脂肪氧合酶結構、分子改造與發酵研究進展

劉松陸信曜周景文堵國成陳堅，2

（1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122）

脂肪氧合酶結構、分子改造與發酵研究進展

劉松1陸信曜1周景文1堵國成1陳堅1，2

（1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122）

脂肪氧合酶（EC 1.13.11.12）能專一催化氧化含有Z，Z-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸，形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物，廣泛應用于食品加工、化工、醫藥等領域。1932年首次在大豆中發現脂肪氧合酶以來，人們已在多種動植物組織和微生物中檢測到脂肪氧合酶。廣泛的來源使脂肪氧合酶結構亦呈現多樣性，包括經典結構、融合結構、無N端β-折疊結構及含錳離子結構等。為提高應用性能，定點突變和融合自組裝雙親短肽等分子改造技術已用于提高脂肪氧合酶比酶活和熱穩定性。基于發酵法的天然優勢，構建高產脂肪氧合酶的重組菌成為近年研究的熱點。總結了典型脂肪氧合酶的結構、分子改造及發酵法生產研究進展，旨為后續研究提供參考。

脂肪氧合酶；結構與功能；分子改造；發酵

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12）是一類含有非血紅素鐵，能夠專一催化氧化含有Z，Z-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸，形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物的雙加氧酶［1］。LOX的催化反應過程如下：（1）連接共軛雙鍵的C原子發生脫氫作用；（2）自由電子發生重排向+2或者-2位轉移，同時在此過程中產生變位異構體；（3）在帶有自由電子的C原子發生雙加氧反應，并在此過程中產生手性異構體（圖1）。一般情況下，LOX的天然底物為亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸，不同來源LOX對于同種底物的催化效率存在的差異［2］。

圖1 LOX催化的反應過程［3］

LOX來源多樣，在生物體內參與多種重要生命活動。1932年，Andre等［4］首次在大豆中發現了LOX，是不飽和脂肪酸氧化引起豆腥味形成的關鍵酶。LOX催化形成的脂肪酸氫過氧化物進一步酶解成茉莉酸等信號分子，調節破損植物細胞的程序性死亡、細胞性別、生長和發育及抵御外界脅迫等［5，6］。LOX還分布于鼠［7］、兔［8］和人［9］等哺乳動物中，參與白細胞三烯等信號分子的合成，影響炎癥、細胞程序性死亡、哮喘和心臟病等生理或病理過程［10，11］。藻類［12］、真菌［13］及酵母［14］等真核微生物也是LOX的重要來源。在這些生物體中，LOX參與細胞間信號傳導過程及具有抑菌作用的細菌內酯合成等［15，16］。最近，人們在念珠藻（Nostoc punctiforme）［17，18］和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［19］等原核生物中發現了LOX，但其生理功能尚不清楚［20］。

基于特殊的催化作用，LOX已在食品、化工、醫藥和造紙等工業應用或展現了較大的應用前景。LOX催化產生的脂肪酸氫過氧化物能夠破壞β-胡蘿卜素的雙鍵結構，從而提高面粉白度。隨著溴酸鉀和過氧化苯甲酰化學增白劑的禁用，無毒、無害的LOX成為其最具競爭力的替代產品［21］。LOX合成的部分不飽和脂肪酸氫過氧化物經酶解等可生成不同香味化合物，較化學合成香料具有更高的商業價值［22］。LOX催化產生的不飽和脂肪酸氫過氧化物可用于涂料、洗滌劑、聚氯乙烯、染料等化工產品的生產。LOX將花生四烯酸轉化為能抑制淋巴細胞增殖的前列腺素E2、D2和F2α等［23］。LOX能夠降低造紙沉積物中的瀝青含量，對紙漿進行漂白和脫墨［24］。

隨著LOX應用領域的拓展，獲得應用性能優良的LOX并實現其高效生產成為國內外相關研究的重要方向。對各來源LOX結構與功能的解析，是理性改造LOX的重要前提。目前，商品化的LOX主要來源于大豆提取，其批次穩定性易受大豆產地和同工酶的影響，不利于其應用推廣［25］。基于質量穩定性、生產周期和成本方面的優勢，發酵法生產是LOX工業化生產的首選方法。本文簡要總結了典型LOX的結構、分子改造及發酵法生產的研究進展，旨為其后續應用性能改造及生產提供參考。

