農桿菌介導大豆子葉節影響因素的研究

楊曉倩 李桂蘭 劉晨光 董秋平 張鍇 喬亞科

（河北科技師范學院 生命科技學院，昌黎 066600）

農桿菌介導大豆子葉節影響因素的研究

楊曉倩 李桂蘭 劉晨光 董秋平 張鍇 喬亞科

（河北科技師范學院 生命科技學院，昌黎 066600）

為提高大豆遺傳轉化效率，采用農桿菌介導遺傳轉化的方法，以大豆子葉節為外植體，研究共培養階段浸染液濃度及外界培養條件（共培養溫度和天數）和培養基添加物對轉化效率和芽誘導率的影響。結果顯示，浸染液OD600=0.5的誘導率最高，共培養溫度為24℃，共培養天數為10 d具有較高轉化效率，共培養基中加入一定濃度的單壁碳納米管（Single-wall carbon nanotube，NM）對誘導卡那霉素抗性不定芽有促進作用。PCR檢測表明PHR1基因已整合到T1代大豆基因組中，初步證明可在大豆基因組中穩定遺傳。

農桿菌介導；大豆子葉節；共培養；單壁碳納米管

大豆富含蛋白質和油脂，是我國極重要的糧食作物和經濟作物［1］。通過基因工程改良大豆育種是現在的研究熱點。第一例轉基因植物就是采用的就是農桿菌介導法，通過這一方法已獲得的轉基因植物占轉基因植物總數4/5，已成為植物基因轉化首選方法［2］。雖然農桿菌介導的大豆遺傳轉化技術日趨成熟，但有很多瓶頸問題急需優化改良，轉化效率低，重復性差，轉化周期很長等，目前提高轉化效率和相對穩定性依然是現在轉基因研究的重點［3-5］。轉基因技術改變人們生活的同時，轉基因植物生物安全性受到社會各界關注，其中最主要的問題是選擇標記，目前切除選擇性標記的方法包括共轉化系統、同源重組、轉座子系統和位點特異性重組系統等［6-8］。Cre/loxp 標記去除（位點特異性重組系統）具有較高的可控性，是目前轉基因研究中應用廣泛較理想的標記去除方法。

本研究以4個栽培品種豫豆22、冀豆16、中黃13、吉林35為轉化受體材料，探究共培養天數、共培養溫度、單壁碳納米管（NM）對誘導率和轉化效率的影響，以期為根癌農桿菌介導的大豆子葉節轉化體系的優化提供參考，獲得的AtPHR1轉化植株，以期為耐低磷大豆培育提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 大豆品種 豫豆22、冀豆16、中黃13、吉林35。

1.1.2 菌株和質粒 根癌農桿菌菌株為LBA4404，質粒為PX6-PHR1（圖1），含AtPHR1基因（南開大學李明剛教授提供）。

圖1 質粒的T-DNA區

1.1.3 主要培養基，見表1。

表1 農桿菌介導轉化過程中的主要培養基

1.2 方法

1.2.1 轉化體系優化

1.2.1.1 菌液制備 從4℃保存的平板上挑取單菌落接種到LB液體培養基中，28℃培養OD600=0.6-0.8時取1 mL菌液轉入新鮮LB培養基中二次活化，培養至OD600=0.6-0.8，5 000 r/min，離心10 min，去上清液，菌體重懸于共培養液體中調整OD600=0.3-0.5。

1.2.1.2 共培養 將無菌苗制備的子葉節放入上述制備好的菌體懸浮液中，侵染30-60 min后近軸面朝下接種到共培養基上培養。本研究在共培養階段設置了以豫豆22無菌苗的子葉節為轉化外植體的3個單因素試驗。（1）共培養溫度試驗：培養溫度分別設置為19、22、24和25℃；（2）共培養天數：設置了共培養時間分別為7、10和13 d的單因素試驗，每個處理接種200個外植體；（3）單壁碳納米管分散液（NM）對外植體芽誘導率的影響：選取3個大豆品種（豫豆22、中黃13、吉林35）的子葉節為外植體放入含0和40 mg/L NM的不含km、carb、cef的芽誘導培養基中，選出芽誘導率最高的品種；（4）含40 mg/L NM浸染液對誘導率的影響：以豫豆22子葉節為試驗材料，OD600=0.5的菌液離心后重懸于含40 mg/L NM的共培養液體培養基中作為浸染液，以無任何添加物的浸染液做對照，比較兩種浸染液對芽誘導率的影響；（5）含不同濃度NM對外植體芽誘導率的影響：以豫豆22子葉節為試驗材料，在共培養固體培養基中加入單壁碳納米管，設置4各處理，濃度分別為0、20、40和60 mg/L，每個處理接種150個外植體；（6）以豫豆22子葉節為試驗材料，在共培養液體培養基中加入40 mg/L NM，同時在固體培養基中加入20 mg/L NM，以無添加的培養基為對照，統計兩種試驗條件下芽誘導率和轉化效率的差異。

