重組駱駝蓬脂轉移蛋白與順鉑聯合抑制黑色素瘤B16細胞增殖效應的研究

常晨晨 王燕 管珊 孫素榮

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

重組駱駝蓬脂轉移蛋白與順鉑聯合抑制黑色素瘤B16細胞增殖效應的研究

常晨晨 王燕 管珊 孫素榮

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

旨在探討重組駱駝蓬脂轉移蛋白（Recombinant Peganum harmala lipid transfer protein，rPhLTP）與順鉑（DDP）聯用對鼠黑色素瘤B16細胞增殖抑制和凋亡誘導作用。MTT法檢測rPhLTP、順鉑單獨及聯用后對鼠黑色素瘤B16細胞增殖的影響；流式細胞術檢測細胞凋亡，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和線粒體膜電位（Δψm）的變化情況。結果顯示，rPhLTP和DDP聯用后細胞生長抑制率和凋亡率顯著高于DDP單獨處理組（P ＜ 0.01）；而且胞內ROS升高的水平均高于單獨處理組（P ＜ 0.01），胞內Δψm水平均低于單獨處理組，但無顯著性差異。rPhLTP可增強順鉑對B16細胞的生長抑制并促進細胞凋亡，與順鉑具有協同作用。

重組駱駝蓬脂轉移蛋白；順鉑；鼠黑色素瘤B16；增殖抑制

惡性黑色素瘤是發生在皮膚和黏膜之間且可轉移的一種高度惡性腫瘤，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢［1］。順鉑（Cislpatin，DDP）是臨床上常用化療藥物，廣泛用于治療各種癌癥［2］，但具有耳毒性、腎毒性等毒副作用且腫瘤易對其產生耐藥性［3-5］，使其臨床應用受到限制。

植物非特異性脂轉移蛋白（Non-specific lipid transfer proteins，nsLTPs）是一類普遍存在于植物體內的小分子、多功能、堿性可溶性的蛋白［6］，因對脂質分子具有廣泛親和力［7］，在體外可將磷脂等脂質體從表面轉運至線粒體中而得名［8］，具有轉脂［9-11］、抗菌及抑制腫瘤［12］等作用。Lin等［13］從甘藍中分離的LTP可抑制肝癌Hep G2細胞和乳腺癌MCF 7細胞的增殖，其IC50為5.8和1.6 μmol/L。此外，Tousheh等［14］研究發現水稻nsLTPs，在細胞內還可作為抗癌藥物載體。脂轉移蛋白所具有的多種生物活性，目前已受到科學界廣泛關注。

駱駝蓬（Peganum harmala）是蒺藜科（Zygophyllaceae）駱駝蓬屬（Peganum）的一種多年生草本植物，具有止咳平喘、消寒助陽的作用，其生物堿具有殺蟲、抗菌、鎮痛、抗癌的作用［15］。本課題組在前期研究中發現，從傳統維藥駱駝蓬種子中分離出的駱駝蓬脂轉移蛋白（Peganum harmala Lipid transfer protein，PhLTP），在體外對多種腫瘤細胞具有抑制生長作用，且對正常細胞毒性較小［16］。通過基因工程手段獲得的重組駱駝蓬脂轉移蛋白（rPhLTP）在體內具抑瘤作用［17］。本研究旨在探討重組PhLTP和DDP聯合應用對黑色素瘤B16細胞增殖和凋亡是否有協同效應。

1 材料與方法

1.1 材料

16細胞為鼠黑色素瘤細胞，為本實驗室保存。重組駱駝蓬脂轉移蛋白rPhLTP為本課題組誘導表達純化。順鉑購自齊魯制藥有限公司，1640培養基及胎牛血清（美國Gibco公司），MTT及DMSO（美國sigma公司），Annexin V-FITC/PI apoptosis kit（聯科生物公司），DCFH-DA、DiOC6（3）（美國Sigma公司），胰酶，3423型二氧化碳培養箱（美國Thermo公司），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和實驗分組 細胞培養于含質量分數為10 g/L FBS的1640培養基，37℃，5% CO2飽和濕度的恒溫培養箱中孵育。實驗分組為：空白對照組、rPhLTP組、DDP組、rPhLTP與DDP聯合組。rPhLTP的終濃度梯度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL，80 μg/mL，DDP的終濃度梯度為2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL及兩藥協同（rPhLTP 10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL + DDP 2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL），rPhLTP及DDP用1640培養基配制。

1.2.2 MTT法檢測藥物對細胞生長的抑制作用 將5×104個/ mL細胞接種于96孔板，每孔100 μL，待細胞貼壁后分別加入藥物作用24 h后，吸棄廢培養液，每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL）和80 μL培養基，作用4 h后吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩15 min后在490 nm處檢測吸光值。根據公式，細胞生長抑制率=［1（-實驗組OD值-空白組OD值）（/對照組OD值-空白組OD值）］× 100 %，計算抑制率。rPhLTP和DDP的聯合作用效果根據兩藥作用系數（Coefficient of drug interaction，CDI）計算，CDI=AB/（A×B），AB為兩藥聯合作用的OD值與對照組OD值的比值，A或B為單藥處理組OD值與對照組OD值的比值。當CDI ＜ 1時，表明兩藥具有協同作用，當CDI ＜ 0.75時，表明協同作用極顯著［18］。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將4×105個/mL細胞接種于6孔板中，總體積為2 mL。細胞貼壁后分別加入不同濃度的藥物作用24 h后，收集各處理組細胞，分別按AnnexinV-FITC/PI apoptosis kit試劑盒說明書說明書操作，用FACSCalibur流式細胞儀檢測。

