應用于miRNA靶標檢測的雙熒光素酶報告載體的構建及鑒定

印翠 張俊玲 施志儀 孫文慧 孫近近

（上海海洋大學水產與生命學院 農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306）

應用于miRNA靶標檢測的雙熒光素酶報告載體的構建及鑒定

印翠 張俊玲 施志儀 孫文慧 孫近近

（上海海洋大學水產與生命學院 農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306）

以牙鲆空通氣孔同源框2基因（empty spiracles homeobox 2，emx2）為例，構建包含emx2 3'UTR區的野生型和突變型雙熒光素酶重組報告表達載體，以期應用于miRNA靶標的檢測。利用Trizol 法提取牙鲆成魚精卵巢混合組織總 RNA，參照已克隆出來的 emx2 基因cDNA 序列，設計并合成 emx2 3'UTR片段的引物并進行 PCR 擴增，將得到的基因片段和 psiCHECK-2 載體雙酶切后，用T4 DNA Ligase 酶進行連接反應，并轉化入 DH5α 感受態細胞，篩選后得到野生型重組質粒；同時采用定點誘變法對emx2基因進行體外定點誘變并采用同樣的方法形成突變型重組質粒。對野生型和突變型重組質粒進行雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定及測序分析。成功克隆了emx2 3'UTR區，并將emx2 3'UTR區的miRNA靶點序列GACTTGA突變為 AGTCCAG，成功構建了野生型和突變型包含emx2 3'UTR區的miRNA靶標檢測載體。通過RT-PCR、基因重組及定點誘變技術成功構建了應用于miRNA靶標驗證的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體 psiCHECK-emx2-3'UTR 和 psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR。

牙鲆；miRNA；emx2；定點誘變；psiCHECK-emx2-3'UTR；psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR

MicroRNAs（miRNAs）是一類長約22個堿基的非編碼單鏈小分子RNA，普遍存在于各種生物中［1-4］，通過與靶基因的3'端非翻譯區（3'-UTR）的互補結合［5，6］，進而誘導靶mRNA 的切割降解、翻譯抑制等其他調節機制在轉錄后水平調控基因表達［7］。已有報道表明，多達30%的基因成為了miRNA的潛在靶基因［8，9］，因而miRNA靶標的檢測逐漸成為研究miRNA功能的重要環節。全基因組研究已經證實了miRNA在哺乳動物性腺的發育中起著舉足輕重的作用。我們先前已在牙鲆（Paralichthys olivaceus）性腺中鑒定了 141個成熟miRNA，有些miRNA如pol-miR-143、pol-let-7a等在精卵巢中均有較高表達，而一些miRNA如pol-miR-26a、pol-miR-26b等則存在明顯的性別差異表達［10］。在豬的卵巢中，miR-26b被報道可通過直接下調ATM基因的表達而體外誘導顆粒細胞凋亡［11］。我們通過公共數據庫 TargetScan、PicTar和miRBase等靶基因預測軟件發現，牙鲆空通氣孔同源框2基因（Empty spiracles homeobox 2，emx2）的3'UTR區可與pol-mir-26a，-26b完全互補結合從而可能成為其靶基因。

emx2基因是果蠅ems（Empty spiracles）的同源結構域基因，含同源轉錄因子，在果蠅頭部的早期發育過程中發揮重要作用。脊椎動物emx2位于同源盒基因（Homeoticgenes，hox）家族的外側，在哺乳動物發育中的大腦表達并對端腦背側、大腦皮層和中樞神經系統發育起著關鍵作用［12-14］。近幾年來有研究者發現，哺乳動物Emx2基因在子宮內膜上皮細胞中是一種必需的增殖抑制基因［15］；而在發育中的泌尿生殖系統以及能形成排泄器官和生殖系統的原基細胞中也有表達，并呈生殖周期性變化［16，17］。缺乏EMX2可使老鼠患特納綜合癥即性腺發育不完全［18］。生殖周期中自然發生的EMX2表達下降對正常的增殖、蛻膜化等都是必需的。目前，對此基因在魚類性腺發育中的功能及其與miRNA的關聯研究甚少。因此，本研究以牙鲆emx2基因為例，克隆了emx2 3'UTR區，并對其潛在的pol-miR-26a-26b可能結合位點，即miRNA識別靶mRNA的“種子序列”進行定點誘變的基礎上，構建野生型和突變型emx2基因 3'UTR雙熒光素酶報告載體，旨在為后續研究miRNA通過調節emx2基因的表達而調控牙鲆性腺發育的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Trizol Reagent（Invitrogen 公司，美國）；M-MLV、Rnasin inhibitor、Dpn I酶和psiCHECKTM-2靶標克隆載體（Promega，美國）；DL2000、1 kb DNA Ladder Marker、PrimeSTAR HS DNA-Polymerse、T4 DNA Ligase、Not I、Xho I、TaKaRa TaqTM（TaKaRa公司，日本）；DNA 凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒（DONGSHENG BIOTECH，中國）；E.coli DH5α菌株為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 miRNA靶點預測 根據先前我們已測序得到的牙鲆miRNA和emx2基因序列，通過靶基因預測 軟 件 miRBase（http：//www.mirbase.org/），PicTar WEB INTERFACE（http：//pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/ PicTar_vertebrate.cgi），TargetScanFish 6.2（http：//www. targetscan.org/fish_62/）和computer-based RNAhybrid（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/ submission. html）等預測miRNA與其靶基因3'UTR區結合位點。

1.2.2 牙鲆總RNA提取、反轉錄及RT-PCR釣取基因 根據我們已克隆的牙鲆emx2基因序列設計3' UTR區引物，上下游引物5'端分別攜帶Xho I、NotI酶切位點。用于構建野生型靶標克隆載體的引物為3'-emx2XhoIF：5'-CCGCTCGAGGAGGAAGGCTCGGA GTCTCAG-3'，3'-emx2NotIR：5'-ATAAGAATGCGGCC GCGCATTTCTGTACATGGAATACGC-3'。

取剛解剖完的牙鲆成魚精卵巢混合組織1 g，研磨后采用Trizol法提取精卵巢混合組織總RNA，并將其反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，3'-emx2Xho IF、3'-emx2NotIR為引物，進行PCR擴增。PCR反應在25 μL反應體系中進行，包含2.5 μL 2 mmol/L dNTP mixture、2.5 μL 10×KOD buffer、1.5 μL 25 mmol/L MgSO4、1.5 μL cDNA、0.3 μL KOD PLus Neo、17.1 μL ddH2O、上下游引物各0.3 μL。PCR擴增條件為：94℃預變性3 min；98℃變性15 s，58℃退火15 s，68℃ 延伸 1.5 min，共30個循環。擴增完成后取5 μL產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物的特異性。

采用DONGSHENG公司的DNA凝膠回收試劑盒，對上述目的片段進行回收。回收的目的片段與pMD19-T載體連接，藍白斑篩選陽性克隆，提取質粒，送上海生工生物工程技術有限公司測序鑒定。

1.2.3 野生型重組報告載體的構建 分別取野生型emx2 3'UTR PCR回收產物和psiCHECK-2載體各15 μL，用Xho I/Not I雙酶切，在50 μL的酶切體系中加入1.5 μL Xho I、1.5 μL Not I、5 μL 10×buffer、27 μL ddH2O。37℃反應3 h左右。酶切產物采用DONGSHENG公司的DNA凝膠回收試劑盒進行回收。在10 μL目的片段和載體的連接體系中加入3 μL酶切回收的PCR產物、2 μL 酶切回收的載體psiCHECK-2、1 μL 10×Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、3 μL ddH2O。16℃連接2 h，連接物轉化到DH5α感受態細胞，將其涂布于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB平板上，37℃生化培養箱培養過夜，隨機挑取若干陽性克隆于3 mL LB管中搖床過夜培養后，采用G-SHUN高純質粒小量提取試劑盒提取質粒，獲得野生型psiCHECK-emx2-3'UTR重組質粒。利用雙酶切和測序對陽性重組質粒進行鑒定。

1.2.4 突變型重組報告載體的構建 根據miRBase、TargetScanFish 6.2、RNAhybrid預測出的miRNA與其靶基因3'UTR 區的結合位點的序列，對其進行定點突變，將emx2 3'UTR中第971位堿基GACTTGA突變為AGTCCAG。同時結合Primer 5.0 和Oligo 6來設計包含突變序列的引物，委托上海英駿公司合成。引物序列為：mutemx2F：5'-GCACGCAGCCTTTCTG TCAGAGTCCAGCCCTCCAGTGAAAGTTGCCAAG-3'；mutemx2R：5'-CTTGGCAACTTTCACTGGAGGGCTGG ACTCTGACAGAAAGGCTGCGTGC-3'。

以上述構建好的野生型重組報告載體psiCHECK-emx2-3'UTR的陽性質粒為模板，質粒稀釋50倍 后取1 μL做 模 板。 采 用KOD Plus neo DNA Polymerase進行體外定點誘變。在0.2 mL EP管中進行RT-PCR反應。在25 μL反應體系中加入2.5 L 2 mmol/L dNTP mixture、2.5 μL 10×KOD buffer、1.5 μL 25 mmol/L MgSO4、1 μL cDNA、0.3 μL KOD PLus Neo、16.6 μL ddH2O、上下游引物各0.3 μL。PCR 擴增反應：94℃預變性3 min；98℃變性15 s，58℃15 s，68℃ 4 min 30 s，共20 個循環。擴增完成后，取1 μL Dpn I酶 37℃ 4 h處理去除帶甲基化的原始模板鏈，取1 μL Dpn I酶處理的DNA轉化到DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB平板上，37℃生化培養箱培養過夜，隨機挑取若干陽性克隆于3 mL LB管中搖床過夜培養后，采用G-SHUN高純質粒小量提取試劑盒提取質粒，獲得突變型psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR重組質粒。利用雙酶切和測序對陽性重組質粒進行鑒定。

2 結果

2.1 miRNA靶點預測結果

為確定emx2與miRNA之間的關系，通過利用4種生物信息學軟件（TargetScan、PicTar、miRBase和RNAhybrid）預測出牙鲆emx2 是pol-miR-26a 和pol-miR-26b 的潛在靶基因，pol-miR-26a和-26b與emx2 結合位點圖，見圖1。

圖1 牙鲆信使RNA（mRNA）emx2 的序列鑒定

2.2 靶標3'UTR區克隆結果

采用RT-PCR 法從牙鲆成魚精卵巢混合組織中成功擴增出emx2 3'UTR長為1 027 bp 的特異性擴增條帶（圖2）。與pMD19-T 克隆載體連接后，對陽性克隆進行酶切鑒定并進行DNA 測序，結果顯示，測序所得序列與已知序列一致。

圖2 牙鲆emx2 3'UTR的克隆

2.3 野生型和突變型重組報告載體的鑒定

將構建的野生型psiCHECK-emx2-3'UTR和突變型psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR重組報告載體，用 Xho I/Not I雙酶切陽性克隆，得到線性質粒和emx2 3'UTR區基因片段，經電泳分析（圖3）顯示，大小分別約為6 000 bp 和1 000 bp，與空質粒和牙鲆emx2 3'UTR 基因大小一致。而圖4的泳道1（大小位于6 000-7 000 bp之間）與圖3泳道1大小接近，表明野生型和突變型重組報告載體均構建成功。

圖3 野生型重組質粒的雙酶切驗證

圖4 突變型重組質粒的PCR驗證

2.4 定點突變結果

野生型和突變型質粒測序結果經BLAST分析表明定點突變成功，即emx2 3'UTR區miRNA識別“種子序列”GACTTGA突變為AGTCCAG。

3 討論

miRNA通過與其靶基因結合從而調控靶基因的表達。一些miRNAs通過下調它們作用的靶基因而在哺乳動物性腺發育過程中發揮著重要作用，例如已有報道稱miR-26b通過直接下調其靶基因ATM可在體外誘導豬卵巢顆粒細胞凋亡；而且miR-26b的過表達可誘導豬卵巢顆粒細胞的凋亡，在miR-26b的mimic轉染組中顆粒細胞的DNA斷裂顯著上升［11］。同樣，在老鼠的卵巢中，mmu-miR-124與精巢發育重要基因SOX9直接結合。在原發性性腺細胞培養中mmu-miR-124的過表達可抑制SOX9基因的表達［19］。Lin等已詳細闡述了pol-miR-26是性腺差異表達的miRNA［10，11，20］，而Pellegrini等發現EMX2調控哺乳動物性腺的發育［17，18，21］。為了研究在牙鲆性腺發育中pol-miR-26a、-26b與 emx2之間的相互關系，本研究利用TargetScan、PicTar等軟件成功預測了pol-miR-26a、-26b的靶基因并從中選取了性腺發育相關基因emx2，同時預測出pol-miR-26a、-26b與emx2的結合位點。在此基礎上，本研究成功克隆了牙鲆emx2 3'UTR區，對其與pol-miR-26a、-26b的結合位點進行了定點突變，從而構建了其野生型和突變型的靶標報告載體。

根據羅師平等［22］的報道，盒式突變法、寡核苷酸引物介導的定點突變法及重疊延伸聚合酶鏈反應定點突變法等是比較常用的定點突變法。但與此同時這些方法操作復雜，非特異性突變較多等，使定點突變的實驗受到一定阻力。本研究中采用了一種簡便、快速、準確經濟的基因定點突變的方法。它非常巧妙地抓住了甲基化的模板質粒對Dpn I酶十分敏感，而合成的突變質粒對Dpn I酶切不敏感這一特性，通過酶切去除模板質粒，只得到突變質粒，使之操作準確無誤。此外，本研究所采用的KOD Plus neo DNA Polymerase是公認最好的高保真高效率高速的PCR酶之一（保真性約為Taq酶的80倍），能快速高效的避免延伸過程中不必要的錯配。本研究采用低次數的循環延伸而非聚合酶鏈反應，有助于減少無意錯配。整個突變只需20個循環、1次Dpn I酶切和1次轉化就完成了定點突變，突變成功率較高，尤其適于DH5α來源的DNA。無需進行亞克隆，也無需對PCR產物進行末端處理等，大大減少了上述傳統點突變的工作量，因而本研究通過該種定點突變，成功將emx2 3'UTR區miRNA識別“種子序列”GACTTGA突變為AGTCCAG。

