MS/MS等昂貴儀器設備的情況下，同樣可以增加定性的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈：美國Thermo Fisher公司，色譜純；冰乙酸、氨水：北京化工廠，分析純；辛烷磺酸鈉：天津市津科精細化工研究所，分析純；三氯乙酸：北京市興津化工廠；三聚氰胺：國家標準物質中心；Oasis MCX（60 mg，3 mL）：美國waters公司。

加壓毛細管電色譜儀：TriSepTM-2100（Unimicro Technologies，Inc.，Pleasanton，CA，USA），包括2臺高壓輸液泵、±30 kV高壓電源、微流控制系統、紫外檢測器和數據處理系統；Milli-Q純水系統：美國Millipore公司；電子天平、感量0.000 1 g、0.01 g：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HY-5回旋振蕩器：國華電器有限公司；超聲波清洗器KQ5200：昆山市超聲儀器有限公司；氮吹儀：美國Organomation association Inc.公司產品。

1.2 方法

1.2.1 pCEC條件

毛細管電色譜柱EP-100-20/45-3-C18（蘇州環球色譜有限公司），內徑100 μm，有效柱長20 cm，總長45 cm，填料為粒徑3 μm ODS，流動相：乙腈-10 mmol/L辛烷磺酸鈉溶液（冰乙酸調節pH 3.0）=15+85，流速：0.05 mL/min，檢測波長240 nm，電壓-2 kV。

1.2.2 標準曲線的制備

準確稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）三聚氰胺標準品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成1.00 mg/mL的標準儲備液。然后用水逐級稀釋成1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL系列濃度標準工作溶液，經0.45 μm濾膜過濾后進加壓毛細管電色譜儀測定，峰面積對濃度作圖。

1.2.3 樣品處理

稱取牛奶、酸奶樣品10 g（精確至0.01 g）于25 mL比色管中，加入2%三氯乙酸水溶液至刻度，渦旋混勻后，超聲提取20 min，提取液經濾紙過濾，待凈化。

稱取奶粉樣品2.5 g（精確至0.01 g）于50 mL比色管中，加入10 mL水，渦旋混勻使奶粉充分溶解，加入2%三氯乙酸水溶液定容至25 mL，渦旋混勻后，超聲提取20 min，提取液經濾紙過濾，待凈化。

取5 mL上述提取液過MCX小柱（預先經3 mL甲醇、3 mL水活化），待提取液全部通過MCX小柱后，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，加入6 mL5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，50℃水浴氮吹至干，用1 mL流動相經渦旋、超聲充分溶解，過0.45 μm有機相濾膜，供pCEC測定。

2 結果與討論

2.1 流動相中有機相條件的優化

三聚氰胺的極性較大，需要在流動相中加入離子對試劑來延長保留時間。采用10 mmol/L的辛烷磺酸鈉為離子對試劑，冰乙酸調節pH至3.0。實驗考察了流動相中有機相的比例對三聚氰胺色譜分離的影響，如圖1所示。

圖1 流動相中有機相比例對pCEC分離三聚氰胺的影響Fig.1 Electrochromatograms of melamine with different concentration of organic solvent

隨著流動相中乙腈比例增加，三聚氰胺的保留時間越來越短，分析速度加快，同時色譜峰的峰寬越來越小，綜合考慮色譜分離的周期和實際樣品基質的復雜性，最后選擇流動相為15%乙腈的實驗條件進行色譜分離。

2.2 施加電壓的研究

實驗考察了施加不同的電壓對三聚氰胺色譜行為的影響，見圖2。

從圖2中可以看出，0 kV時，三聚氰胺在色譜柱上保留時間較長，峰面積較小，檢測靈敏度較低；隨著負電壓的增加，電滲流、電泳的方向與泵壓方向相同，保留時間減小。綜合考慮分離度和分析時間，選擇-2 kV為分析條件。對于陽性樣品，可以通過改變電壓，觀察樣品峰與標準品色譜峰的保留時間符合程度來進一步判斷樣品中是否含有三聚氰胺，相較普通液相色譜來說，增加了定性的準確性。

2.3 提取條件的選擇

GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》采用1%三氯乙酸溶液加少量乙腈的方法來提取三聚氰胺，在實際應用中發現，該方法對于部分配方奶粉處理效果不好。本課題改用2%三氯乙酸水溶液提取，提高了三氯乙酸的濃度，蛋白沉淀效果明顯改善，用該方法對上述不易處理的配方奶粉樣品進行提取，均取得了良好的結果。提取液經MCX陽離子固相萃取柱凈化，供pCEC測定。圖3～圖5比較了乳制品經MCX凈化前后的色譜圖，以及加標的色譜圖。被分析樣品的各個組分受到泵壓、電壓和電滲流等3個驅動力的綜合作用，在3個驅動力的綜合作用下，三聚氰胺與食品的基質成分得到了很好分離，從圖中可以看出，本試驗建立的儀器條件和前處理方法對三聚氰胺的測定沒有干擾，確保了定性、定量的準確性。

圖2 三聚氰胺在不同電壓下的pCEC色譜圖Fig.2 Electrochromatograms of melamine with different voltage

圖3 牛奶基質在不同凈化條件的pCEC比較Fig.3 Electrochromatograms of melamine in milk with different pretreatment.1-melamine

圖4 酸奶基質在不同凈化條件的pCEC比較Fig.4 Electrochromatograms of melamine in yoghourt with different pretreatment.1-melamine

圖5 奶粉基質在不同凈化條件的pCEC比較Fig.5 Electrochromatograms of melamine in milk powder with different pretreatment.1-melamine

