rAAV規(guī)模化包裝系統(tǒng)的研究進(jìn)展

占申標(biāo) 唐明青 甘娜 曹苑青 李招發(fā)

（華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，泉州 362021）

rAAV規(guī)模化包裝系統(tǒng)的研究進(jìn)展

占申標(biāo) 唐明青 甘娜 曹苑青 李招發(fā)

（華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，泉州 362021）

重組腺相關(guān)病毒（rAAV）作為唯一一種通過歐盟FDA認(rèn)證的基因治療載體，具有宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高、非致病性、免疫原性低、能夠長期表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)。隨著以rAAV基因治療臨床試驗(yàn)的深入與擴(kuò)大，傳統(tǒng)rAAV包裝系統(tǒng)產(chǎn)能不足的缺點(diǎn)逐漸凸顯出來，急需可放大、易規(guī)模化的rAAV包裝系統(tǒng)來解決現(xiàn)有的供需矛盾。鑒于此，在介紹傳統(tǒng)rAAV包裝系統(tǒng)的基礎(chǔ)之上，著重闡述了桿狀病毒昆蟲細(xì)胞系法、酵母法以及痘苗病毒-腺病毒法，尤其對后者寄予厚望。旨在介紹幾種較好的rAAV規(guī)模化包裝方案，探討其規(guī)模化制備的發(fā)展趨勢。

重組腺相關(guān)病毒；基因治療；載體；包裝系統(tǒng)

腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）為復(fù)制缺陷型病毒，屬細(xì)小病毒家族，至今還沒有發(fā)現(xiàn)與人類的任何疾病相關(guān)，其能定點(diǎn)整合到人類基因組19號染色體上［1］。另外，AAV還有免疫原性弱、宿主范圍廣、理化性質(zhì)穩(wěn)定、長期表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)［2-4］，因此AAV被認(rèn)為是介導(dǎo)基因治療的理想載體之一。重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）源于非致病的野生型AAV，在醫(yī)學(xué)研究中，rAAV被用于多種疾病的基因治療的研究（包括體內(nèi)、體外）；同時作為一種有特點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)移載體，還廣泛用于基因功能研究、構(gòu)建疾病模型、制備基因敲除鼠等方面。目前有關(guān)以rAAV為載體的基因治療臨床研究報(bào)道已經(jīng)超過90多項(xiàng)［4］。

作為基因載體，rAAV進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用的一個關(guān)鍵性問題是如何規(guī)模化制備經(jīng)濟(jì)、安全、質(zhì)量可控的rAAV載體，文章旨在介紹幾種新型規(guī)模化生產(chǎn)rAAV的方法，探討基因治療中rAAV載體規(guī)模化制備的發(fā)展趨勢。

1 rAAV制備的兩個重要過程

1.1 rAAV衣殼蛋白的裝配

1.1.1 rAAV的包裝原件 AAV基因組為約4.7 kb的單鏈DNA，兩個末端是倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR），是AAV整合、復(fù)制、拯救和包裝所必須的順式作用元件，并具轉(zhuǎn)錄啟動子活性。ITR序列之間包含兩個開放閱讀框，稱為Rep和Cap，分別編碼4個Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和3個Cap蛋白（VP1、VP2和VP3）以及1個最近幾年才發(fā)現(xiàn)的裝配激活蛋白（AAP）（圖1）［5，6］，這幾種蛋白均在rAAV的包裝過程中扮演極其重要的角色。其中Rep78和Rep68的轉(zhuǎn)錄由p5啟動子控制，Rep52和Rep40由p19啟動子起始轉(zhuǎn)錄，p40啟動子調(diào)節(jié)Cap蛋白VP1、VP2和VP3的轉(zhuǎn)錄［7］。

圖1 AAV基因組結(jié)構(gòu)

1.1.2 rAAV病毒樣粒子的裝配 研究稱在細(xì)胞內(nèi)，rAAV病毒樣粒子的裝配只需Cap基因表達(dá)即可完成，且裝配在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行［8］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，Cap基因只編碼VP1、VP2和VP3三種蛋白，但是病毒樣粒子的形成究竟是需要三種蛋白、兩種蛋白還是一種蛋白，一直存在爭論。VP1和VP2主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，而單體的VP3在核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有分布，表明VP1、VP2和VP3在裝配過程中具有不同的行為。VP1和VP2上都具有核定位信號（166PARKRLNF173），可能起到運(yùn)送VP3進(jìn)入細(xì)胞核的作用［9］。因?yàn)橐職け砻嫒坑蒝P3序列（包括VP3、VP1和VP2的C末端）組成，VP1和VP2的N末端位于衣殼的內(nèi)部，因此爭論的焦點(diǎn)主要是VP3單獨(dú)能否組裝出rAAV病毒樣粒子。

最初Ruffing等［10］在HeLa細(xì)胞中利用質(zhì)粒單獨(dú)表達(dá)VP3并不能形成rAAV病毒樣粒子，但如果將VP3與VP1或VP2共表達(dá)，則可見rAAV病毒樣粒子形成；利用桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞系sf9表達(dá)VPs的研究表明，VP3單獨(dú)表達(dá)也不能形成rAAV病毒樣粒子。然而Warrington等［11］發(fā)現(xiàn)，在293細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)VP3能產(chǎn)生rAAV病毒樣粒子。針對這一貌似矛盾的結(jié)論，Sonntag等［5］展開研究，發(fā)現(xiàn)Cap基因還編碼另外一種蛋白AAP，其編碼框介于VP2和VP3之間。該研究顯示，VP3單獨(dú)不能形成rAAV病毒樣粒子，但是如果與表達(dá)AAP的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，則能形成rAAV病毒樣粒子［11］。在Ruffing的研究中，VP3表達(dá)質(zhì)粒只包含VP3序列本身，不能表達(dá)AAP，正是這一質(zhì)粒構(gòu)建上的差別導(dǎo)致其與Warrington實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。AAP主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，協(xié)助VPs蛋白從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，起到病毒裝配的支架作用，還可能協(xié)助VPs進(jìn)行正確折疊。1.1.3 其他因素在rAAV病毒樣粒子裝配中的作用 除了AAP之外，在細(xì)胞核內(nèi)，可能還有其他因子協(xié)助完成rAAV衣殼的裝配，包括Rep蛋白、核仁磷蛋白等。

rAAV病毒樣粒子在細(xì)胞核內(nèi)裝配時，衣殼蛋白分子并非獨(dú)立存在，而是與Rep蛋白發(fā)生交聯(lián)。在rAAV制備過程中，這一交聯(lián)比較容易受到破壞，故在目前制備的rAAV中檢測不到Rep蛋白，但是這并不能否認(rèn)Rep蛋白在rAAV病毒樣粒子形成中的作用［12］。

rAAV感染后完整衣殼最初呈現(xiàn)于核仁中，隨后遍及整個細(xì)胞核，表明核仁的某些成分在衣殼蛋白裝配過程中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA干擾核仁磷蛋白，rAAV載體的基因表達(dá)效率可以提高5-15倍，表明核仁磷蛋白確實(shí)與rAAV在核內(nèi)的行為存在聯(lián)系［13］。另有研究表明，核仁磷蛋白可與衣殼之間存在直接的連接，而且核仁磷蛋白還具有與Rep結(jié)合的能力［14］。

除了某些蛋白成分可能影響衣殼裝配外，細(xì)胞本身的環(huán)境因素也可能對rAAV病毒樣粒子的裝配起到至關(guān)重要的作用，如ATP、溫度等。

1.2 DNA的衣殼化

rAAV衣殼蛋白的裝配和DNA的衣殼化是rAAV包裝過程中兩個最為重要的過程。這兩個過程目前有了總體上的認(rèn)識，雖然許多細(xì)節(jié)還無法知曉，尤其是基因組進(jìn)入衣殼的過程還知之甚少。現(xiàn)有的rAAV包裝機(jī)制模型達(dá)成了以下基本共識：先是Rep蛋白連接單鏈DNA（ssDNA）的ITR以及Cap蛋白，將ssDNA定位于衣殼表面，接下來ssDNA借助于Rep蛋白的螺旋酶活性和ATPase活性，以3'-5'為方向，在衣殼五倍軸的頂端小孔進(jìn)入衣殼。其中，ssDNA導(dǎo)入已經(jīng)形成的病毒衣殼的具體機(jī)制還未研究清楚［15］（圖2）。

圖2 AAV衣殼以及五倍軸小孔的結(jié)構(gòu)

2 rAAV的經(jīng)典包裝系統(tǒng)

從rAAV被用作基因載體開始，研究者就在嘗試各種高效制備rAAV的方法，以達(dá)到方便、靈活、規(guī)模化制備能滿足科研研究和臨床所需rAAV的目的。目前應(yīng)用最廣的是三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞法獲得rAAV。三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法即將一個提供外源基因和ITR的質(zhì)粒、一個提供rAAV輔助功能的質(zhì)粒、一個提供腺病毒輔助功能的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主HEK293細(xì)胞。三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法最大的優(yōu)點(diǎn)是不用加輔助病毒，排除了輔助病毒對rAAV的污染，方便制備各種血清型的rAAV，使制備和純化步驟大為簡化，制備的rAAV基本可以滿足實(shí)驗(yàn)室研究所用。

3 rAAV的新型包裝系統(tǒng)

3.1 利用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞系sf9來表達(dá)rAAV

近些年來，桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)在蛋白質(zhì)表達(dá)和病毒制備等方面發(fā)揮重要的作用，特別是Bacto-Bac系統(tǒng)大大簡化了桿狀病毒的制備過程。陳雅寧等［17］設(shè)想利用桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)制備rAAV，克服傳統(tǒng)方法中的諸多限制因素，滿足臨床級別rAAV的要求。將rAAV的ITR及目的基因表達(dá)框從pAAV-MCS剪切引入桿狀病毒載體中構(gòu)建順式載體，rAAV的衣殼和復(fù)制蛋白基因在反式pFastBacDual中利用真核基因遺漏掃描原理表達(dá)，兩者分別制備成桿狀病毒，共感染昆蟲細(xì)胞sf9來完成rAAV拯救、復(fù)制和包裝過程。病毒滴度可達(dá)1×108-3×108VG/mL。增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）作為報(bào)告基因驗(yàn)證其可行性，將生產(chǎn)的rAAV-EGFP感染293T細(xì)胞測試得知其具有良好的生物學(xué)活性，該系統(tǒng)具有高效、安全、簡便等特點(diǎn)，為臨床級rAAV制備和基因治療奠定了基礎(chǔ)。

另外，Urabe等［18］建立的昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)，避免了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞效率低的問題，這種方法需要3種桿狀病毒，rBac-Rep、rBac-Cap、rBac-ITRGFP-ITR分別提供Rep、Cap、ITR和目的基因，先在sf9細(xì)胞中擴(kuò)增3種桿狀病毒，然后將純化的桿狀病毒共感染懸浮培養(yǎng)的sf9細(xì)胞，就可以大規(guī)模制備rAAV。病毒感染法無需瞬時轉(zhuǎn)染，也不需要建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，所有元件都由病毒提供。此法優(yōu)點(diǎn)主要有：桿狀病毒感染細(xì)胞后產(chǎn)生的子代病毒可以繼續(xù)感染細(xì)胞，大大提高了制備效率；可以在制備過程中對各種參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測和控制；避免了瞬時轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞這一限制性步驟；容易大規(guī)模培養(yǎng)；制備成本低［19］。但桿狀病毒缺乏遺傳學(xué)和物理學(xué)穩(wěn)定性是此系統(tǒng)目前面臨的最大挑戰(zhàn)。

3.2 利用痘苗病毒規(guī)模化和安全化制備rAAV載體

盡管最近幾年以rAAV為載體基因治療的臨床研究比較成功，但是大規(guī)模化和高效的生產(chǎn)高質(zhì)量的rAAV依然面臨不少難題。Dong等［20］采用能在細(xì)胞質(zhì)完成生命周期的痘苗病毒（VV）作為rAAV輔助元件Rep-Cap的表達(dá)載體，以腺病毒-腺相關(guān)病毒（Ad-AAV）雜合載體作為rAAV載體基因組和輔助病毒基因組的提供者。這樣就使rAAV輔助基因位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而rAAV DNA能夠整合到宿主的細(xì)胞核中，它們便處于兩個不同的亞細(xì)胞部位，從空間上避免了普遍存在的非同源重組的發(fā)生，使得野生型有復(fù)制能力AAV（rcAAV）的污染得以首次徹底消除（圖3）。在懸浮的HeLa細(xì)胞中，每個細(xì)胞獲得的rAAV載體產(chǎn)量接近于傳統(tǒng)的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所得。由于當(dāng)今分析條件的限制，很難有效發(fā)現(xiàn)rcAAV的污染，這種新的方法有效的解決了這一難題，無疑為rAAV載體介導(dǎo)的基因治療帶來了福音。新的rAAV載體制備系統(tǒng)不但可以應(yīng)用于rAAV的生產(chǎn)，同樣也適用于其它DNA載體的生產(chǎn)，至此使得大規(guī)模和有效地rAAV生產(chǎn)得以實(shí)現(xiàn)［20］。

圖3 VV輔助生產(chǎn)rAAV［20］

因?yàn)锳AV是缺陷型的單鏈DNA病毒，AAV的DNA的復(fù)制和包裝發(fā)生于宿主細(xì)胞的核中，故現(xiàn)行的rAAV生產(chǎn)方法都需要rAAV輔助基因在宿主核中轉(zhuǎn)錄［5］。鑒于rAAV載體基因組在宿主細(xì)胞核大量的擴(kuò)增，而且與輔助基因組鄰近，rAAV的Rep和Cap基因以及ITRs不可避免地發(fā)生非同源重組，從而導(dǎo)致rcAAV的形成。在以rAAV為載體的基因治療中，rcAAV有可能阻止轉(zhuǎn)基因的高效表達(dá)，對病人造成傷害［21，22］。

研究和臨床試驗(yàn)中最主要的生產(chǎn)rAAV載體的方法就是三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法［23］，但是該法的成本和實(shí)驗(yàn)條件要求都比較高，在臨床中很難得以廣泛的應(yīng)用。這一新的生產(chǎn)rAAV的方法，利用VV的200 kb基因組復(fù)制可在宿主的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，不需要進(jìn)入核中［24］，得以使此病毒攜帶生產(chǎn)rAAV所需的所有輔助基因。這個方法不但提高了rAAV的產(chǎn)量，也避免了非同源重組的發(fā)生，這樣也就阻止了rcAAV的干擾。

由于避免了rcAAV的干擾，這個新的重組方法沒有潛在的病毒蛋白的生成，就不會使基因治療中的轉(zhuǎn)基因治療過程復(fù)雜化，也不會對人體有害。沒有rcAAV形式的DNA干擾，也有可能對人類的基因治療造成新的威脅［25］，但是此問題現(xiàn)在還沒有研究清楚。隔離輔助基因于細(xì)胞質(zhì)，可以阻止其與核內(nèi)的復(fù)制的載體基因組共定位，同樣也會減少干擾，這又是此新方法的一個潛在優(yōu)勢。而且組裝rAAV載體所需元件全由病毒提供，不但可以感染懸浮細(xì)胞，也可以模擬野生型AAV的復(fù)制和包裝機(jī)制，從而高效、高質(zhì)量的制備rAAV載體，為解決rAAV的規(guī)模化生產(chǎn)和低免疫毒性提供了可能。

新制備系統(tǒng)的每個細(xì)胞的載體產(chǎn)量相當(dāng)于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法的最佳產(chǎn)量，表明細(xì)胞質(zhì)中VV的幫助不會影響rAAV的復(fù)制和包裝。利用GFP作為報(bào)告基因可知：此法生產(chǎn)的載體與傳統(tǒng)方法相比，在體內(nèi)效率一樣高效。獨(dú)特的排除rcAAV干擾和能大規(guī)模生產(chǎn)使得這一新方案將替代傳統(tǒng)的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法，成為rAAV載體高效生產(chǎn)的首選。此外，此法靈活性很強(qiáng)：當(dāng)需要生產(chǎn)其他血清型的rAAV亞型時，僅僅只需要替換確定亞型的vv-VP1和vv-VP2序列，這樣就可形成所需rAAV亞型的衣殼蛋白。VV也不是rAAV生產(chǎn)中最有效的輔助病毒，將腺病毒輔助基因整合到VV基因組中，能使生產(chǎn)更高效。腺病毒-痘苗病毒雜交體既有生長周期短，感染高效以及精準(zhǔn)起始基因復(fù)制，同時也能使rAAV載體生長在許多哺乳細(xì)胞的懸浮液中，不僅僅是HEK293。總之，VV輔助的這一新方法加以有效利用，能夠保證人類臨床試驗(yàn)所需的rAAV基因載體的質(zhì)量和產(chǎn)量，對基因治療臨床事業(yè)的發(fā)展將有巨大的貢獻(xiàn)［20］。

3.3 利用酵母系統(tǒng)包裝AAV衣殼，為生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒提供了新思路

釀酒酵母的發(fā)育過程中支持許多不同的RNA或DNA病毒的復(fù)制，為病毒樣粒子的形成提供了一種大規(guī)模、節(jié)約成本和提高時效的方法，例如，Human Parvovirus B19。Backovic等［7］近期研究表明單鏈的AAV2基因組能在釀酒酵母RSY12中從環(huán)狀質(zhì)粒起始AAV的包裝。此研究報(bào)道也證實(shí)了酵母系統(tǒng)中包裝AAV衣殼的可行性。

在釀酒酵母中進(jìn)行AAV病毒樣粒子的包裝，至少需要AAV三個結(jié)構(gòu)蛋白中的VP1和VP3參與。通過共轉(zhuǎn)染兩個質(zhì)粒到酵母細(xì)胞而實(shí)施：YEplacRepCap質(zhì)粒由p40啟動子來起始VP3的表達(dá)，另外由誘導(dǎo)酵母啟動子Gal1起始修飾的AAV2 Cap基因pYESVP1KM質(zhì)粒來表達(dá)VP1蛋白。最好的方案是在含0.5%葡萄糖和5%半乳糖的培養(yǎng)基誘導(dǎo)后4.5 h得到最佳的VP1∶VP3的比例。通過兩步超速離心，就能從酵母中分離出AAV病毒樣粒子。在CsCl密度梯度離心后，衣殼樣粒子位于f8-f11部分，密度為1.386-1.394 g/cm3，有與野生型AAV2衣殼相似的衣殼蛋白。透射電子顯微鏡分析可知：由酵母獲得的AAV病毒樣粒子與人類細(xì)胞產(chǎn)生的空衣殼形態(tài)上相似。Backovic［7］的研究第一次表明酵母系統(tǒng)也能用來包裝AAV衣殼，為rAAV的生產(chǎn)提供了新的思路，對以rAAV為載體的基因治療臨床試驗(yàn)意義重大。

4 展望

雖然在過去的十幾年中，提出了一些比較好的大規(guī)模生產(chǎn)rAAV載體的方法［26-28］，但由于各種各樣的不足始終無法得以推廣。例如：桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)解決了轉(zhuǎn)染問題，但在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV會使得感染力下降［16，29，30］。細(xì)胞法生產(chǎn)rAAV不穩(wěn)定［31］，同時需要大量篩選實(shí)現(xiàn)最高效。所有的載體生產(chǎn)系統(tǒng)都必須考慮輔助病毒的穩(wěn)定性和安全性，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的新方案，VV輔助病毒穩(wěn)定且生產(chǎn)效率高，不會被AAV Rep和Cap基因產(chǎn)物所抑制，這點(diǎn)腺病毒無法做到。本課題組之前也設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種新型的、細(xì)胞特異性的、內(nèi)含多個組織特異如肝特異和造血特異序列拷貝的microRNA結(jié)合序列的基因片段，通過控制包裝蛋白基因片段表達(dá)，進(jìn)而清除腺相關(guān)病毒包裝蛋白污染誘發(fā)的rAAV載體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而保證基因治療取得成功［32］。

隨著rAAV在基因治療中存在的問題被逐漸解決，如使用雜合的rAAV載體、對rAAV的外殼進(jìn)行修飾等方法降低其免疫原性和提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率［33，34］；使用雙鏈rAAV基因組提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率［35］等，rAAV作為一種高效、安全性的轉(zhuǎn)基因載體在人類基因治療中的優(yōu)勢會越發(fā)明顯。隨著rAAV規(guī)模化生產(chǎn)工藝不斷成熟，rAAV在基因治療上的諸多優(yōu)點(diǎn)都表明rAAV在臨床上的廣泛應(yīng)用將成為基因治療領(lǐng)域不可阻擋的趨勢［3］。在現(xiàn)今的研究基礎(chǔ)之上，還需要去解決面臨的新問題，從而有助于rAAV載體介導(dǎo)的基因治療臨床事業(yè)的迅速發(fā)展。

［1］ Hüser D， Gogol-D?ring A， Lutter T， et al. Integration preferences of wildtype AAV-2 for consensus rep-binding sites at numerous loci in the human genome［J］. PLoS Pathogens， 2010， 6：e1000985.

［2］ van der Laan LJ， Wang Y， Tilanus HW， et al. AAV-mediated gene therapy for liver diseases：the prime candidate for clinicalapplication？［J］. Expert Opinion on Biological Therapy， 2011，11：315-327.

［3］許瑞安， 肖衛(wèi)東. 分子基因藥物學(xué)［M］. 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社， 2008.

［4］王啟釗， 呂穎慧， 肖衛(wèi)東， 等. 重組腺相關(guān)病毒載體臨床實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中國生物工程雜志， 2010， 30：73-79.

［5］Sonntag F， Schmidt K， Kleinschmidt JA. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2010， 107：10220-10225.

［6］Sonntag F， K?ther K， Schmidt K， et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes［J］. Journal of Virology， 2011， 85：12686-12697.

［7］Backovic A， Cervelli T， Salvetti A， et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae［J］. Microbial Cell Factories， 2012， 11：124.

［8］Wistuba A， Kern A， Weger S， et al. Subcellular compartmentalization of adeno-associated virus type 2 assembly［J］. Journal of Virology，1997， 71：1341-1352.

［9］Hoque M， Ishizu KI， Matsumoto A， et al. Nuclear transport of the major capsid protein is essential for adeno-associated virus capsid formation［J］. Journal of Virology， 1999， 73：7912-7915.

［10］Ruffing M， Zentgraf H， Kleinschmidt J. Assembly of viruslike particles by recombinant structural proteins of adeno-associated virus type 2 in insect cells［J］. Journal of Virology， 1992， 66：6922-6930.

［11］ Warrington KH， Gorbatyuk OS， Harrison JK， et al. Adenoassociated virus type 2 VP2 capsid protein is nonessential and can tolerate large peptide insertions at its N terminus［J］. Journal of Virology， 2004， 78：6595-6609.

［12］ Bleker S， Pawlita M， Kleinschmidt JA. Impact of capsid conformation and Rep-capsid interactions on adeno-associated virus type 2 genome packaging［J］. Journal of Virology， 2006，80：810-820.

［13］Johnson JS， Samulski RJ. Enhancement of adeno-associated virus infection by mobilizing capsids into and out of the nucleolus［J］. Journal of Virology， 2009， 83：2632-2644.

［14］Bevington JM， Needham PG， Verrill KC， et al. Adeno-associated virus interactions with B23/Nucleophosmin：identification of subnucleolar virion regions［J］. Virology， 2007， 357：102-113.

［15］DiPrimio N， Asokan A， Govindasamy L， et al. Surface loop dynamics in adeno-associated virus capsid assembly［J］. Journal of Virology， 2008， 82：5178-5189.

［16］Bleker S， Sonntag F， Kleinschmidt JA. Mutational analysis of narrow pores at the fivefold symmetry axes of adeno-associated virus type 2 capsids reveals a dual role in genome packaging and activation of phospholipase A2 activity［J］. J Virol， 2005， 79（4）：2528-2540.

［17］陳雅寧， 王春榮， 楊宗燦， 等. Bac-to-Bac桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)的重組腺相關(guān)病毒制備［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012， 29：1363-1366.

［18］Urabe M， Ding C， Kotin RM. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors［J］. Human Gene Therapy，2002， 13：1935-1943.

［19］王峰， 刁勇， 肖衛(wèi)東， 等. 重組腺相關(guān)病毒規(guī)模化生物包裝技術(shù)［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2009， 25：1608-1613.

［20］Dong B， Moore AR， Dai J， et al. A concept of eliminating nonhomologous recombination for scalable and safe AAV vector generation for human gene therapy［J］. Nucleic Acids Research，2013， 41：6609-6617.

［21］Mingozzi F， Maus MV， Hui DJ， et al. CD8+ T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans［J］. Nature Medicine，2007， 13：419-422.

［22］ Pien GC， Basner-Tschakarjan E， Hui DJ， et al. Capsid antigen presentation flags human hepatocytes for destruction after transduction by adeno-associated viral vectors［J］. The Journal of Clinical Investigation， 2009， 119：1688-1695.

［23］ Allay JA， Sleep S， Long S， et al. Good manufacturing practice production of self-complementary serotype 8 adeno-associated viral vector for a hemophilia B clinical trial［J］. Human Gene Therapy， 2011， 22：595-604.

［24］ Moss B， Earl PL. Overview of the vaccinia virus expression system［J］. Current Protocols in Protein Science， 1998， 16.15.1-16.15.5.

［25］ Halbert CL， Metzger MJ， Lam SL， et al. Capsid-expressing DNA in AAV vectors and its elimination by use of an oversize capsid gene for vector production［J］. Gene Therapy， 2011， 18：411-417.

［26］ Qiao C， Li J， Skold A， et al. Feasibility of generating adenoassociated virus packaging cell lines containing inducible adenovirus helper genes［J］. Journal of Virology， 2002， 76：1904-1913.

［27］Smith RH， Levy JR， Kotin RM. A simplified baculovirus-AAV expression vector system coupled with one-step affinity purification yields high-titer rAAV stocks from insect cells［J］. Molecular Therapy， 2009， 17：1888-1896.

［28］Wright J， Qu G， Tang C， et al. Recombinant adeno-associated virus：formulation challenges and strategies for a gene therapy vector［J］. Current Opinion in Drug Discovery & Development，2003， 6：174-178.

［29］Lock M， Alvira M， Vandenberghe LH， et al. Rapid， simple， and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale［J］. Human Gene Therapy， 2010， 21：1259-1271.

［30］Clément N， Knop DR， Byrne BJ. Large-scale adeno-associated viral vector production using a herpesvirus-based system enables manufacturing for clinical studies［J］. Human Gene Therapy，2009， 20：796-806.

［31］Qiao C， Wang B， Zhu X， et al. A novel gene expression control system and its use in stable， high-titer 293 cell-based adenoassociated virus packaging cell lines［J］. Journal of Virology，2002， 76：13015-13027.

［32］Lu H， Qu G， Yang X， et al. Systemic elimination of de novo capsid protein synthesis from replication-competent AAV contamination in the liver［J］. Human Gene Therapy， 2011， 22：625-632.

［33］Zaiss A， Muruve D. Immunity to adeno-associated virus vectors in animals and humans：a continued challenge［J］. Gene Therapy，2008， 15：808-816.

［34］Farris KD， Pintel DJ. Improved splicing of adeno-associated viral（AAV）capsid protein-supplying pre-mRNAs leads to increased recombinant AAV vector production［J］. Human Gene Therapy，2008， 19：1421-1427.

［35］Wang J， Xie J， Lu H， et al. Existence of transient functional double-stranded DNA intermediates during recombinant AAV transduction［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2007， 104：13104-13109.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress Regarding to Large-scale Packaging System of rAAV

Zhan Shenbiao Tang Mingqing Gan Na Cao Yuanqing Li Zhaofa
（School of Biomedical Sciences，Huaqiao University，Quanzhou 362021）

As the only gene therapy vector certificated by EU FDA， recombinant adeno-associated virus（rAAV）has advantages of wide host range， high transfection efficiency， non-pathogenic， low immunogenicity and long-term expression of transgenosis. With the expansion of applying rAAV for gene therapy clinical trials， the shortage of capacity of packing system in traditional rAAV has emerged， thus the rAAV packaging system that can be easily enlarged and scaled up to solve the existing problem of supply and demand is in urgent need. Therefore， on the basis of describing traditional rAAV packaging system， the focus of this review is to emphatically expound the baculovirus insect cell lines，yeast， and vaccinia virus-adenovirus method， especially with more expectation to the last one. The aim of this article is to introduce several preferable systems for scale packaging of rAAV， and discuss the trend of development.

rAAV；gene therapy；vector；packaging system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.009

2015-02-10

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（JB-ZR1142）

占申標(biāo)，男，碩士研究生，研究方向：基因治療；E-mail：1200416004@hqu.edu.cn

李招發(fā)，男，博士，副研究員，研究方向：基因治療；E-mail：lizhaofa@hqu.edu.cn