氨基酸類成分的高效液相指紋圖譜鑒別不同產地絞股藍研究

陳培云，王獻友，趙志磊，龐艷蘋，李曉楊

（河北大學質量技術監督學院，河北保定071002）

氨基酸類成分的高效液相指紋圖譜鑒別不同產地絞股藍研究

陳培云，王獻友，趙志磊，龐艷蘋，李曉楊

（河北大學質量技術監督學院，河北保定071002）

采用氨基酸類成分的高效液相指紋圖譜，實現對包括陜西平利在內的8個產地絞股藍的鑒別。使用超聲法提取絞股藍水溶性氨基酸，采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜－熒光檢測法，建立絞股藍氨基酸類指紋圖譜，結合主成分分析、判別分析鑒別不同產地絞股藍。結果表明主成分分析法明顯把陜西平利和其他產地區開來，對其他產地也基本上能夠進行區分，建立的判別分析模型穩定性良好。由此得出氨基酸類成分的高效液相指紋圖譜結合主成分析分析可以實現平利絞股藍和其他產地的有效區分，建立的判別分析模型，為保護平利絞股藍原產地域產品以及其他不同產地的區分提供了新的方法途徑。

絞股藍；氨基酸類指紋圖譜；原產地；主成分分析；判別分析

絞股藍Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Maldno為葫聲科Cucurbitaceae絞股藍屬草質藤本植物，又名天堂草、超人參和七葉參等。具有抑制腫瘤［1］、降低血脂、清熱解毒、止咳袪痰等作用［1-2］。民間稱其為“神奇”的“不老長壽藥草”。絞股藍被醫學界譽為東方神草、人間福音草，現代研究表明絞股藍含有皂苷、黃酮、氨基酸、植物蛋白、多糖、磷脂、維生素、纖維素、微量元素等［3-4］。

絞股藍產地眾多，地理分布廣泛，不同產地的絞股藍質量參差不齊，魚龍混雜。地處北亞熱帶濕潤季風氣候區的平利縣，由于雨量充沛，氣候溫和，日照充足，無霜期時間長，土壤有害物質含量低，成為中國國內生態型藥用植物種植示范基地的最佳區域。根據《中華人民共和國產品質量法》和《原產地域產品保護規定》，國家質量監督檢驗檢疫總局通過了對平利絞股藍原產地域產品保護申請的審查，批準自2004年12月13日起對平利絞股藍實施原產地域保護。

近年來，絞股藍的研究主要集中在測定其中單一成分或某幾種成分的含量［5-8］。對產地差異的研究主要有：秦江［9］等測定產自福建、湖北、廣西、云南、浙江和陜西6種不同產地絞股藍總皂苷的含量，比較這6種絞股藍總皂苷組成成分的差異性，王晶［10］等測定了7個省產絞股藍及其根際土壤中As，Hg，Se 3種元素的含量，進行分析比較。梁曉慶［11］等對5省絞股藍Se、總蛋白及總皂苷含量進行測定，分析了三者相關性，劉芳［12］等建立絞股藍藥材黃酮類化合物的HPLC指紋圖譜，對不同產地批次的絞股藍藥材進行質量評價。牛俊峰［13］等建立固相微萃取-氣相色譜質譜方法，對采自4省市5個地區藥用植物絞股藍的揮發性化學成分進行定性定量分析。以上研究均未明確對絞股藍產地來源進行區分，絞股藍中富含氨基酸，不同產地絞股中藍氨基酸含量不同，本文采用高效液相色譜法對包括平利在內的8個產地絞股藍氨基酸類進行研究，并利用matlab軟件進行主成分分析和spss進行判別分析，建立穩定可靠的模式識別方法。該研究結果為維護名貴中藥材市場的經濟秩序，保護地理標志產品的聲譽提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料與儀器

鄰苯二甲醛（上海源葉生物科技有限公司，分析純），β-巰基乙醇（amresco，分析純），甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純），四氫呋喃（上海同試化工有限公司，分析純），乙酸鈉（天津市光復精細化工廠，優級純），硼酸（天津市凱通化學試劑有限公司，≥99.8%），氫氧化鈉（天津市北聯精細化學品開發有限公司，≥98%優級純），氨基酸對照品：天冬氨酸（20121123）、蛋氨酸（20110415）、賴氨酸（20130113）購自上海源葉生物科技有限公司，谷氨酸（14690-201203）、絲氨酸（14688-201001）、組氨酸（140693-201102）、甘氨酸（140689-201103）、蘇氨酸（140682-201102）、丙氨酸（140680-201002）、色氨酸（140686-201002）、纈氨酸（14681-201202）、苯丙氨酸（140676-201106）、異亮氨酸（140683-201202）、亮氨酸（140687-201102）購自中國食品藥品檢定研究所）精氨酸（≥99.2%）酪氨酸（≥99.4%）購自中國計量科學研究院。實驗用水為Milli-Q超純水，流動相以0.45 μm的濾膜過濾。實驗采用的8個絞股藍藥材分別來源于陜西、安徽、福建、廣西、湖北、湖南、山東、四川。實驗時每個產地取5個批次。

