不同加樣方式對ELISA競爭法檢測乙肝核心抗體的影響

俞勝琴

（江寧區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京 211100）

不同加樣方式對ELISA競爭法檢測乙肝核心抗體的影響

俞勝琴

（江寧區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京 211100）

目的 探討不同加樣方式對酶聯(lián)免疫吸附試驗競爭法檢測乙肝核心抗體結(jié)果的影響。方法 收集132例門診和住院患者血清樣本，運用ELISA競爭抑制法，按照3種不同的加樣方式檢測乙肝核心抗體進行對照。結(jié)果 加樣方式1的陽性率為12.12%；加樣方式2的陽性率為14.39%；加樣方式3的陽性率為28.78%。三種不同的加樣方式，陽性檢出率各不相同。結(jié)論 三種不同的加樣方式對ELISA競爭法檢測乙肝核心抗體的檢測結(jié)果不同。加樣方式1是標準的加樣方式，準確性高；加樣方式2與加樣方式1相比較無統(tǒng)計學意義，結(jié)果無明顯差異；加樣方式3與加樣方式1相比較有統(tǒng)計學意義，結(jié)果有明顯差異。

酶聯(lián)免疫吸附試驗；競爭法；乙肝核心抗體；陽性檢出率

乙型肝炎核心抗體是乙肝病毒感染的指標，它的出現(xiàn)提示機體正在感染或既往感染過乙肝病毒。因此，乙肝核心抗體的檢測在乙型肝炎的診治方面具有十分重要的作用[1-2]。ELISA法檢測乙肝病毒核心抗體已成為應(yīng)用最廣泛的免疫檢測技術(shù)。ELISA競爭法是檢測乙肝病毒核心抗體的常用方法，在臨床實驗室中廣泛應(yīng)用。本文運用ELISA競爭法檢測132例門診及住院患者乙肝核心抗體為例，以不同的加樣方式對ELISA競爭法的影響進行實驗和評價，分析其對乙肝核心抗體陽性檢出率的差異。

1　材料與方法

1.1標本：隨機抽取2014年4～6月，132例門診和住院患者血清樣本，清晨空腹采集患者的靜脈血5 mL，患者年齡段為22～50歲，平均38歲；標本無溶血、脂血、黃疸等。

1.2試劑及儀器：核心抗體ELISA競爭抑制法檢測試劑盒，產(chǎn)家由北京萬泰藥業(yè)股份有限公司提供，酶標儀（KHB KT-360）和洗板機（KHB KT-36W）均由上海科華實驗系統(tǒng)有限公司提供。

1.3方法

1.3.1采血2 h后，離心分離血清，2～8 ℃冰箱保存，48 h內(nèi)完成測試。

1.3.2加樣方式1：用可調(diào)加樣器調(diào)至100 μL，吸取100 μL血清放入試管底部，用吸管取0.9%氯化鈉3 mL混勻（1∶30倍稀釋）。每板設(shè)陰性對照3孔，陽性對照2孔，空白對照1孔，微孔按序編號。分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品及陰、陽對照各50 μL，空拍孔不加；加樣方式2：血清不稀釋，每孔直接加入血清10 μL，各設(shè)陰、陽及空白對照；加樣方式3：血清不稀釋，每孔直接加入血清50 μL，各設(shè)陰、陽及空白對照[3]。

1.3.3加酶：每孔均加入酶標試劑50 μL，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置37 ℃，溫育30 min。小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干[4]。每孔加入顯色劑A、B液各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，10 min內(nèi)用酶標儀在450 nm波長處，用空白孔調(diào)零點后測定各孔A值。

1.3.4統(tǒng)計：進行統(tǒng)計學處理，通過χ2檢驗，P＞0.01，無統(tǒng)計學意義；P＜0.01，有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié) 果

2.1實驗結(jié)果：“加樣方式1的陽性率為12.12%；加樣方式2的陽性率為14.39%；加樣方式3的陽性率為28.78%。”

2.2三種不同加樣方式檢測132例乙肝核心抗體結(jié)果分析：見表1、2。

表1　方法2與方法1檢測乙肝核抗體結(jié)果比較

表2　方法3與方法1檢測乙肝核抗體結(jié)果比較

3　討 論

ELISA競爭抑制法的原理，是將抗原包被反應(yīng)板，加入待檢標本與酶標液的單克隆抗體二者競爭結(jié)合固相抗原，即酶標抗體和標本抗體在同樣的反應(yīng)體系中與固相抗原等比競爭結(jié)合，溫育后洗滌加入顯色劑，顯色的強弱與待檢標本中抗體的含量成反比[5]。ELISA競爭法是檢測乙肝核心抗體實驗簡單、實用、實驗要求條件低、易于操作，是被臨床廣泛應(yīng)用的經(jīng)典實驗。以上實驗可以說明：