1 脂肪氧合酶的結構

1.1 脂肪氧合酶結構類型

LOX廣泛分布于動植物和原核生物，其分子結構類型多樣。基于結構域組成，大致分為四類：（1）經典結構（圖2-A）：LOX分子N端為多個反向平行的β-折疊組成的桶狀結構域，分子量在25-30 kD；C端由α-螺旋組成的催化結構域，在催化活性中心含有一個非血紅素鐵，分子量在55-65 kD；植物和哺乳動物LOX一般為此類結構。（2）融合結構（圖2-B）：具有該類結構的LOX的末端融合了其他酶分子。如珊瑚LOX N端融合一個丙二烯氧合酶分子，魚腥藻LOX N端融合了具有過氧化氫酶特征的結構域［26］。（3）無N端β-折疊結構（圖2-C）：已發現細菌LOX具有該類結構。如P. aeruginosa 42A2 LOX分子僅由α-螺旋組成，其N端α-螺旋形成“蓋子”狀結構，覆蓋在底物結合區域上方（圖2-C）。（4）含錳離子結構：禾頂囊殼（Gaeumannomyces graminis）等少數真菌LOX催化活性中心含有一個錳離子［27］。目前尚無這類酶晶體結構的報道。

1.2 脂肪氧合酶結構域的功能

關于結構域功能的研究主要集中于具有經典結構的LOX。研究人員分別對該類LOX的N端β-折疊結構域與C端催化結構域的功能進行了深入分析。

LOX N端β-折疊結構與胰脂肪酶的C2結構域（亦稱為PLAT結構域）相似，表明該β-折疊可能同樣參與了酶與膜的結合［31，32］。事實上，缺失或定點突變大豆［33］、兔子［34］、珊瑚［35］和人［36］等來源LOX的β-折疊結構域，不僅能改變酶與生物膜的結合能力，還能引起底物親和力、轉化數、結構穩定性、活性中心鐵離子的可逆結合能力發生變化。這些結果表明，N端β-折疊結構域盡管對LOX催化活性是非必需的，但能一定程度上調節酶整體結構與催化活性中心。研究還發現，兔LOX可能通過N端β-折疊結構域隨溶劑環境變化產生“擺動”來調節酶結構和活性［37］。軟珊瑚（Gersemia fruticosa）LOX的晶體結構顯示，β-折疊結構域保守序列FPCYRW中Trp107與其C端催化結構域中的Lys172之間存在一個陽離子-芳環作用，進而影響催化結構域底物結合口袋的構象［38］。上述研究從分子水平上揭示了N端β-折疊結構域調節LOX結構與活性的機制。

圖2 LOX的結構

已知晶體結構的LOX中，催化活性中心均位于C端α-螺旋結構域，非血紅素鐵參與構成催化活性中心。由于LOX底物為疏水性不飽和脂肪酸，各來源酶的底物結合通道主要由亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等具有疏水性側鏈的氨基酸殘基組成［20］。但不同LOX的底物結合通道各具特點（圖3）：兔子12/15-LOX底物結合區域呈較淺的“靴形”；柳珊瑚8R-LOX存在一個兩頭通透的“U形”底物結合通道；大豆LOX-1則形成“T形”底物結合通道。由于無法得到結合氧分子的LOX晶體結構，目前僅通過定點突變預測氧分子入口。兔12/15-LOX L367突變增加的空間位阻降低了氧分子擴散，表明該位點是可能的氧分子入口［39］；大豆LOX-1中的氧分子擴散通道則受到Ile553調控［28］；柳珊瑚8R-LOX的氧分子通道尚不清楚。

1.3 脂肪氧合酶結構與產物特異性的關系

基于LOX催化反應的特點，其產物特異性主要包括位置異構體特異性和手性異構體特異性［40］。盡管尚無理論能夠解釋所有LOX的產物特異性，但針對真核生物LOX的相關研究已取得一定進展。