圖5 野生型與突變型質粒的比對結果

實驗采用的靶標克隆載體psiCHECK-2載體［23］是目前使用較多的靶標克隆載體，它可將RNAi與熒光素酶發光相偶聯，如本研究中將RNAi的靶片段（emx2 3'UTR區）插入到海腎熒光素酶hRluc下游的多克隆位點中；當RNAi有效時，轉錄的熒光素酶RNA被降解，無發光反應；當RNAi無效時，轉錄的熒光素酶RNA被翻譯成熒光素并參與發光反應，通過檢測發光即可反應RNAi的效果。雙報告基因用于實驗系統，通常一個報告基因用于內對照，使另一個報告基因的檢測均一化。此前使用螢火蟲熒光素酶可結合β-半乳糖苷酶（β-Gal）、葡萄醛酸糖苷酶（GUS）或氯霉素乙酰轉移酶（CAT）等作為雙報告基因，但β-Gal、CAT等檢測方式復雜、可檢測范圍和靈敏度均較差，不是理想的內參。本研究應用的psiCHECK-2載體，以海腎熒光素酶作為主要報告基因，還引入一個螢火蟲熒光素酶表達歸一化，二者反應都為發光反應，檢測方式一致、檢測范圍和靈敏度相近，且二者發光反應的底物不同，不會相互影響，是目前理想的雙報告基因系統。此外，psiCHECK-2載體含有單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子（HSV-TK）、多聚腺苷酸加尾信號［SV40 Late poly（A）］和質粒所需的其他組成部分，可在哺乳動物細胞中穩定高表達外源插入片段，是目前研究miRNA與mRNA功能較為理想的表達載體。

4 結論

本研究運用RT-PCR、基因重組和定點突變技術成功構建了牙鲆emx2基因的野生型（psiCHECK-emx2-3'UTR）和突變型（psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR）雙熒光素酶報告載體，為檢測牙鲆emx2基因與miRNA間的作用關系奠定了基礎。。

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（責任編輯 馬鑫）

The Construction and Identification of Dual-luciferase Reporter Plasmids Used in miRNA Target Detection

Yin Cui Zhang Junling Shi Zhiyi Sun Wenhui Sun Jinjin
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources of Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Taking Paralichthys olivaceus empty spiracles homeobox 2（emx2）as an example， we constructed the wild-type and mutant luciferase reporter plasmids containing emx2 3'UTR region for being utilized in miRNA target detection. The total RNA was extracted from the mixtures of testis and ovarian in adult fish with Trizol. Using previously-cloned cDNA sequences of emx2 as a reference， a pair of specific primers for emx2 3'UTR fragment were designed and synthetized， then amplified genes by RT-PCR and psiCHECK-2 vector were treated with double restriction enzyme digestion， and then ligated with T4 DNA Ligase. The ligated fragment was transformed into the competent cells of DH5α， then the wild-type recombinant plasmid were obtained by screening. In vitro site-directed mutagenesis of emx2 was carried out， and a site-directed mutant plasmid was generated by the same methods. The results indicated that the emx2 3'UTR of P. olivaceus was successfully cloned， and GACTTGA， the sequence of miRNA target sites in it was mutated to AGTCCAG. The wild-type and mutant luciferase reporter plasmids used in miRNA target detection were constructed successfully. In conclusion， with the techniques of RT-PCR， gene recombination and site-directed mutagenesis， the wild-type luciferase reporter plasmids psiCHECK-emx2-3'UTR and mutant one of psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR used in miRNA target detection were successfully constructed， which lays the foundation for further researches on identification and function of miRNA target emx2.

Paralichthys olivaceus；miRNA；emx2；site-directed mutagenesis；psiCHECK-emx2-3'UTR；psiCHECK-mutatedemx2-3'UTR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.026

2015-03-16

國家自然科學基金青年項目（41306128），國家自然科學基金面上項目（30271017）

印翠，女，碩士研究生，研究方向：牙鲆生殖與發育；E-mail：yincui082@163.com

施志儀，男，教授，博士生導師，研究方向：魚類發育生物學；E-mail：zyshi@shou.edu.cn