1.2.4 胞內活性氧（ROS）的檢測 將4×105個/mL細胞接種于6孔板，每孔2 mL，待細胞貼壁后分別加入藥物作用24 h后收集細胞，沉淀加1.5 μmol/L DCFH-DA，37℃孵育15 min。收集細胞使用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 線粒體膜電位（Δψm）的檢測 將4×105個/mL細胞接種于6孔板，每孔2 mL，待細胞貼壁后分別加入藥物作用24 h后，收集細胞，離心，沉淀加4 nmol/L的DiOC6（3），37℃避光15 min后離心，PBS重懸，流式細胞儀檢測（激發波長484 nm，吸收波長501 nm）的熒光強度，Cell Quest軟件分析結果。

1.3 統計學分析

各組實驗均重復3次，用Prism 5軟件對數據進行統計處理，采用雙因素方差分析進行檢驗分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 rPhLTP、DDP單獨或聯用對細胞生長抑制的影響

MTT結果顯示（表1），當用10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的rPhLTP處理 細 胞后，檢測到對B16細胞的增殖抑制率分別為（23.36 ± 0.043）%、（36.59 ± 0.076）%、（47.13 ± 0.059）%、（83.58 ± 0.062）%，2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL的DDP處理細胞后發現其對細胞的增殖抑制率分別為（16.68 ± 0.098）%、（29.46 ± 0.108）% 和（34.98 ± 0.044）%。結果表明不同濃度的rPhLTP或DDP單藥處理B16細胞后，與空白對照組相比，濃度為20 μg/mL、40 μg/mL的rPhLTP以及濃度為5 μg/mL、10 μg/mL的DDP具有顯著性差異（P ＜ 0.05），濃度為80 μg/mL的rPhLTP具有極顯著性差異（P ＜ 0.01），rPhLTP和DDP單獨作用對B16細胞的增殖抑制具濃度依賴性。當不同濃度的rPhLTP、DDP共同作用后對B16細胞的增殖抑制作用均高于單藥處理組，且40 μg/mL rPhLTP與2.5 μg/mL DDP協同作用后，對B16細胞的增殖抑制率為（59.51 ± 0.185）%，顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）處理后細胞的增殖抑制率，同時也顯著高于40 μg/mL rPhLTP處理后對細胞的增殖抑制率（P ＜0.01）。通過計算兩藥聯合作用指數CDI，發現不同濃度的 rPhLTP與不同濃度的DDP聯合作用后，CDI均小于1，說明rPhLTP可增強DDP對B16細胞的增殖抑制作用，具有協同效應。

2.2 rPhLTP與DDP聯合應用對細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染檢測結果（圖1，表2）顯示，不同濃度的rPhLTP處理B16細胞24 h后，檢測到凋亡率分別為（3.33 ± 0.034）%、（4.21 ± 0.78）%、（6.17 ± 0.19）% 和（9.32 ± 0.15）%，與對照組相比均具有顯著性差異（P ＜ 0.05）；不同濃度的DDP處理后檢測到其凋亡率分別為（2.15 ± 0.27）%、（3.03 ± 0.19）% 和（4.42 ± 0.11）%，與對照組相比濃度為5 μg/mL和10 μg/mL的DDP具有顯著性差異（P ＜ 0.05），表明不同濃度的rPhLTP與DDP可以濃度依賴性的方式誘導B16細胞發生凋亡。當rPhLTP與DDP聯合作用作用B16細胞后，檢測到其凋亡率均高于單藥處理組細胞的凋亡率，且當不同濃度的rPhLTP與10 μg/mL的DDP聯用后，檢測到其凋亡率均顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）處理后細胞的凋亡率（4.42 ± 0.11）%（P ＜ 0.05），當高濃度的rPhLTP（40 μg/mL）與2.5 μg/mL的DDP聯合后其對細胞的凋亡率（6.69 ± 0.69）% 顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）處理后細胞的凋亡率（4.42 ± 0.11）%（P ＜ 0.01）。