Agilent1100高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；Agilent色譜工作站；色譜柱Kromasil C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；檢測器Agilent G1321熒光檢測器；KQ-500DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；高速中藥粉碎機：武義縣屹立工具有限公司。

1.2方法

1.2.1氨基酸標準溶液制備

分別精密稱取16種標準氨基酸各0.25 g于25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容后備用。

1.2.2供試樣品制備

絞股藍在50℃～60℃下烘干干燥，干燥后的材料用植物粉碎機粉碎并過80目篩，準確稱取絞股藍0.6 g，置100 mL容量瓶中，用二次去離子水至近刻度，30℃超聲提取30 min（100 kHz，80 w），冷卻后，二次去離子水定容至刻度，10 000 r/min離心棄去沉淀，離心液用0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.2.3衍生及分析

衍生試劑的配制：稱取0.27 g鄰苯二甲醛（OPA）溶于5 mL無水乙醇中，加入100 μL2-巰基乙醇，用0.4 mol/L的硼酸（pH=9.5，氫氧化鈉溶液調制）定容到50 mL，混勻，置于暗處，每隔1天補加10 μL巰基乙醇，每周需重新配制。

移取100 μL標準溶液或樣品于2 mL的棕色樣品瓶中加入等量的OPA衍生化試劑，在混勻器中混勻，反應1.5 min，取50 μL（定量環為20 μL）注入高效液相色譜儀，按下述色譜條件操作，記錄30 min色譜圖。

1.2.4色譜條件

色譜柱為Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相（A）：0.05mol/LNaAc+0.5%THF；流動相B：甲醇。梯度洗脫線性梯度：（T，B%）（0 min，20%）（27 min，88%）（34min，20%）。流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，熒光檢測激發波長為340 nm，發射波長為460 nm，進樣量為20 μL。每次樣品完成后，系統平衡10 min。

1.2.5數據處理方法

液相色譜圖通過《中藥指紋圖譜相似度評價系統研究（2004試行版）》處理分析。使用matlab進行主成分分析，spss進行判別分析。

2結果與分析

2.1方法學驗證

2.1.1方法的專屬性

在上述色譜條件下進樣分析，標準溶液、樣品色譜圖見圖1（A、B、C）。

由圖1可見氨基酸在26 min內基本達到了完全分離，內源性物質及衍生化試劑不干擾氨基酸的測定。方法具有較好的專屬性。

圖1　HPLC圖Fig.1Chromatogram of amino acids constituents

2.1.2精密度試驗

將處理好的絞股藍的水提取液，分別按照“2.1.4”項下方法進行衍生，按2.1.1實驗條件，重復進樣6次，記錄色譜圖，結果表明，各主要色譜峰的相對酪氨酸參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.10%～0.32%、0.28%～3.3%，圖譜導入相似度軟件處理，相似度均在0.998以上，表明儀器精密度良好。

2.1.3重復性試驗

精密稱取同一絞股藍5份，分別按照“2.1.3”項下方法處理，然后分別進行衍生、進樣，記錄色譜圖。結果各主要色譜峰相對酪氨酸參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別0.2%～1.5%，0.26%～3.5%，圖譜導入相似度軟件處理，相似度均在0.983以上，表明本方法重復性好。

2.1.4穩定性試驗

精密吸取同一絞股藍供試品溶液，分別在0、2、4、8、10、12、24 h衍生進樣，記錄色譜圖。結果各主要色譜峰相對酪氨酸參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.58%～2.65%、0.69%～2.39%，圖譜導入相似度軟件處理，相似度均在0.982以上，表明供試品溶液在24 h內穩定，穩定性良好。

2.2絞股藍氨基酸指紋圖譜的建立

將8個不同產地40批絞股藍藥材按2.1項的條件進樣，通過化學工作站按表1進行積分，使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版），設定時間窗0.5，對40批不同產地絞股藍藥材HPLC指紋圖譜進行共有峰標定，結果表明共有11個峰面積在100以上的共有峰，并對同一產地樣品的色譜峰進行自動匹配生成中位數對照指紋圖譜，得到每個產地的對照譜圖，如圖2。

圖2　不同產地絞股藍氨基酸指紋對照譜圖Fig.2Fingerprints of amino acids constituents of Gynostemma pentaphylla from different Localities

2.3絞股藍藥材指紋圖譜的相似度評價

使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”對每一產地的5個批次絞股藍樣品相似度計算結果如表2，對8個產地絞股藍的對照圖譜數據進行分析，以陜西平利為參考圖譜計算相似度，結果如表3所示。

