飼喂Bt水稻的褐家鼠腸道中cry1Ab/Ac基因和蛋白的殘留檢測

徐燈耿麗麗李寧劉曉輝盧凡張杰

（1.湖北工業大學資源與環境學院，武漢 450068；2.中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

飼喂Bt水稻的褐家鼠腸道中cry1Ab/Ac基因和蛋白的殘留檢測

徐燈1，2耿麗麗2李寧2劉曉輝2盧凡1張杰2

（1.湖北工業大學資源與環境學院，武漢 450068；2.中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

分別用含有轉cry1Ab/Ac基因水稻和親本水稻的飼料飼喂野生褐家鼠，旨在檢測外源cry1Ab/Ac基因和蛋白在褐家鼠雌鼠雄鼠空腸、回腸、盲腸中的殘留情況。檢測結果顯示，飼喂轉基因水稻50 d和110 d的雌雄褐家鼠腸道3個部位中沒有檢測到cry1Ab/Ac基因殘留，在體外消化實驗中過量外源基因全長及片段在4 h后開始逐步降解，約12 h全部降解。3個腸道部位提取的蛋白進行ELISA和Western blot分析，結果顯示腸道內容物中無Cry1Ab/Ac蛋白殘留。因此外源基因和蛋白不會在飼喂了轉基因水稻的野生褐家鼠腸道中殘留。

轉基因水稻；褐家鼠；基因、蛋白殘留；體外消化

全球轉基因作物的商業化和大規模種植在一定程度上緩解了糧食緊缺問題，給農業生產帶了巨大效益［1］，轉基因作物實際運用過程中還需兼顧其安全性，以保證轉基因作物不會對生態環境及其他動植物產生非預期效應。水稻是我國重要的糧食作物，然而蟲害的發生嚴重制約我國水稻經濟發展，其中水稻螟蟲危害占總蟲害發生面積一半以上，是危害水稻并導致水稻減產的重要原因［2］。轉cry1Ab/Ac基因水稻（TT51）是我國華中農業大學培育的具有自主知識產權的轉基因水稻品種，該水稻對二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等害蟲具有較強抗性［3］，于2009年獲得農業部頒發的轉基因生物生產應用安全證書［4］，并在2014年續期成功，更加有助于對其進一步商業化種植及推廣。

轉基因作物作為飼料對動物的影響是轉基因作物安全性評價的重要內容。轉基因作物經動物取食后，在動物腸道中的消化降解、殘留情況可能會間接影響到動物體的發育，外源基因及蛋白也可能存在向重要器官和血液中轉移的風險；如果動物體中存在外源基因和蛋白殘留，食物鏈下一營養級也會暴露于低劑量Bt蛋白。為評價轉基因水稻對嚙齒類動物的影響，本研究以褐家鼠作為野生嚙齒類動物的典型代表進行研究，褐家鼠個體大、數量多、分布廣、繁殖力強，其取食活動容易造成糧食污染嚴重威脅到農業生產、食品工業及人類健康安全［5］。鼠類作為目前世界上種類和數量最多的哺乳動物是生態環境中食物鏈的中間環節，能為次級消費者提供食物來源，在生態系統的物質循環和能量流動中發揮著重要作用，一定條件下其取食活動也能夠為種子的傳播和萌發提供條件［6］，而且鼠類本身代謝循環快，因此在生態系統養分循環中起到重要作用，對于維持生態系統的結構和功能的穩定性具有重要意義［7］。目前以實驗用鼠作為轉基因生物安全評價方面的研究主要從急慢性毒理、免疫、生殖系統方面進行評價，大部分研究結果顯示，轉基因作物并不會對動物體器官組織、生理指標、生長發育產生影響［8］，雖然有實驗顯示大鼠在血生化、血常規指標中出現了一些差異，但所有指標均在該年齡段該品系大鼠的正常范圍之內［9，10］。無論是轉基因作物中外源Bt蛋白［11］或是異源表達的Bt蛋白［12］都不會對鼠產生致敏性。迄今國內外尚無轉cry1Ab/Ac基因水稻中外源基因及蛋白在野生褐家鼠體內殘留研究的報道。褐家鼠其生存狀況與常規實驗用鼠相比更復雜，取食及消化規律也有所不同。為進一步豐富轉基因水稻TT51飼用安全性評價，本研究以飼喂轉Bt基因水稻50 d和110 d的褐家鼠為材料，采用小片段全覆蓋PCR檢測的策略，分析野生褐家鼠腸道內容物中cry1Ab/Ac基因的殘留情況，同時采用ELISA和Western blot兩種方法檢測蛋白殘留。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 供試水稻品種為華恢1號轉cry1Ab/Ac基因水稻，親本明恢63為對照組，由華中農業大學提供。

1.1.2 試劑 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit購自QIGEN公司，QualiPlate試劑盒購自Envirologix公司；PVDF膜購自Promega公司；鼠源一抗由本實驗室制備，二抗鼠抗羊lgG HRP購自北京天德悅生物科技公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg）購自Sigma公司；PCR純化試劑盒，購自Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 褐家鼠飼喂 野生褐家鼠分成4組，其中2組為雄鼠，每組12只；雌鼠2組，每組14只。分別有1組雄鼠和1組雌鼠飼喂轉基因水稻，另外1組雄鼠和1組雌鼠飼喂親本水稻。分組方式采用同一窩后代同性兩只鼠分成兩組的方式，分別飼喂轉基因水稻和親本水稻。在50 d和110 d分別從每個處理中取出褐家鼠，解剖褐家鼠，分別取胃、空腸、回腸、盲腸部位置于離心管中液氮冷凍保存。

1.2.2 褐家鼠腸道中外源基因殘留檢測 用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒提取褐家鼠腸道內容物DNA，按照說明書中的方法提取，方法稍作改動，200 mg腸道內容物加入1 mL Inhibit Ex Buffer混勻，去除雜質和PCR干擾物，加入蛋白酶K去除體系中的蛋白，用無水乙醇沉淀DNA，過QIAamp spin柱洗脫后加入200 μL 超純水。DNA提取后采用DNA定量儀（Thermo公司）測定DNA樣品的濃度，并以OD260/280nm檢測DNA的純度。DNA樣品用超純水稀釋至40-50 ng/μL，-20℃儲存備用。

分別以cry1Ab/Ac基因以及水稻內源蔗糖磷酸合酶基因SPS（sucrose phosphate synthase gene，U33175）［13］和 淀粉分 支 酶 基 因RBE4（starch branching enzyme gene，EF055878）［14］、褐家鼠內源基因為GAPDH為對照設計引物25對，其中包括cry1Ab/Ac基因全長引物1對和100 bp小片段引物9對、擴增SPS基因100 bp小片段引物11對、擴增RBE4基因全長引物1對和100 bp小片段引物2對、擴增GAPDH基因引物1對，除鼠內源基因（表1）以外其他引物序列及擴增長度參照文獻［15］，所有引物由生工生物工程公司合成。

表1 引物序列及擴增產物

擴增cry1Ab/Ac基因PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 45 s，30個循環；72℃ 10 min。擴增SPS基因PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 20 s，30個循環；72℃ 10 min。擴增RBE4基因PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃ 10 min。擴增GAPDH基因PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 20 s，30個循環；72℃ 10 min。PCR產物4℃保存，PCR反應體系為模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，Taq Mix 10 μL，超純水補至20 μL，設置水空白對照、陽性對照、待測樣品，每個樣品做3個重復，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 體外消化cry1Ab/Ac基因模擬實驗 體外消化模擬實驗采用添加腸道內容物和模擬胃液環境兩種方法。

1.2.3.1 添加內容物方法 cry1Ab/Ac基因50 ng和水稻基因組10 μg加褐家鼠腸道內容物5 mg以及對照組cry1Ab/Ac基因50 ng和水稻基因組10 μg分別在37℃溫浴0、4、8和12 h，溫浴后的產物用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取其中的DNA，DNA產物用根據cry1Ab/Ac基因所設計的10對引物檢測cry1Ab/Ac基因片段。

1.2.3.2 模擬胃液方法 同時將腸道內容物替換成模擬胃液0.5 μL［16］（0.2 g NaCl，87.7 mg胃蛋白酶，鹽酸調pH1.2，加水至100 mL），分別在37℃溫浴0、4、8和12 h，混合反應后的產物用PCR純化劑盒（Axygen公司）純化，PCR反應條件同1.2.2，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 褐家鼠腸道中的外源蛋白殘留檢測 ELISA方法檢測褐家鼠腸道內容物中的外源蛋白，檢測前用BCA方法定量總蛋白，試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。Cry1Ab/Ac蛋白殘留檢測采用ELISA雙抗夾心法，檢測結果重復3次，QualiPlate試劑盒購自美國Envirologix公司，方法按照試劑盒說明書進行，其中放置溫度均改為37℃，檢測結果用Western blot驗證。Western blot方法如下：待測樣經過SDS-PAGE分離后轉印至PVDF 膜上，將膜用TBS-T 溶液漂洗后用20 mL 5%脫脂奶粉封閉2 h，加入含一抗（0.5 μL）的TBS-T漂洗液15 mL，4℃孵育過夜或室溫1 h，加入含鼠抗兔IgG二抗（1 μL）的TBS-T漂洗液15 mL，室溫1 h，每步結束后漂洗膜3次，每次10 min，最后膜用顯色液顯色后拍照。

2 結果

2.1 褐家鼠腸道中外源基因殘留檢測

提取飼喂轉基因水稻及非轉基因水稻雌雄褐家鼠腸道內容物總DNA，DNA定量儀檢測DNA的純度（OD260/280nm）均在1.7-1.9，將總DNA樣品用超純水稀釋至40-50 ng/μL，每個樣品取1.0 μL用于檢測。PCR檢測的目標基因包括cry1Ab/Ac基因全長及100 bp小片段、水稻內源基因SPS及REB4和褐家鼠內源GAPDH基因，共25對引物，瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1-A和1-B）顯示，僅能擴增出10個片段的相應正對照，在腸道內容物總DNA中，均未檢測到cry1Ab/Ac基因全長和100 bp個小片段，其他擴增小片段的8對引物也未獲得目的條帶（電泳圖未提供）。同樣，在空腸、回腸、盲腸內容物提取的總DNA中，也檢測不到水稻內源基因SPS及REB4（圖1-C、1-D和1-E）；但所有的內容物總DNA中都可以檢測到褐家鼠內源GAPDH基因（圖1-F）。

2.2 體外消化cry1Ab/Ac基因模擬實驗結果

通過將過量cry1Ab/Ac基因與褐家鼠腸道內容物孵育，分析外源基因體外降解規律。不加腸道內容物對照處理中在12 h仍能擴增出全長cry1Ab/Ac基因；然而，cry1Ab/Ac基因在加入了腸道內容物后，4 h開始逐漸降解，12 h后檢測不到全長cry1Ab/Ac基因（圖2-A）；但是在4 h和8 h時還能檢測出cry1Ab/Ac基因9個100 bp小片段，而到達12 h時，9個小片段都無法檢測到（圖2-B）。模擬胃液中，37℃ 4 h，cry1Ab/Ac基因已經完全降解，同樣，cry1Ab/Ac基因9個100 bp小片段在4 h時完全降解（圖3）。

圖1 褐家鼠腸道內容物提取的總DNA中cry1Ab/Ac基因的PCR檢測結果

圖2 添加內容物體外消化cry1Ab/Ac基因全長（A）及片段（B）

圖3 胃液體外消化cry1Ab/Ac基因全長（A）及片段（B）

2.3 褐家鼠腸道中Cry1Ab/Ac蛋白殘留檢測

先用BCA法對提取的蛋白進行定量，取20 μg可溶性總蛋白進行ELISA檢測。用雙抗夾心法對樣品進行檢測，檢測結果（表2）顯示，50 d和110 d轉基因和非轉基因組中盲腸和直腸樣品50TW-M、 50TK-M、50TH-M、50TM-M、50TW-F、50TK-F、50TH-F、50TM-F、110CH-F、110CM-F、110TWM、110TH-M、110TM-M、110TW-F、110TH-F、110TM-F出現比較明顯的顯色反應，檢測值表明其中可能存在Cry1Ab/Ac蛋白殘留。

對ELISA檢測結果中產生顏色反應的樣品進行SDS-PAGE和Western blot分 析，SDS-PAGE結果（圖4-A和圖5-A）顯示，在60 kD處50TM-M、110TM-F樣品存在疑似條帶，但Western blot分析結果表明這兩個樣品中并不存在Cry1Ab/Ac蛋白。

3 討論

轉基因作物中表達的外源蛋白在動物腸道中的殘留是轉基因作物安全性評價的重要環節，Bt蛋白不會破壞嚙齒類動物的腸道是因為哺乳動物腸道中沒有Bt蛋白的結合位點，但如果腸道中還存在蛋白殘留可能會對宿主產生致敏性［17］，外源基因殘留也可能存在向動物體其他部位轉移的風險，需要對轉Bt基因水稻中外源成分的降解情況進行評估。