通過結構模擬確定了黃瓜LOX分子影響產物特異性的H608，將該氨基酸突變為纈氨酸后，催化產物由亞油酸13位氫過氧化物變為9位氫過氧化物［41］。序列比對分析揭示了哺乳動物LOX分子中存在與產物位置異構體特異性相關特征區域，如人體15-LOX 417-418位氨基酸等［42］。底物結合研究顯示，哺乳動物15-LOX通過分子內底物結合口袋與底物（甲酯化的不飽和脂肪酸）疏水端結合，酶分子表面與底物親水端的堿性氨基酸殘基結合，進而控制位置異構體的比例［43］。因此，LOX催化產物的位置異構體類型可能受底物進入催化活性中心方式的影響，單點氨基酸可改變該產物特異性。目前，已在真核LOX的C端發現了與產物手性異構體相關的保守序列，命名為“coffa site”。LOX分子在該位點的保守氨基酸為丙氨酸和甘氨酸時，產物的手性異構體分別為S型和R型［44-46］。隨著不同來源LOX底物通道的深入解析［20］，其產物手性異構體特異性的分子機制將被進一步闡明。

圖3 LOX底物通道和氧分子通道示意圖［20］

近年來，部分結合底物或底物類似物的LOX晶體結構被解析，如來源于哺乳動物的15-LOX2與底物類似物［47］和8R-LOX與底物［48］的復合物晶體結構等，為LOX催化機制及產物特異性的研究提供了更精確的結構信息。

2 脂肪氧合酶的分子改造

多數真核生物LOX具有較高的熱穩定性，分子改造主要以提高酶催化效率為目標。如前所述，大豆等植物LOX的C端結構域為催化活性區域，N端β-折疊結構域對LOX活性有重要調控作用。研究顯示，缺失N端β-折疊區域能使大豆LOX疏水區域的暴露增多、酶分子柔性增加，比酶活提高3倍，但熱穩定性下降［49，50］。在橄欖LOX-1的C端結構域中，分別將底物結合位點Phe277和Tyr280突變為側鏈體較小的丙氨酸和異亮氨酸殘基后，LOX-1突變體比酶活提高93倍［51］。

作者對P. aeruginosa BBE LOX熱穩定性和比酶活進行了改造。結構分析顯示，P. aeruginosa LOX N端30個氨基酸殘基及分子內部201-206位氨基酸殘基均為高柔性的loop結構（圖2-C）。通過缺失了N端前30個氨基酸，P. aeruginosa LOX 于50℃的半衰期較野生酶提高2.1倍，比酶活亦保持90%以上［52］。將該Gly201和Gly206之間的序列替換為剛性更強的PT linker，LOX熱穩定性有進一步提高［52］。由于LOX底物主要為疏水性的不飽和脂肪酸，作者將疏水較強的自組裝雙親短肽（圖4-A）融合至P. aeruginosa LOX N端，使其比酶活及50℃半衰期分別提高2.8倍和3.6倍，并指出寡聚化是融合酶熱穩定性提高的重要原因之一［53］（圖4-B）。

3 脂肪氧合酶的發酵法生產

目前，商品化的LOX主要從大豆中提取。由于大豆中存在多種LOX同工酶，其含量和種類隨大豆的批次變化，導致LOX的產品質量不穩定［25］。與傳統提取法相比，微生物發酵法能保證LOX產品批次穩定性的同時，產量更高、生產成本更低。由于產量極低或致病性等原因，自然環境中篩選得到的LOX生產菌，如寄生水霉（Saprolegnia parasitica）［54］、G. graminis［55］和P. aeruginosa［56］等，不適合工業生產。因此，構建高產重組菌成為發酵法生產LOX的關鍵。