3.1三種不同的加樣方式運用ELISA競爭抑制法的原理對乙肝病毒核心抗體進行檢測，加樣方式不同，檢出的陽性率也有差異。

3.2加樣方式1操作流程較復(fù)雜，血清標本要經(jīng)過1∶30倍的稀釋。稀釋時，每人需要一支試管，當樣本量大時，會造成一定的人力、物力的浪費。但此加樣方式準確性高，臨床可靠，是標準的加樣方式，公認的檢測方法。

3.3加樣方式2是直接加入血清10 μL，其加樣方式和標準加樣方式1二者檢測的結(jié)果，經(jīng)過統(tǒng)計學分析與比較：χ2=0.16，0.5＜P＜0.75，P＞α=0.05，乙肝病毒核心抗體陽性率無明顯差異，變化不顯著。此法雖不是標準的加樣方式，當進行大規(guī)模的體檢時，即檢測的樣本量很大時，運用此法，省去了加樣方式1的血清標本1∶30倍稀釋的繁瑣程序，在一定程度上具有操作簡單、省時、經(jīng)濟、環(huán)保的特點，提高了工作效率。

3.4加樣方式3是直接加入血清50 μL。實驗表明，與標準的加樣方式1相比較：χ2=11，P＜0.005，P＜α=0.05。兩方法的結(jié)果有統(tǒng)計學意義，乙肝病毒核心抗體的陽性率明顯上升，差異顯著。導(dǎo)致此結(jié)果可能是以下幾個方面的原因：①當直接加入50μL血清標本時，乙肝病毒核心抗體的酶標抗體-HBc與反應(yīng)板上包被的固相抗原HBcAg結(jié)合機會有所減少，從而嚴重影響結(jié)果的檢測；②抗原與抗體的特異性結(jié)合，是有一定的比例性，當比例不匹配時，會出現(xiàn)帶現(xiàn)象。即抗體過量時，出現(xiàn)前帶現(xiàn)象；抗原過量時，出現(xiàn)后帶現(xiàn)象。本試驗，是由于加入了過量的抗體，故出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象；③有研究報道未稀釋或低倍稀釋存在較高的非特異反應(yīng)；單項乙肝病毒核心抗體陽性標本中存在低滴變和假陽性結(jié)果[6]。由于上述原因常常會導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)，使得陽性率明顯增高。所以，加樣方式3不適合用ELISA競爭抑制法檢測乙肝病毒核心抗體標志物。

3.5當然，影響ELISA競爭抑制法的因素還有很多很多。在日常的實際操作中，除上述加樣方式外，還有加樣的間隔時間長短[7]、標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存過間過長和標本凝固不完全、試劑盒的抗原不純等等都可導(dǎo)致假陽性，影響實驗室檢測結(jié)果的準確性[8-9]。

因此，在ELISA法驗測乙肝病毒核心抗體標志物時，若一般門診及住院患者數(shù)量不是很大時建議采用加樣方式1；遇有大規(guī)模普查或體檢情況等大量標本時若采用加樣方式1，其工作量太大，同時也增加了操作的繁瑣性，建議采用加樣方式2；原則上在ELISA法檢測乙肝病毒核心抗體時，不采取加樣方式3的方式。同時，我們在實際操作過程中，還應(yīng)對標本進行嚴格處理，選擇靈敏度高、特異性強的試劑和具有準確、穩(wěn)定的酶標儀，開展室內(nèi)質(zhì)控等辦法與舉措，才能保證檢驗結(jié)果準確無誤，更好地為患者及臨床服務(wù)[10]。

[1] 張麗莉,蔡安.三種不同加樣模式對ELISA法檢測乙型肝炎核心抗體結(jié)果的影響[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2010,28(6):645.

[2] 胡建平.不同加樣方式對酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測抗-HBc的影響[J].臨床誤診誤治,2011,24(6):81-82.

[3] 梁修珍.6種不同加樣量對酶聯(lián)免疫測定法檢測乙型肝炎病毒核心抗體結(jié)果的影響[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2014,35(4):481-482.

[4] 鄒映東,林云,張興宗,等.不同稀釋及洗板方式對競爭法檢測乙肝核心抗體的影響[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2013,34(12):1569-1570.

[5] 王蘭蘭,吳健民.臨床免疫學與檢驗[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版權(quán)社,2010:103-107.

[6] 李艷霞.ELISA法檢測乙肝病毒抗-HBc和抗-HBe假陽性原因分析[J].中國當代醫(yī)藥:2010,17(36):82-84.

[7] 何瑛,吳人風.加樣時差對競爭法抑制法檢測抗-HBc的影響因素探討[J].中國當代醫(yī)藥,2010,17(10):56-57.

[8] 楊京民.ELISA法對乙型肝炎“兩對半”檢測結(jié)果的影響因素的分析[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2012,32(21):2551-2552.

[9] 丁文,薛慶歡,吳文金,等.人為操作因素對酶聯(lián)免疫吸附法檢測乙肝病毒血清標志物影響的探討[J].中國實驗診斷學,2010,14 (7):1019-1022.

[10] 薛春梅,鄒建波.ELISA法乙肝兩對半檢測影響因素分析和臨床意義[J].中國誤診學雜志,2011,11(16):3913-3914.

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1671-8194（2015）30-0145-02