1.2.1.3 植株再生 共培養后的子葉節用無菌水沖洗后接種于芽誘導培養基，每15 d繼代一次。經過兩次繼代后將長出的抗性芽轉入芽伸長培養基中，待抗性芽生長至2-4 cm后轉入生根培養基中，根系健壯，煉苗3-5 d后移栽到草炭土∶蛭石=3∶1的營養土中。

1.2.2 轉PHR1基因植株的檢測 選用SDS法提取卡那霉素抗性植株葉片的基因組DNA，進行目的基因的擴增和瓊脂糖凝膠電泳的檢測。擴增設計的引物為：P1：5'-CCATCTCCACTGACGTAAGGGAT-3'；P2：5'-CTCGTCAATTCCAAGGGCATCGGT-3'。P3：5'-CTGGACACAGTGCCCGTGTCGGA-3'；P4：5'-ACAGCCTCAACAAAAGCCTCGTG-3'。PHR1：5'-CCTCACACGCACTTCTTCAA-3'；PHR2：5'-GCTCTTTCACTACCGCCAAG-3'其中P1/P2為載體擴增引物，P1在G10-90處，P2在第一個Loxp site下游，片段長度是653 bp；P3設計在Cre上游，P4在第二個Loxp site下游的基因內部，P3/P4片段長度為1.3 kb。PHR1/PHR2為ATPHR1基因內部特異性引物，擴增片段長度為710 bp。

1.2.3 數據統計

芽誘導率（%）=出芽外植體數/總外植體數×100%。

陽性率（%）=PCR陽性株數/總外植體數×100%。

2 結果

2.1 轉AtPHR1植株的獲得

采用農桿菌介導子葉節的遺傳轉化方法，將AtPHR1基因分別轉入豫豆22、冀豆16和中黃35中，設計P1/P2、P3/P4和PHR1/PHR2引物（1.2.2方法）PCR檢測轉基因植株。P1/P2擴增結果（圖2）如預期大小，目的片段長度約為650 bp，P3/P4擴增（圖3）片段長度為1.3 kb，符合預期大小。PHR1/ PHR2擴增結果（圖4）符合預期大小，片段長度約為710 bp。

圖2 部分轉基因植株以P1/P2引物的PCR擴增結果

2.2 不同浸染液濃度對轉化效率的影響

本實驗以豫豆22為材料，設計浸染菌液濃度分別為OD600=0.2、0.3、0.4、0.5、0.6，將子葉節外植體分別浸染在不同的菌液濃度中，研究不同浸染菌液濃度對轉化效率的影響。結果（表2）顯示，隨菌液和侵染液濃度的增加，轉化陽性率的變化較大，當浸染液OD600=0.5時，轉化效率達到最高，達10.4%。故本研究其他后續實驗均采用菌液濃度OD600=0.5，侵染液濃度OD600=0.5 的組合進行處理。

圖3 部分T1轉基因植株以P3/P4引物的PCR擴增結果

圖4 部分T1轉基因植株以PHR1/PHR2引物的PCR擴增結果

表2 不同菌液濃度和侵染液濃度對陽性率的影響

2.3 遺傳轉化共培養階段影響因素

2.3.1 適宜的共培養時間 不同共培養時間培養后的陽性轉化率，以共培養10 d的轉化率是最高的，達8.06%，共培養7 d和13 d的轉化效率則分別是3.01%和3.39%（圖5），表明適宜的共培養時間為10 d。

2.3.2 適宜的共培養溫度 當共培養溫度為19℃和22℃時的轉化效率偏低，僅為1.45%和1.73%，而共培養溫度為24℃時培養的外植體有最高轉化效率，為4.12%，當溫度繼續升高至26℃時轉化效率又有降低趨勢（圖6），結果表明共培養24℃時更有利于提高轉化效率。

