九香蟲醇提物對運動大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表達水平的影響

高穎暉周萬紅竇鵬戚一曼王敦

（1. 西北農林科技大學昆蟲研究所，楊凌 712100；2. 西北農林科技大學體育部，楊凌 712100）

九香蟲醇提物對運動大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表達水平的影響

高穎暉1，2周萬紅1，2竇鵬1戚一曼1王敦1

（1. 西北農林科技大學昆蟲研究所，楊凌 712100；2. 西北農林科技大學體育部，楊凌 712100）

旨在探討補充九香蟲醇提物對運動大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表達水平的影響。對大負荷游泳訓練大鼠補充劑量分別為各組平均體重的0.5、1.0和1.5 g/kg的九香蟲提取物，在8周大負荷訓練結束后測定骨骼肌抗氧化酶活性與表達水平。8周大負荷訓練后，相比單純大負荷運動組，補充九香蟲提取物組SOD、CAT、GST三種抗氧化酶活性均顯著增加，同時3種酶的編碼基因表達水平也顯著上調。說明補充九香蟲提取物提高運動大鼠骨骼肌抗氧化酶系活性的機理之一是上調了編碼基因的表達水平。

九香蟲提取物；運動大鼠；骨骼肌抗氧化酶；表達水平；酶活性

九香蟲（Aspongopus chinensis）是常用的昆蟲源中藥材，屬于昆蟲綱、半翅目、蝽科，其生藥為干燥的成蟲蟲體。九香蟲在中醫中是一味常見的處方藥，其藥用記載最早見《本草綱目》中對其的藥效描述“治脘膈氣滯、脾腎虧損，壯元陽”［1］。目前，九香蟲在中藥中常用于治療胃寒脹痛、肝胃氣痛、腎虛陽痿和腰膝酸痛等疾病［2］。近些年隨著科技的進步，研究發現九香蟲體內的一些藥用成分不僅對一些疑難病癥具有良好的治療作用，而且能促進機體新陳代謝、抗癌等作用；豐富的營養成分還具有很好的食療滋補作用［3-7］。迄今，對于其上述藥理作用尚無系統的研究報道。我們在前期的動物實驗研究中發現，九香蟲醇提物能顯著增強大鼠運動能力，提高實驗動物肌肉抗氧化酶活性，以及清除肌肉組織中過氧化物等作用［8］。本研究在我們前期研究基礎上，以運動大鼠為實驗對象，進一步探討九香蟲醇提物對運動大鼠骨骼肌抗氧化酶的影響及其分子機制，旨在為深入理解昆蟲藥物的藥理學和研發新的運動疲勞恢復補劑提供基礎參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 供試動物為雄性SD大鼠，由西安交通大學醫學院醫學試驗動物中心提供，一共50只，平均體重約240 g。大鼠被隨機分為5組進行室內飼養。飼養在22-24℃常溫條件下進行，室內通風、自然光照。大鼠自由飲水進食、標準混合飼料喂養。1.1.2 昆蟲材料與浸膏制備 供試九香蟲A. chinensis生藥材購自西安中藥材交易中心。將購回的九香蟲材料于干燥箱中60℃干燥8 h，然后粉碎、過篩（20目），最后均勻混和后密封4℃冷藏保存。粉碎的九香蟲材料用常溫常壓冷浸法［8，9］提取，萃取液旋蒸獲得浸膏。浸膏溶解于分析純酒精中，配制成濃度為1.0 g/mL的溶液，2℃保存。

1.2 方法

1.2.1 訓練方法 適應性飼喂2周后，5組大鼠剔除生長不良和體重偏差較大的個體，重新隨機分為4組，參考任啟俊等［8］的實驗方案進行實驗。訓練內容為：第1周適應性游泳60 min，第2周逐漸增加運動時間至150 min，每周訓練6 d，共持續8周。4組處理中飼喂九香蟲提取物的為3組，在每次訓練后灌服該提取物劑量分別為各組平均體重的0.5、1.0和2.0 g/kg；大負荷訓練對照組（CK）1組，每次訓練后灌服5%乙醇水溶液安慰劑10 mL。第8周訓練結束后，各組大鼠進行力竭游泳（采用大鼠開始實驗時體重的8%為負重負荷），以大鼠沉入水中10 s不能浮出水面為力竭標準。

1.2.2 酶活性測定 在大鼠8周運動訓練結束后，立即將其頸椎脫臼處死，切取其大腿部位骨骼肌，用冰浴預冷的生理鹽水沖洗一次，濾紙吸除骨骼肌表面水分，加入液氮冰浴充分研磨后待用。每組骨骼肌樣品中3 g用于RNA制備（每個處理3個重復、每個重復1 g樣品）；剩余樣品用生理鹽水制成100 g/L勻漿液。隨后在4℃下對剩余樣品勻漿液離心（4 000 r/min、10 min），將上清液轉移入滅菌離心管并置于-80℃冰箱保存備用。

3種抗氧化酶分別為過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽轉移酶（GST）。它們的活性測定均根據試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明完成。

1.2.3 RT-PCR分析 分別用Trizol（TaKaRa）提取前述步驟準備的各組骨骼肌樣品中的總RNA，然后立即采用試劑盒RT reagent Kit Perfect Real Time（TaKaRa）進行反轉錄獲得cDNA用于后續檢測。3種抗氧化酶的RT-PCR檢測采用20 μL體系，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ反應液10 μL、引物各0.8 μL、模板DNA 2.0 μL、6.4 μL ddH2O。階段I反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環；65℃ 15 s。檢測儀器為iCycler iQ5 RT-PCR儀（Bio-Rad）。內參基因（β-actin）、3個抗氧化酶基因檢測引物序列如下：β-actin-F：5'-GAAATTGTGCGCGACATCAAGGA-3'；β-actin-R：5'-GCAATGCCCGGGTACATGGTGGT-3'。CAT-F：5'-ACAAGGCAATCCAGTCTATT-3'；CAT-R：5'-AATCGTCCAACAGGTATCAA-3'。GST-F：5'-GGGCATCTGAAACCTTTTGA-3'；GST-R：5'-GAGCCACATAGGCAGAGAGC-3'。SOD-F：5'-GCCTTGACTCTCCTGTAC-3'；SOD-R：5'-GCTCGTCCTATTATAGAATGTG-3'。