由表2、表3可見，同一產地絞股藍的指紋圖譜相似度均大于0.97，說明同一產地絞股藍中氨基酸含量相近，由表3可見，8個產地對照指紋圖譜相似度除廣西外均大于85%，說明它們性質較為相近，仔細比較各個樣本的相似度又存在一定地差別，低的只有79%左右，高的接近96%，但不能明確將不同產地樣品區分開，因此認為使用傳統的相似度評價指標進行分析得到的結果較為模糊，不能明確的區分產地。

表2　同產地絞股藍相似度計算結果Table 2The similarity Gynostemma pentaphylla between the same cultivation areas

表3　不同產地絞股藍的相似度Table 3The similarity Gynostemma pentaphylla between different cultivation areas

2.4主成分分析

根據絞股藍藥材的HPLC指紋圖譜確定共有峰11個，其中峰8（酪氨酸）為絞股藍中主要的氨基酸成分，在HPLC色譜圖中分離良好，含量較高且穩定，選擇峰8為參照峰。并對共有峰的相對峰面積比值進行考察，結果見表4。將11個共有峰峰面積比值數據導入MATLAB軟件中，進行主成分分析。

表4　8個產地11個共有峰的相對峰面積Table 4The relative peak area of common peaks for eleven batches of eight areas

分析結果表明前3個主成分的累積貢獻率已達到98.85%，前3個主成分概括了大部分的數據信息，因此使用提取的前3個主成分得分作三維圖，觀察前3個主成分得分情況，可發現各產地樣品具有明顯的聚類趨勢。橢圓形圈中部分為陜西樣品。能夠與其他產地區分開來。將各點投影到平面上，所得結果如圖3，可看出樣品很明顯的分為8類，不同產地的聚在一起成為一類，可見該方法可在一定程度上實現絞股藍產地識別。

圖3　前三主成分得分投影圖Fig.3Projection of the first three principal component scores

2.5判別分析

以各產地的11個相對峰面積前3個主成分得分及其所述屬的類型作為評價新指標，運用SPSS19.0軟件，對所得的數據進行貝葉斯判別分析，以所有組先驗概率相等進行判別，所建模型對初始分組案例的分類正確率達到了97.5%，交叉驗證的概率為95%，表明該模型的穩定性良好。可寫出8個產地的貝葉斯判別函數，分別為：

其中Xi為第i個主成分得分，將待判樣品的前3個主成分得分分別帶入上述8個貝葉斯判別函數中，計算每個判別函數的函數值g安徽、g福建、g廣西、g湖北、g湖南、g山東、g四川、g陜西。根據貝葉斯后驗概率最大原則，哪個函數值最大，則待判樣品屬于哪一類。

3結論

超聲法提取絞股藍水溶性氨基酸，采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜－熒光檢測法，建立絞股藍氨基酸類指紋圖譜，利用氨基酸類成分的高效液相指紋圖譜，結合主成分分析、判別分析對不同產地的絞股藍樣品進行分析。結果表明，傳統的使用相似度作為評價指標進行分析得到的結果較為模糊，不能明確的區分產地。而使用PCA方法明顯把陜西平利和其他產地區分開來，對其他產地也基本上能夠進行區分。利用前三組成分得分所建立的判別分析模型，為保護平利絞股藍原產地域產品以及其他不同產地的區分提供了新的方法途徑。

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Study on HPLC Fingerprints of Amino Acids Constituents for Identification of Gynostemma Pentaphylla from Different Localities

CHEN Pei-yun，WANG Xian-you，ZHAO Zhi-lei，PANG Yan-ping，LI Xiao-yang
（College of Quality&Technical Supervision，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

To establish a fingerprint analytical method according to the amino acids constituents for Identification of Gynostemma pentaphylla from eight different Localities including pingli shanxi.Free Amino Acids in Gynostemma pentaphylla were extracted by ultrasonic under water conditon，derivatized by O-phthalaldehyde，separated by Kromasil C18 column，monitored by a fluorescence detector，A HPLC fingerprints of amino acids constituents was established.Similarity combined with principal component analysis（PCA）and discriminant analysis were used to compare and analyze Gynostemma pentaphylla in different localities.PCA could discriminate clearly Gynostemma pentaphylla cultivated pingli from other cultivation areas，also could basically carry on the discrimination between other cultivation areas.And a stable discrimination analysis model was established.HPLC fingerprints of amino acids constituents coupled with PCA could be used to compare and discriminate Gynostemma pentaphylla cultivated pingli from other cultivation areas，the established discrimination analysis model for pingli cultivation areas and other cultivation areas provided a new method for protecting Gynostemma pentaphylla cultivated pingli source territory and identifying different localities.

Gynostemma pentaphylla；fingerprints of amino acids constituents；source territory；principal component analysis；discriminant analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.024

2014-02-09

質檢公益性行業科研專項項目（201210010-4）；河北大學2014-2015實驗室開放項目

陳培云（1973—），女（漢），高級實驗師，博士，主要從事食品分析檢測研究。