圖5 共培養天數對陽性率的影響

圖6 不同共培養溫度對轉化效率的影響

2.4 NM對芽誘導率的影響

2.4.1 單壁碳納米管分散液對不同品種的出芽率的影響 以中黃13、吉林35、豫豆22為實驗材料，在芽誘導培養基中加入40 mg/L的NM，結果見表1，吉林35子葉節外植體的40 mg/L NM處理的芽誘導率比對照低24.9%，而其他兩個品種的芽誘導率都高于對照，其中豫豆22芽誘導率比對照高124.5%，效果最明顯，試驗表明在豫豆22中添加40 mg/L的NM明顯促進子葉節分化，后續NM探究實驗均使用豫豆22為實驗材料。

2.4.2 浸染液添加 NM對芽誘導率的影響 以豫豆22子葉節為實驗材料，OD600=0.5的菌液離心后重懸于含40 mg/L NM的共培養液體培養基中作為浸染液，以無任何添加物的浸染液做對照，統計兩種浸染液對芽誘導率的影響。結果（表4）顯示，加入40 mg/L NM的浸染液芽誘導率為18.8%，對照為4.4%，相比對照的芽誘導率高337.3%，實驗表明共培養液體培養基添加40 mg/L NM對芽誘導率有促進作用。

表3 40 mg/L的NM對不同品種出芽率的影響

2.4.3 共培養固體培養基添加 NM對芽誘導率的影響 在共培養階段加入不同濃度的NM對卡那霉素抗性不定芽的誘導（圖5），加入20 mg/L NM后芽誘導率（14.18%）比對照高81.8%，NM濃度升高至40 mg/L后，芽誘導率降到6.19%低于對照，NM加至60 mg/L后，芽誘導率為9.20%與對照相近，。說明加入20 mg/L NM后的共培養基有利于抗性不定芽的誘導分化。

2.4.4 共培養基與浸染液中分別添加適宜濃度NM對轉化效率的影響 以豫豆22子葉節為試驗材料，在共培養液體培養基中加入40 mg/L NM，同時在固體培養基中加入20 mg/L NM，以無添加的培養基為對照，統計兩種實驗條件下芽誘導率和轉化效率的差異。結果（表4）顯示，加入適宜濃度的NM處理后的芽誘導率與對照相差不多，但陽性率比對照低，說明在固體和液體培養基中都加NM對遺傳轉化無促進作用。

表4 共培養基中加入NM對芽誘導率的影響

3 討論

本研究在參考前人對農桿菌介導大豆子葉節轉化的優化改良經驗基礎上，進一步探究了重要影響因素浸染液濃度、共培養天數、共培養溫度和單壁碳納米管液對芽誘導率的影響。

農桿菌侵染效率是影響植物轉化效率的重要因素，主要與菌株種類、菌液濃度、侵染液濃度和侵染時間有關［9］。其中，農桿菌菌液濃度代表著菌液生長時期，而處于對數生長期的菌液被認為是侵染能力最強、侵染效率最高的狀態。侵染液濃度代表著一定體積內菌體的含量，濃度過低則沒有足夠的外源DNA進入外植體，侵染效果差，而侵染液濃度過高，則會使多余的菌體附著在外植體傷口周圍，導致后期農桿菌生長旺盛、難以抑制，對植物細胞造成毒害。本研究結果發現，以菌液和浸染液的OD600=0.5的抗性芽誘導率最高，處理效果最佳，武小霞等［10］研究顯示浸染液的OD600=0.5的芽誘導率最高，與本研究結果一致。

圖7 不同NM濃度對抗性芽誘導率的影響

共培養階段是建立高效轉化體系的重要參數，在此階段是子葉節和農桿菌共生時期，所涉及到的因素都是影響轉化效率的關鍵。合適的共培養溫度能使農桿菌和外植體均處于遺傳轉化的最佳狀態，共培養溫度過低或過高都直接影響了外植體的轉化效果，關于這方面的研究仍然不斷進行，但結果不盡相同［11］。本研究顯示共培養溫度為24℃，轉化效率最好，是農桿菌與外植體均處于適宜的轉化狀態的溫度，使二者都能達到較理想的轉化狀態。共培養天數同樣是共培養階段極重要的轉化效率影響因子，理論上講隨共培養時間增長，農桿菌繁殖越多，轉化就越容易完成，但是農桿菌的過量繁殖反而會對子葉節造成毒害，降低轉化效率［12］。目前普遍認為以大豆子葉節遺傳轉化的最佳共培養天數為3-5 d［12-14］，本研究就共培養時間對轉化率的影響進行探究，結果顯示共培養10 d的陽性率更高，7 d和13 d的轉化效果不及10 d，可能是由于共培養時間較短時，影響了T-DNA轉移到植物細胞的幾率，而共培養時間過長時農桿菌的過量繁殖對子葉節外植體造成影響，子葉節受到毒害，使轉化效率降低，而且共培養后期農桿菌抑制困難，本研究中取得最優轉化效率的共培養天數為10 d。

納米材料尺寸為1-100 nm，在電子機械、農業化工、生物醫藥等方面都應用廣泛，人工納米材料伴隨科技發展引起人們高度關注［15］。目前納米材料對植物生長發育或促進或抑制或無影響的作用都有報道［16］，但都尚在起步階段。關于人工納米材料可以促進大豆萌發［17］，提高光合反應效率［18］，增加某些脅迫相關基因的表達［19］，制成納米增效肥料等時有報道，綜合發現納米材料對植物生長的影響與納米材料的種類、濃度、形態以及植物的類型有關。納米材料最主要的特點是尺寸小，處于單個原子或分子與宏觀粒子交界的過渡區域，納米材料有小尺寸效應，粒子無周邊邊界，使其產生的磁場與植物本身的磁場具有宏觀量子隧道的主動靶向性，將會攜帶大量的養分離子進入植物體內，因此相應地提高了植物吸收養分和水分的能力。本研究將單壁碳納米管分散液加入共培養基中，探究其對大豆子葉節不定芽誘導率的影響。結果表明不同品種的子葉節外植體在中添加40 mg/L NM［20］誘導培養基誘導分化的效果不同，本研究中豫豆22和中黃13的誘導率比對照高，吉林35低于對照；在浸染液中添加40 mg/L NM和固體培養基中加入的20 mg/L NM可提高芽誘導率，可能原因是NM的小尺寸效應。

本研究應用的載體具有Cre/loxp系統，可刪除除卡那抗性標記。PHR1基因是耐低磷相關的正向調控轉錄因子基因，是高等植物中的磷信號調控體系核心轉錄因子，參與植物磷素運輸和再利用［21，22］P1/P2、P3/P4和PHR1/PHR2引物擴增結果說明啟動子G10-90、Cre/loxp系統及AtPHR1基因完整的整合進大豆基因組中，為進一步獲得刪除卡那抗性標記的轉PHR1基因大豆奠定材料基礎。

4 結論

本研究探討的農桿菌介導子葉節影響因素結果顯示菌液和浸染液OD600=0.5，共培養溫度為24℃，共培養10 d的轉化效率最高，誘導培養基和共培養基中加入NM可提高芽誘導率。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Factors Affecting Genetic Transformation of Soybean Cotyledon Node Mediated by Agrobacterium tumefacions

Yang Xiaoqian Li Guilan Liu Chenguang Dong Qiuping Zhang Kai Qiao Yake
（Life Science and Technology Institute，Hebei Normal University of Technology，Changli 066600）

It was to improve the efficiency of soybean genetic transformation， we used the soybean cotyledon node as explants via Agrobactium-mediated transformation method， and investigated the effect of bacterial concentration， co-culture temperature and time on the transformation efficiency and the rate of bud induction. The results showed that under the OD600= 0.5 of infection solution concentration， and induction rate was the highest. The conversion efficiency was higher under the environment of co-culture temperature being 24℃ for 10 days. The single-wall carbon nanotubes added to culture medium improved the induction of the adventitious bud with kanamycin-resistance. Moreover， the PCR results indicated that PHR1 gene was integrated into T1 genome generation， preliminarily proving that the heredity of gene in the soybean genome was stable.

Agrobactium-mediated；soybean cotyledon node；co-culture；single-wall carbon nanotube

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.013

2015-03-28

轉基因重大專項（2014ZX0800404B）

楊曉倩，女，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：18330381190@163.com

喬亞科，男，碩士，教授，研究方向：大豆遺傳資源；E-mail：qiaoyake@126.com