九香蟲提取物添加實驗組3種基因表達量以CK組的測定值為基準，求得倍數。

1.2.4 數據分析 分析用試驗數據均為3次重復的平均值，采用SPSS軟件（版本v12.0）對數據進行單因素t檢驗，顯著性水平設置為α=0.05的顯著和α=0.01的極顯著。采用EXCEL制作圖表。

2 結果

2.1 對大鼠骨骼肌抗氧化酶的活性的作用

由表1可知，與單純大負荷運動組（CK）相比，九香蟲提取物在3種添加水平下大鼠骨骼肌SOD活性均顯著升高（P＜0.05），且隨著添加水平的增加SOD活性明顯呈極顯著遞增規律（P＜0.01）；與CK相比，CAT和GST活性均在0.5 g/kg時未發現顯著變化（P＞0.05），但隨著添加水平的增加，在CAT和GST活性均有極顯著升高（P＜0.01）。

表1 九香蟲提取物對大鼠抗氧化酶活性的影響

2.2 對大鼠骨骼肌抗氧化酶基因表達的影響

由圖1可知，與單純的大負荷運動組（CK）相比，補充九香蟲提取物實驗組動物的SOD基因表達水平均極顯著升高（P＜0.01），且呈遞增趨勢。與單純的大負荷運動組（CK）比較，補充九香蟲提取物實驗組0.5 g/kg添加水平即引起CAT表達水平的顯著升高（P＜0.05）；并在1.0 g/kg和1.5 g/kg時，呈極顯著升高（P＜0.01），且呈遞增趨勢。與單純的大負荷運動組（CK）相比，當補充九香蟲提取物劑量增加到1.0 g/kg以上時，GST表達水平顯著升高（P＜0.01），其表達水平升高程度與九香蟲提取物補充劑量呈正相關。

圖1 三種抗氧化酶基因表達水平分析

3 討論

在大負荷運動等原因引起動物體內自由基異常增多的情況下，這些自由基會造成肌細胞傷害，進而影響運動后的恢復、甚至造成運動能力下降［10］。清除自由基的抗氧化酶類是動物體內抗自由基、抗氧化系統的重要組成，這些酶類的存在使體內過氧化自由基的形成和清除保持動態平衡。因此，自由基拮抗劑的研究在運動營養領域中一直是備受關注的話題，國內外很多學者先后利用天然產物作為自由基拮抗劑，進而研發為抗氧化功能增進劑或運動恢復補劑［11-16］。前期研究發現九香蟲提取物能夠明顯延長大鼠游泳力竭時間、提高抗氧化酶活性［8］，本研究結果證明以上作用的機理之一，是九香蟲提取物能夠上調實驗動物肌肉中抗氧化酶編碼基因的表達水平，動物體內3種抗氧化酶表達水平的上調引起運動大鼠骨骼肌SOD、CAT、GST活性的顯著提高。說明九香蟲提取物作為潛在的運動補劑，對抗肌肉細胞內過氧化反應的機制之一是促進了動物體抗氧化酶的表達水平、提高了動物抗氧化能力。前期研究發現九香蟲提取物能夠增強動物的運動能力［8］，推測也與其增強動物的抗氧化能力有關，這與殼聚糖對動物運動能力增強的機理類似［12］。

4 結論

運動大鼠補充九香蟲提取物后，其骨骼肌中3種抗氧化酶活性均顯著升高，同時3種抗氧化酶的編碼基因表達水平也有顯著升高。這種對運動大鼠骨骼肌抗氧化功能促進作用的機理之一，是上調了相關抗氧化酶基因的表達水平。

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（責任編輯 馬鑫）

The Effects of Ethanol Extract from Aspongopus chinensis on the Activities of Antioxidant Enzymes in Skeletal Muscle of Exercised Rats and Their Gene Expression Levels

Gao Yinghui1，2Zhou Wanhong1，2Dou Peng1Qi Yiman1Wang Dun1
（1. Institute of Entomology，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100；2. P.E. Department，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100）

The effects of ethanol extract from Aspongopus chinensis（EEAC）on the activities of antioxidant enzymes in skeletal muscle of exercised rat and their gene expression levels were analyzed in this study. The EEAC was supplemented to rats that were given heavy-load swimming training at 3 dose levels of 0.5 g/kg， 1.0 g/kg and 1.5 g/kg based on the average weight of each group. The activities and encoded genes expression levels of antioxidant enzymes in skeletal muscle were measured after 8 weeks training. The activities of SOD， CAT and GST with EEAC supplementation were increased significantly compared to non-supplemented training rats， and the encoded genes for these 3 enzymes were up-regulated also. The results suggest that the one mechanism for the increase of antioxidant enzymes activities in skeletal muscle of exercised rats is that the expression levels of encoded genes were up-regulated by EEAC supplementation.

ethanol extract from Aspongopus chinensis；exercised rat；antioxidant enzymes in skeletal muscle；expression level；enzyme activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.021

2015-03-30

高穎暉，女，碩士，講師，研究方向：運動生理生化；E-mail：yinghuigao@aliyun.com

王敦，男，博士，教授，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：dunwang@foxmail.com