圖4 融合自組裝雙親短肽提高LOX熱穩定的機制

真核生物LOX異源表達已有大量報道，但總體產酶水平不高。其中，大豆LOX在大腸桿菌（Escherichia coli）中的表達量最高（4.5 U/mL），但為胞內表達［57］。通過融合不同分泌信號肽，豌豆［58］、豬白細胞［59］和G. graminis［55］等來源的LOX可被釀酒酵母或畢赤酵母分泌至培養基中，但產量極低，遠不能滿足工業化生產要求。原核生物來源LOX的異源表達同樣面臨表達量低、難分泌至胞外等問題。盡管N. punctiforme［17］、P. aeruginosa［60］等多個原核生物LOX在大腸桿菌中表達，但未見產量的相關報道。最近報道顯示，魚腥藻（Anabaena sp. PCC 7120）LOX在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168 nprB介導下可被B. subtilis WB800分泌至胞外，實現了LOX在食品級宿主中表達的突破［61］。但按標準酶活定義計算［57］，其胞外LOX產量僅為0.01 U/mL，產酶水平有待進一步提高。作者的研究發現，P. aeruginosa LOX的天然信號肽可促進其在E. coli BL21（DE3）中分泌［40］，經3 L罐表達條件優化，胞外LOX酶活達到8.3 U/mL［62］。然而，較低的產酶溫度（20℃）是LOX的工業化生產亟待解決問題［62］。

由于發酵法產LOX的總體水平不高，從發酵液中提取LOX的報道較少。目前尚需多步柱純化才能獲得較高純度的LOX，且酶活收率低，純化技術仍停留于研究階段。重組B. subtilis WB800分泌的LOX需經DEAE-Sephacel、Sephadex G-100和Ni-NTA agarose三步柱純化才能達到電泳純，酶活收率僅為5%［61］。在重組E. coli 中獲得13.5倍純化的LOX需經Q High Performance和Mono Q兩步柱純化，酶活收率也僅達到10%［40］。導致收率低的重要原因之一，可能是上述重組LOX的穩定性不佳［40］。因此，進一步提高LOX的穩定性，壓縮純化工藝流程是實現工業規模純化LOX的關鍵。

4 結論

隨著應用研究的深入，LOX在食品加工、化工、醫藥等領域展現良好的應用前景。在此背景下，如何獲得具有良好應用性能的LOX并實現其高效發酵生產，將是LOX后續研究的重點。由于目前尚無可供工業化生產的野生菌株，基于食品級表達系統（枯草芽孢桿菌、解脂亞洛酵母和米曲霉等）構建高效分泌LOX的重組菌是實現發酵法生產LOX最緊迫的任務之一。基于分泌效率的優勢，原核生物來源的LOX較真核生物來源的LOX更適于通過基因工程菌進行工業化生產。然而，與大豆脂肪氧合酶相比，原核生物來源（如P. aeruginosa BBE和P. aeruginosa 42A2等）LOX的熱穩定較差［40］。因此，加強對原核LOX熱穩定性改造同樣應引起足夠重視。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Advance on the Structure，Molecular Modification，and Fermentation of Lipoxygenases

Liu Song1Lu Xinyao1Zhou Jingwen1Du Guocheng1Chen Jian1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

Lipoxygenases（EC1.13.11.12）catalyze and oxidize the polyunsaturated fatty acids containing Z， Z-1， 4-pentadiene structures to form the conjugated hydroperoxides of fatty acid， and they are widely used in food industry， chemical industry and pharmaceutical industry. Since lipoxygenase was firstly discovered in soybean in 1932， it has been detected in many animal and vegetable tissues as well as microorganisms. Broad sources led to various structure types of lipoxygenase， including classic， fusing， β-sheet deleted， and Mn2+-containing structures. To improve the application performance， molecular modification techniques， such as site-directed mutagenesis and fusing with selfassembling amphiphilic peptides， have been used to enhance the specific activity and thermal stability of lipoxygenase. Considering the natural advantages of fermentation method， the construction of recombinant strains producing high-yield lipoxygenase has become the research hotspot recently. The advances on the structure， molecular modification， and fermentation of classic lipoxygenases were briefly summarized for providing a reference for further studies.

lipoxygenase；structure and function；molecular modification；fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.005

2015-04-21

國家自然科學基金項目（31401638），國家高技術研究發展計劃項目（2011AA100905）

劉松，男，博士，研究方向：酶工程；E-mail：liusong@jiangnan.edu.cn

堵國成，男，博士，研究方向：發酵工程；E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn