一種檢測線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法

魏迪高敬池振奮張癸榮聶凌云

（1.河北北方學院，張家口 075000；2.中國人民解放軍總后勤部衛生部藥品儀器檢驗所，北京 100071；3.中國科學院北京基因組研究所，北京 100101）

一種檢測線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法

魏迪1，2高敬1，2池振奮3張癸榮1，2聶凌云1，2

（1.河北北方學院，張家口 075000；2.中國人民解放軍總后勤部衛生部藥品儀器檢驗所，北京 100071；3.中國科學院北京基因組研究所，北京 100101）

旨在建立一種簡便檢測線粒體DNA（mtDNA）核酸酶靶向剪切活性的方法。利用轉基因技術，將一段含有兩個靶向目標序列（T1、T2）的線粒體DNA序列隨機整合到宿主基因組中，通過實時熒光定量PCR篩選單拷貝或低拷貝的單克隆轉基因細胞株。將含有T1、T2的CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9質粒分別瞬時轉染到所選細胞株中，靶向剪切核基因組，在靶向目標序列處造成DNA雙鏈斷裂，引發非同源末端連接修復機制，引入插入或缺失突變。觀察測序峰圖，證明兩個靶向目標序列T1、T2均有剪切效率，且T1高于T2。建立了一種高效快速檢測線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法。

線粒體核酸酶；轉基因細胞株；靶向修飾；CRISPR/Cas9；實時熒光定量PCR

隨著測序技術的不斷發展，我們獲得越來越多的遺傳信息。研究人員試圖通過對特定靶向基因的破壞或敲除來研究它們的相關功能。與傳統基因打靶技術相比，新型基因組編輯技術應用范圍更廣、作用效率更高、所需成本更低，可用于模式動物構建、基因功能研究、基因治療等方面。

目前，常用的基因組編輯技術主要包括以下3種：鋅指蛋白（Zinc finger proteins，ZFPs）技術、轉錄激活因子樣效應因子（Transcription activator-like effectors，TALEs）技術、CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技術。它們的大致原理都是通過造成靶向DNA雙鏈斷裂（doublestrand breaks，DSBs），引發細胞內固有的非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）［1］或同源重組（Homology-directed repair，HDR）［2］兩種修復機制對DSBs處進行修復，從而實現基因的定點敲除、敲入或缺失。3種技術在具體操作方式上又有所不同。

鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）與轉錄激活子樣效應因子核酸酶（Transcription activatorlike effector nulease，TALEN）這兩種人工核酸內切酶，均由DNA識別域與非特異性核酸內切酶Fok I融合而成。其中，ZFN的鋅指模塊識別三聯體堿基，在序列的識別上靈活性小，設計成本昂貴、技術被少數公司壟斷，這些都限制了它的發展［3］。TALEN在結構上較之ZFN更加優化。其DNA結合域中的各單元可與靶向目標序列一一對應，組裝更為簡單，特異性更高。2013年，一種源自細菌適應性免疫系統的CRISPR/Cas9的出現，為基因靶向修飾領域帶來了巨大變革。主要原理：向導RNA（guide RNA，gRNA）與Cas9核酸酶形成的復合物，在gRNA指導下與靶向目標序列結合，由靶向目標序列下游的原型間隔序列相鄰基序（Protospacer adjacent motifs，PAM）激活Cas9核酸酶［4］，使其對PAM上游3 nt處剪切造成DSBs。該系統較之前兩種，應用范圍更廣、作用效率更高、使用成本更低，經過短短兩年的發展，已被用于世界各地的實驗室［5］。

線粒體是存在于大多數真核生物細胞中的細胞器，有“細胞中的能量工廠”之稱。它主要通過氧化磷酸化以三羧酸循環腺苷（ATP）的形式為細胞活動提供能量。同時，還參與諸如鐵硫簇的生物合成、鈣穩態調節［6］、細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡［7］等過程，并且擁有調控細胞生長和細胞周期的能力。線粒體基因組，又稱線粒體DNA（mtDNA）。長度一般為幾萬至數十萬堿基對，人類mtDNA為16 569 bp，共編碼2個rRNA、13個多肽、22個tRNA。基因排列緊湊，除與mtDNA復制及轉錄有關的一小段區域外，無內含子序列［8］。mtDNA表現為母系遺傳，突變率高，是細胞核內DNA的10倍左右。且mtDNA突變是導致人類線粒體遺傳病及衰老性疾病的重要原因之一。研究表明，它與衰老及神經退行性病變如阿爾茨海默癥、帕金森氏病等老年化疾病有關，同時也與腫瘤的形成密切相關［9］。截至目前，已鑒定出超過500多個致病性突變來自mtDNA。而針對mtDNA致病性突變的精確改造能力則相對缺乏［10］。

隨著Minczuk等［11，12］將ZFN作用于mtDNA，Bacman等［13］首次將TALEN用于清除病人線粒體內的突變型mtDNA。這兩種基于ZFPs技術、TALEs技術的線粒體核酸酶都為更好的進行線粒體功能研究、線粒體遺傳病的治療等提供了可能。此外，本實驗室也基于人工CRISPR/Cas9系統獨特地構建了作用于mtDNA的mtCRISPR/Cas9系統（結果未發表）。

任何一種基因組編輯技術，它的靶向剪切效率、切割特異性等問題不可回避。由于核基因組中的DNA損傷修復系統比較完整，當發生DSBs時，可通過NHEJ修復在靶向目標序列處引入插入或缺失突變。因此，改造核基因組的相關基因組編輯技術可通過錯配酶法、靶向目標序列直接PCR后TA克隆測序或觀察靶向目標序列測序峰圖等方法鑒定。而相應的線粒體基因組編輯工具，由于線粒體缺乏完善的DNA損傷修復系統［14-16］，修復能力較弱，無法通過上述方法檢測。

因此，本研究利用轉基因技術，將一段含有靶向目標序列的mtDNA序列隨機整合到宿主基因組中，獲得轉基因細胞株。通過相應的核基因組編輯技術靶向剪切該細胞株的核基因組，對靶向目標序列處造成DSBs引發NHEJ修復。觀察靶向目標序列測序峰圖，鑒定mtDNA的靶向目標序列剪切活性。建立了一種檢測線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用載體及細胞株 所用載體為哺乳動物細胞表達載體pEGFP-N1，帶EGFP標簽，購自Clontech公司。所用細胞株為人腎上皮細胞HEK293，培養條件：DMEM+10%FBS。

1.1.2 主要藥品及試劑 DL2 000 DNA Marker、dNTP、RNase A、T4 DNA Ligase、LA Taq、SYBR premix Ex Taq等均購自TaKaRa公司。膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pEGFP-mtDNA轉基因單克隆細胞株的獲得

1.2.1.1 pEGFP-mtDNA重組克隆質粒的構建 以pEGFP-N1為載體，將一段同時含有兩個靶向目標序列（T1、T2）的mtDNA序列與EGFP的N端融合，除去EGFP前的起始密碼子ATG，最終得到重組克隆質粒：pEGFP-mtDNA。

具體步驟如下：（1）以HEK293細胞基因組DNA為模板，用CL-F1/CL-R1引物對進行PCR擴增（335 bp），膠回收后得產物J；（2）以產物J為模板，用CL-F2/CL-R2（CL-F2帶有flag標簽，如表1橫線部分所示）引物對進行PCR擴增（167 bp），膠回收后得產物K；（3）以產物K為模板，用CL-F3/CL-R3（CL-F3帶有Nhe I酶切位點和flag標簽、CL-R3帶有Age I酶切位點，如表1相應下劃線、下劃線斜體部分所示）引物對進行PCR擴增（194 bp），得產物L；（4）對純化后的產物L及pEGFP-N1質粒做Nhe I/Age I雙酶切，分別以此為插入片段及載體進行連接、轉化、挑單克隆鑒定、鑒定正確樣品測序；（5）以上一步驟中的正確質粒為模板，用CL-F4/CL-R4引物對（CL-F4帶有Age I酶切位點，如表1橫線斜體部分所示；刪去EGFP起始密碼子ATG，添加一個堿基C調整編碼框，該堿基的選擇應避免引入終止密碼子）進行PCR擴增（902 bp），得產物M；（6）對純化后的產物M及上一步驟所用質粒做Age I/Not I雙酶切，分別以此為插入片段及載體進行連接、轉化、挑單克隆鑒定、鑒定正確樣品測序，即得最終質粒：pEGFP-mtDNA（圖1）。

表1 pEGFP-mtDNA重組克隆質粒構建相關引物

1.2.1.2 陽性單克隆細胞株初篩 將pEGFP-mtDNA瞬時轉染到培養于60 mm細胞培養皿的HEK293細胞中，24 h后，將細胞傳代至10 cm培養皿中繼續培養，加800 μg/mL的G418篩選，每隔3-4 d換液一次。培養至細胞不再大批量死亡，且形成單克隆細胞團后，挑單克隆于24孔板。對含有綠色熒光的單克隆細胞，收取細胞提基因組進行PCR鑒定。根據pEGFP-mtDNA序列，分別設計3對引物P1（P1-F/P1-R）、P2（P2-F/P2-R）、P3（P3-F/P3-R）（表2），3對引物均可擴增出目的條帶的細胞，則為陽性單克隆細胞株。

表2 常規PCR初篩陽性單克隆細胞株相關引物

1.2.2 絕對定量PCR檢測外源基因拷貝數

1.2.2.1 實時熒光定量PCR 反應總體系20 μL（上/下游引物各0.5 μL、ddH2O 9 μL、2×SYBR premix Ex Taq 10 μL）。PCR反應程序：95℃ 3 min；95℃ 15 S、60℃ 30 S（40個循環），熔解曲線60-95℃，每個樣品做3次重復。

1.2.2.2 標準曲線的建立 將pEGFP-mtDNA質粒與HEK293細胞基因組DNA混合，設置分別含有1、2、4、8和16個外源基因拷貝數的標準品對照。具體方法如下：假設含有外源基因片段的質粒大小為a bp，HEK293細胞基因組DNA用量為b ng，大小為3×109bp。外源基因片段完全隨機的頭尾相連的插入在一條染色體上，則b ng的基因組DNA中含有一個外源基因拷貝數的質量為：a×b×0.5/3×109ng。設計特異性擴增外源基因序列的引物對RT-F/RT-R，以β-actin為內參的引物對Actin-F/Actin-R（表3）。將外源基因片段擴增的CtpEGFP-mtDNA值減去內參擴增的CtActin值，得△Ct，再對樣品拷貝數的對數值（以2為底）作圖得絕對定量標準曲線。

表3 絕對定量PCR檢測外源基因拷貝數相關引物

1.2.3 靶向目標序列剪切活性檢測 構建含有相應mtDNA靶向目標序列的CRISPR/Cas9質粒。將該質粒瞬時轉染到所選陽性單克隆細胞株中。48-72 h后，收取細胞提基因組DNA，用1.2.1.2所述P1引物對進行PCR擴增。擴增產物送樣測序，測序引物為P1-R。如果靶向目標序列在核基因組中發生DSBs，則會引發細胞中的NHEJ修復機制，得到插入或缺失突變。而對樣品全基因組DNA進行PCR擴增所得的擴增產物為混合產物，其中既含有野生型的原始靶向目標序列，也含有引入插入或缺失的突變型靶向目標序列。因此，使用Chromas軟件顯示測序峰圖，查看對應靶向剪切位置處是否有套峰出現，如有套峰，則證明靶向目標序列有剪切活性，反之則無。此外，還可根據套峰強弱判斷該系統對靶向目標序列的剪切效率。

2 結果

2.1 獲得陽性單克隆細胞株

2.1.1 構建pEGFP-mtDNA重組克隆質粒 pEGFPN1為真核表達載體，含有EGFP基因和neo抗性基因。將一段含有兩個靶向目標序列（T1、T2）的mtDNA序列，通過1.2.1.1所述方法與EGFP基因融合得到測序正確的重組克隆質粒pEGFP-mtDNA（圖1）。該質粒瞬時轉染到HEK293細胞中，24 h后觀察EGFP表達情況，轉染效率達95%以上（圖2-A）。

2.1.2 初篩陽性單克隆細胞株 將鑒定正確的pEGFP-mtDNA重組克隆質粒瞬時轉染到HEK293細胞中（圖2-A），24 h后細胞傳代，并用G418篩選。當有大批量未轉入質粒的細胞死亡后，及時換液。藥篩至細胞不再大量死亡，且形成單克隆細胞團時，挑單克隆于24孔板中。對含有綠色熒光的11個單克隆細胞，收細胞提基因組。分別用3個引物對P1（P1-F/P1-R）、P2（P2-F/P2-R）、P3（P3-F/P3-R）對單克隆細胞所提基因組進行PCR鑒定，3對引物均可擴增出目的條帶的細胞，則為陽性單克隆細胞株，結果如圖2-B所示，單克隆細胞株2#、3#、5#、8#、10#為陽性單克隆細胞株。

2.2 檢測外源基因拷貝數

2.2.1 建立標準曲線 將pEGFP-mtDNA質粒與HEK293細胞基因組DNA混合，設置分別含有1、2、4、8和16個外源基因拷貝數的標準品對照，用RTF/RT-R引物對擴增外源基因片段，Actin-F/Actin-R引物對擴增內參β-actin，每個反應重復3次，取平均Ct值。其中，特異性引物對RT-F/RT-R的擴增曲線、熔解曲線如圖3-A所示，內參引物對Actin-F/Actin-R的擴增曲線、熔解曲線如圖3-B所示，兩個熔解曲線均在86℃附近有且只有一個單峰，證明兩引物對均為特異性擴增。將RT-F/RT-R擴增的CtpEGFP-mtDNA減去Actin-F/Actin-R擴增的CtActin，得△Ct。△Ct與樣品拷貝數的對數值（log2N）作圖得到標準曲線（圖3-C），Log2N= -1.177 2△Ct+2.779 3，決定系數R2=0.997 1。

2.2.2 檢測陽性單克隆細胞株的外源基因拷貝數 提取陽性單克隆細胞株2#、3#、5#、8#、10#基因組，并以此為模板做實時熒光定量PCR。將這5個細胞株的△Ct分別帶入計算公式：Log2N= -1.177 2△Ct+2.779 3，得其對應的拷貝數（N），標準差在0.935 1和0.138 7之間，結果可信。具體拷貝數檢測結果如表4所示。

2.3 靶向目標序列剪切活性檢測

構建分別含有mtDNA靶向目標序列T1、T2的兩個CRISPR/Cas9質粒，命名為CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2。將CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2和相應不含T1、T2靶向目標序列的CRISPR/Cas9空骨架質粒（Control-T1、Control-T2）分別瞬時轉染到pEGFP-mtDNA陽性單克隆細胞株10#中。48 h后，收取細胞提基因組DNA，用1.2.1.2所述P1引物對進行PCR擴增，擴增產物送樣測序。測序結果表明，陰性對照Control-T1、Control-T2在靶向目標序列處均無套峰出現（圖4-B），而作用質粒CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2在靶向目標序列處均有套峰出現，且CRISPR/Cas9-T1處的套峰強于CRISPR/Cas9-T2處（圖4-A）。

3 討論

基因組編輯技術，是研究相關基因功能的重要手段。作為三大基因組編輯技術之一的CRISPR/Cas9系統，自2012年首次描述其對DNA的基本編輯能力后［17］，經短短幾年發展，已取得豐碩研究成果。它不僅可以編輯DNA用于構建癌癥模型［18］、清除人類感染細胞中的HIV［19］、阻止杜氏營養不良小鼠模型中的肌肉退化［20］等，還可以編輯RNA［21］，為更好的研究RNA功能提供了可能。目前的基因組編輯技術，大多只能改造核基因組，而很多人類遺傳病是由于線粒體基因組突變所引起。mtDNA突變通常是異質性的，只有當mtDNA突變型占總mtDNA數量80%以上時，才會引起疾病癥狀［22］。在此之前，Minczuk和Bacman等［11-13］已分別將ZFN和TALEN兩種人工核酸酶用于清除人類線粒體內的突變型mtDNA，本實驗室也基于人工CRISPR/Cas9系統獨特地構建了作用于mtDNA的mtCRISPR/Cas9系統（結果未發表）。這3種經改造后用于線粒體基因組編輯的線粒體核酸酶，同樣面臨著如何檢測靶向剪切活性的問題。