2.4 檢出限、線性范圍和回收率

在空白樣品中添加一定濃度的標準工作溶液，按照上述實驗方法進行處理，用pCEC測定，以10倍信噪比計算本方法在牛奶和酸奶中的定量限為2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限為10 mg/kg。按照1.2.2制備系列濃度標準工作溶液，按濃度由低到高依次經加壓毛細管電色譜儀測定，峰面積對濃度作圖，得到三聚氰胺的線性方程A=103.5C+9.82，r2=0.999，線性范圍1.0 mg/kg～100 mg/kg。

采用經測定不含有三聚氰胺的3種樣品，進行添加回收和精密度實驗，加標濃度為20、50、100 mg/kg，按本文實驗方法進行處理，用pCEC進樣測定。平均添加回收率（每個添加濃度平行測定5次）為78.9%～93.5%，相對標準偏差小于5%，結果見表1。

表1 3種樣品中三聚氰胺的回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of melamine

采用本方法對市場上的30例乳及乳制品樣品進行檢測，均未發現陽性樣品，表明目前對三聚氰胺的違法添加得到了有效控制。

3 結論

本文以非食用物質三聚氰胺為研究對象，選取牛奶、酸奶、奶粉等食品基質，樣品采用三氯乙酸水溶液超聲提取，提取液經陽離子固相萃取柱凈化，采用反相毛細管電色譜柱分離，泵流速0.05 mL/min，分離電壓-2 kV，流動相乙腈-10 mmol/L（15+85，v/v）等度洗脫。該方法在1.0 mg/kg～100 mg/kg質量濃度范圍內呈線性關系（R2=0.999），在牛奶和酸奶中的定量限為2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限為10 mg/kg，加標回收率為78.9%～93.5%，相對標準偏差小于5%。pCEC采用0.05 mL/min的流速極大地減少了有機溶劑的使用，經濟、環保。另外，相較普通高效液相色譜來說，pCEC可以通過施加不同的電壓進一步判斷樣品中是否含有三聚氰胺，在不采用質譜等昂貴儀器設備的情況下，同樣可以增加定性的準確性，為乳及乳制品中三聚氰胺的檢測提供了新的技術手段。

[1]胡銀川,李明元,邱一雯.鮮蛋中三聚氰胺GC-MS測定方法研究[J].食品工業,2010,31(3):95-97

[2]吳惠勤,黃芳,林曉珊,等.氣相色譜-質譜法測定奶粉及奶制品中的三聚氰胺[J].分析測試學報,2008,27(10):1044-1048

[3]曹程明,王丁林,葛宇.離子交換色譜-二極管陣列檢測法測定食品中三聚氰胺[J].食品工業,2011,32(5):98-100

[4]趙永彪,李自春,劉婷,等.高效液相色譜法測定寵物食品中的三聚氰胺[J].分析實驗室,2008,27(增刊):190-192

[5]付登洲,楊雪嬌,黃偉,等.超高效液相色譜-串聯質譜內標法測定飼料中三聚氰胺含量[J].食品工業,2009,30(5):58-60

[6]劉梅,李金強,田德金,等.固相萃取-液相色譜-串聯質譜法檢測食品中的三聚氰胺[J].化學分析計量,2008,17(2):48-50

[7]吳漪,王彥,谷雪,等.加壓毛細管電色譜在建立中藥黃柏指紋圖譜中的方法學研究[J].中國科學B輯:化學,2009,39(8):767-773

[8]董潔瑩,歐陽小琨,曹國洲,等.加壓毛細管電色譜法測定鰻魚中5種磺胺類藥物殘留[J].浙江海洋學院學報:自然科學版,2011, 30(5):392-396

[9]呂海霞,王家斌,王曉春.整體柱毛細管電色譜法測定蔬菜中有機磷農藥的含量[J].光譜實驗室,2007,24(4):735-738

[10]瑪爾江·巴哈提別克,薛云云,王彥,等.應用加壓毛細管電色譜技術檢測雞蛋中四環素類農獸藥殘留的研究[J].中國抗生素雜志, 2011,36(7):536-539,S1

Determination of Melamine in Milk and Dairy Product by Pressurized Capillary Electro-Chromatography

GUO Qi-lei，SHI Hai-liang，ZHAO Li，YANG Hong-mei，WANG Hao
（National Food Quality&Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

An effective and convenient method for determination of melamine in milk and dairy product was developed.Pressurized capillary electro-chromatography （pCEC）was used as separation technology.The samples were extracted by ultrasonic with 2%trichloroacetic acid solution，cleaned up by mixed cation exchange solid phase extraction （MCX SPE）.The separation was performed on a reversed phase C18 column with 240 nm as the UV detection wavelength.The mobile phase was composed of acetonitrile and sodium octanesulfonate solution（15∶85，v/v，pH3.0），at a pump flow rate of 0.05 mL/min and separation voltage of -2 kV.Under the optimal conditions，the linear range of melamine was 1.0 mg/kg-100 mg/kg with correlation coefficient higher than 0.999.The LOQ was 2.5 mg/kg in milk and yoghurt，and 10 mg/kg in milk powder.The recoveries were 78.9%-93.5%and the relative standard deviations（RSD）were less than 5%.

pressurized capillary electro-chromatography（pCEC）；milk and dairy product；melamine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.021

北京市科技計劃項目（Z111100056811006）

郭啟雷（1979—），男（漢），研究員，博士，研究方向：食品安全。

2014-04-03