表2 ELISA檢測鼠腸道中Cry1Ab/Ac蛋白殘留結果

圖4 50 d轉基因和非轉基因飼喂褐家鼠腸道內容物總蛋白的SDS-PAGE分析（A）及Western blot分析（B）

本研究采用多對引物同時對cry1Ab/Ac基因全長及基因碎片進行檢測，盡可能確保能完整覆蓋到全長外源基因片段，在褐家鼠腸道內容物中未檢測到cry1Ab/Ac基因的殘留，也有研究表明在飼喂轉基因大豆的嚙齒類動物的兔體內組織中檢測不到外源基因［18］。為了進一步驗證動物實驗中外源基因在褐家鼠腸道中的降解情況，本研究進行了體外模擬實驗，將過量cry1Ab/Ac基因與褐家鼠腸道內容物混合孵育，結果表明全長cry1Ab/Ac基因從4 h開始逐步降解，12 h時PCR擴增為陰性，而全長cry1Ab/Ac基因片段與肉雞腸道內容物孵育時4 h后就檢測不到基因片段［15］。用9對擴增100 bp小片段引物檢測時發現，與全長基因有相同的降解規律，12 h完全降解。胃液中外源基因則在更短的時間內消化降解。

圖5 110 d轉基因和非轉基因飼喂褐家鼠腸道內容物總蛋白的SDS-PAGE分析（A）及Western blot分析（B）

在ELISA檢測結果中一些非轉基因樣品也出現了明顯顏色反應，原因是褐家鼠腸道內容物中一些外源或內源的污染物可能會引起顯色反應，對實驗結果產生明顯影響，Chowdhury［19］和Einspanier［20］的研究結果也出現這樣的現象。進一步Western blot檢測發現這些樣品中并沒有Bt蛋白殘留，與Lutz等［21］的研究結果一致。很多研究表明Bt蛋白容易在鼠腸道中消化從而不會對腸道組織產生影響［22］，更不會引起動物體過敏反應［12］，在動物體吸收食物營養成分過程中，動物的血液［23］、內臟組織［24，25］、肌肉組織［26］中也未檢測到外源蛋白的殘留。

上述研究充分說明轉基因水稻中的外源基因和蛋白在褐家鼠腸道內容物中無殘留，當然還可以從免疫毒理學、生長發育、繁殖性能等方面研究對轉Bt基因對嚙齒類動物的影響以全面評價轉基因作物的安全性。

4 結論

本研究以野生褐家鼠為模型，分析了飼喂轉Bt水稻后雌雄褐家鼠腸道中的外源基因和蛋白的殘留情況。DNA和蛋白水平的分析表明，褐家鼠腸道內容物中沒有cry1Ab/Ac基因和蛋白殘留，豐富了轉Bt水稻飼喂安全性評價體系。

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（責任編輯 馬鑫）

The Residue Detection of cry1Ab/Ac Gene and Protein in the Gut of Rattus norvegicus Feeding Transgenic Rice

Xu Deng1，2Geng Lili2Li Ning2Liu Xiaohui2Lu Fan1Zhang Jie2
（1. School of Resource & Environmental Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan 450068；2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

The exogenous cry1Ab/Ac gene and protein residues in the jejunum， ileum， cecum of Rattus norvegicus feeding transgenic rice and parent rice were detected. The testing results showed that there were no residues of cry1Ab/Ac gene in 3 intestinal parts of R. norvegicus fed transgenic rice for 50 and 110 d， and overall length or fragment of exogenous cry1Ab/Ac gene gradually degraded after 4 h， and completely at 12 h in vitro. No residues of Cry1Ab/Ac protein were detected in contents of the above 3 parts of R. norvegicus using ELISA and Western blot method. In conclusion， the exogenous gene and protein of the transgenic rice were not remained in the intestines of R. norvegicus.

transgenic rice；Rattus norvegicus；gene and protein residues；digestion in vitro

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.019

2015-04-26

轉基因生物新品種培育重大專項（2012ZX08011001）

徐燈，男，碩士，研究方向：轉基因生物安全評價；E-mail：xudg1230@163.com

張杰，男，博士，研究員，研究方向：生防微生物功能基因研究；E-mail：jzhang@ippcaas.cn盧凡，男，博士，教授，研究方向：藻類生物技術；E-mail：lulab99@gmail.com