圖2 陽性單克隆細胞株的篩選

對于核基因組編輯技術而言，由于核基因組中的DNA損傷修復系統比較完整，可在DSBs處通過NHEJ修復引入插入或缺失突變。因此，其檢測方法主要有：（1）對靶向目標序列進行PCR擴增，擴增產物經變性、退火后形成錯配，通過錯配酶剪切不完全匹配的DNA序列，驗證靶向目標序列剪切活性；（2）對靶向目標序列進行PCR擴增后，通過TA克隆測序與理論序列比對驗證靶向目標序列剪切活性；（3）對靶向目標序列進行PCR擴增后，擴增產物直接測序，通過觀察靶位點處的套峰情況驗證靶向目標序列剪切活性。而線粒體對DNA的損傷修復能力較弱，無法通過上述方法檢測。本研究構建了一個核基因組中含有單拷貝或低拷貝mtDNA靶向目標序列的轉基因細胞系，利用相應核基因組編輯技術靶向剪切該細胞株的核基因組，通過上述第3種方法觀察靶向目標序列測序峰圖鑒定剪切活性，該法簡潔明了。

首先，在構建重組克隆質粒時，可以如圖1-A所示，將一段含有一個或若干mtDNA靶向目標序列的串聯序列連入克隆載體質粒中，同時檢測多個靶向目標序列的剪切活性。在外源基因與EGFP基因融合時要注意是否需調整編碼框、是否引入了起始密碼子或終止密碼子等問題。其次，在篩選陽性單克隆細胞株時，通過設計的3對擴增范圍涵蓋啟動子區、編碼區、終止區的特異性引物對的同時鑒定，既保證了篩選結果的準確性，又確保了外源基因能夠完整表達。經過藥物篩選得到的陽性單克隆細胞株，其外源基因往往隨機整合在染色體上。因此，在獲得陽性單克隆細胞株后，通過檢測其外源基因拷貝數，篩選單拷貝或低拷貝的陽性單克隆細胞株，是有效鑒定靶向目標序列剪切活性的關鍵步驟。

目前，檢測外源基因拷貝數的方法主要有Southern blot法和實時熒光定量PCR法。Southern blot法為傳統外源基因拷貝數檢測法，實時熒光定量PCR法為近年來新興技術。通過比較，兩種方法在檢測外源基因拷貝數的準確性上結果十分接近［23，24］。與Southern blot法相比，實時熒光定量PCR法起始模板量小、靈敏性高、簡單高效、成本較低、不需要進行放射性實驗［25，26］，該方法足以滿足本研究的篩選需要。在篩選得到的單拷貝或低拷貝陽性單克隆細胞株中，瞬時轉染定量的人工核酸酶后，可通過測序峰圖鑒定靶向目標序列剪切活性更加清晰，減少背景干擾。

此外，利用實時熒光定量PCR法建立了檢測轉基因細胞株中外源基因拷貝數的實驗體系。由于使用的SYBR Green I染料可廣泛嵌合在DNA雙鏈中，因此，引物的特異性尤為重要。設計引物時，盡量避免引物二聚體、引物發卡結構等對結果的干擾，并通過熔解曲線鑒定擴增產物是否特異。如圖3-A、 3-B所示，本研究設計的內參引物對與外源基因檢測引物對的擴增曲線、熔解曲線均在86℃附近有且只有一個單峰，兩引物對均為特異性擴增。且兩引物對的目的片段大小相近（分別為130 bp和127 bp），Tm值基本相等，擴增效率基本相同。由于實時熒光定量PCR所需起始模板量小、檢測靈敏，在實驗設計中每個樣品均做3個重復，每個實驗重復3次。以上措施更加保證了檢測結果的真實可信。

圖3 絕對定量PCR檢測外源基因拷貝數

表4 陽性單克隆細胞株的外源基因拷貝數檢測

圖4 T1、T2靶向目標序列剪切活性檢測

當然，驗證mtDNA靶向目標序列剪切活性的方法并不單一。如Bacman等［13］在酵母菌中利用單鏈復性（Single-strand annealing，SSA）［27］，檢測14459A-mitoTALEN的靶向剪切特異性。如發生特異性剪切，則促進同源重組恢復Lac-Z基因功能，得到藍色菌落，反之為白色菌落。與本研究所構建的含有靶向目標序列的轉基因細胞系相比，雖檢測時間較短，但研究者可在構建重組克隆質粒時，將多個靶向目標序列或潛在發生非特異性剪切的序列串聯整合到核基因組中，靈活多變。一個細胞株不僅可以檢測多個靶向目標序列的剪切活性、比較不同靶向目標序列的剪切效率（圖4-A，T1、T2均具有靶向剪切活性，且T1剪切效率大于T2），還可以分析單堿基或多堿基不匹配下的潛在脫靶效應等問題，為更好的選擇靶向目標序列、設計線粒體核酸酶提供了重要的參考依據和實驗基礎，一舉多得。

4 結論

本研究利用轉基因技術，將一段同時含有兩個靶向目標序列（T1、T2）的mtDNA序列整合到宿主基因組中。通過3對擴增不同位置的外源基因特異性引物對，篩選得到陽性單克隆細胞株后，利用實時熒光定量PCR法檢測陽性單克隆細胞株中的外源基因拷貝數，挑選其中單拷貝或低拷貝的陽性單克隆細胞株。將含有相應靶向目標序列（T1、T2）的CRISPR/Cas9質粒瞬時轉染到所選細胞株中，驗證T1、T2的靶向剪切活性的同時證明了該方法的可行性。建立了一種高效檢測線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法。

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（責任編輯 狄艷紅）

A Novel Method for Detecting Activity of Mitochondria-targeted Nuclease

Wei Di1，2Gao Jing1，2Chi Zhenfen3Zhang Guirong1，2Nie Lingyun1，2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou 075000；2. Institute for Drug and Instrument Control，Health Department，the General Logistics Department of People’s Liberation Army，Beijing 100071；3. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

Mitochondrial DNA（mtDNA）mutation has been associated with human mitochondrial disease. The precise correction of mutated mtDNA is considered an important strategy of mitochondrial therapy. Due to the lack of the complete repair system of DNA damage，a convenient method for detecting activity of mitochondria-targeted nuclease needs to be innovated urgently. Using transgenic technology， a mitochondrial DNA containing two target sequences（T1 and T2）was integrated into host genome randomly. Single or low copy monoclonal transgenic cell lines were selected by real-time fluorescence quantitative PCR. The two CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9 plasmids， which contained T1 and T2 target sequences， were transiently transfected into selected copy monoclonal transgenic cell lines. Target DNA double-strand breaks were caused by CRISPR/Cas9， followed by DNA insertion and deletion mutation via non-homologous end joining repair pathway. The cutting activities of two target sequences were proved by DNA sequencing peaks diagram， it was proved that two target sequences of T1 and T2 had the cutting activity， furthermore， T1 was better than T2. A novel method for rapidly and efficiently detecting activity of mitochondria-targeted nuclease is established.

mitochondria-targeted nuclease；transgenic cell line；targeted modification；CRISPR/Cas9；real-time fluorescence quantitative PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.012

2015-03-18

國家自然科學基金面上項目（31371346）

魏迪，女，碩士研究生，研究方向：遺傳學研究新技術與新方法；E-mail：18311012326@163.com

聶凌云，女，博士，研究方向：遺傳學研究新技術與新方法；E-mail：nielingyun@126.com