表1 rPhLTP與DDP單獨及聯合作用對B16細胞的增殖抑制

2.3 胞內活性氧（ROS）的檢測

當細胞受到外界物質刺激而發生凋亡時，細胞內的ROS水平會發生變化。為了檢測rPhLTP與DDP 單獨及聯合作用是否對B16細胞ROS產生影響，采用DCFH-DA熒光染料對處理的細胞進行染色。結果（表3）表明，當用10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL的rPhLTP 處理細胞后，檢測到ROS的平均熒光強度（MIF）分別為（143.66 ± 5.98）%、（230.44 ± 1.12）%、（290.05 ± 1.66）%、（310.55 ± 1.59）%， 用 2.5 μg/mL、5 μg/mL和 10 μg/mL的DDP處理細胞后檢測到ROS的MIF分別為（169.28 ± 4.01）%、（245.67 ± 3.09）%和（268.25 ± 3.80）%。說明隨著rPhLTP或DDP濃度的增加，胞內ROS的水平也呈上升的趨勢，與對照組相比濃度大于40 μg/mL的rPhLTP以及濃度大于5 μg/mL的DDP均具有顯著性差異（P ＜ 0.05）。rPhLTP與 DDP聯合作用后檢測到ROS的MIF均高于rPhLTP、DDP單獨處理細胞后胞內的ROS水平，且20 μg/mL rPhLTP與低濃度的DDP（2.5 μg/mL）聯合作用胞內的ROS為（308.87 ± 8.92）%，顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）單獨處理細胞后胞內的ROS（268.25 ± 3.8）% 水平，同時也顯著高于20 μg/mL rPhLTP單獨處理細胞后胞內ROS（230.44 ± 1.12）%的水平（P ＜ 0.01）。結果提示rPhLTP與DDP聯合作用B16細胞后，可使胞內的ROS水平發生變化，說明二者聯合誘導細胞發生凋亡可能與ROS的升高相關。

圖1 流式細胞術檢測B16細胞凋亡率

表2 rPhLTP與DDP聯合作用對B16細胞凋亡率的影響

表3 rPhLTP與DDP聯合作用對B16細胞ROS的影響

2.4 線粒體膜電位（Δψm）的檢測

在凋亡的細胞中，由于線粒體會受到損失而使橫跨線粒體的膜電位下降或消失。在本實驗中，通過DiOC6（3）熒光染料檢測rPhLTP、DDP 單獨及聯用后B16細胞中線粒體膜電位（Δψm）的變化。結果見圖2和表4，當10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL的rPhLTP處理細胞后其胞內Δψm的MIF分別為（95.04±086）%、（94.38 ± 0.10）%、（90.13 ± 1.20）%和（83.63 ± 1.20）%，2.5 μg/mL、5 μg/mL及10 μg/mL的DDP處理后檢測Δψm的MIF分別為（93.75 ± 0.65）%、（90.19 ± 0.34）%和（85.67 ± 0.93）%，表明rPhLTP、DDP單獨作用B16細胞后，胞內Δψm的水平以濃度依賴性的方式降低。rPhLTP與DDP聯用后，Δψm降低的水平較單藥處理組細胞高。

圖2 不同濃度的rPhLTP作用后B16細胞線粒體膜電位的改變

表4 rPhLTP與DDP聯合作用對B16細胞Δψm的影響

3 討論

惡性黑素瘤在體內的自然凋亡率比其它腫瘤要低，具有抵抗藥物誘導凋亡特性，且其預后差［1］，因此有必要研究探討治療惡性黑素瘤的有效方法。順鉑（DDP）被用于治療多種腫瘤，其機制涉及DNA損傷和誘導線粒體凋亡從而激活腫瘤細胞凋亡信號發揮作用［2，19］，但DDP毒副作用大［3-7］，因此需要尋找一種藥物與其聯用以減輕其不良反應。植物脂轉移蛋白可以抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡［12-14］。本課題組前期研究發現重組駱駝蓬脂轉移蛋白及重組真核質粒均能抑制體內黑色素瘤細胞的生長［17，20］，預示駱駝蓬脂轉移蛋白在治療黑色素瘤中具有潛在應用價值。

本實驗應用MTT法檢測了rPhLTP合用DDP時對B16細胞增殖的影響，結果表明當40 μg/mL rPhLTP與2.5 μg/mL DDP共同作用后，對B16細胞的增殖抑制率顯著高于單藥處理組（P ＜ 0.01），兩藥聯合作用指數CDI均＜1，說明rPhLTP可增強DDP對B16細胞的增殖抑制效應，對B16細胞有化療增敏作用。用流式細胞儀檢測二者合用對B16細胞凋亡的影響，結果發現不同濃度的rPhLTP與DDP可以濃度依賴性的方式誘導B16細胞發生凋亡，當rPhLTP與DDP聯合作用B16細胞后，檢測到其凋亡率均高于單藥處理組細胞的凋亡率，且當40 μg/mL的rPhLTP與2.5 μg/mL的DDP聯合后其對細胞的凋亡率顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）處理后細胞的凋亡率。推測rPhLTP協同 DDP對B16細胞的增殖抑制作用可能與誘導細胞凋亡有關。

據文獻報道，ROS是細胞凋亡的早期信號，促使線粒體膜通透性改變，使線粒體膜電位下降，還能與caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡體，誘導細胞凋亡［21］。當細胞受到凋亡誘導信號的刺激后，胞內的ROS會升高，可上調自噬以殺傷腫瘤細胞［22］。梁曉松等［23］研究表明大黃素可提高腫瘤細胞內ROS水平，從而提高癌細胞對化療藥物的敏感性。本研究發現rPhLTP與DDP聯用胞內的ROS水平均高于rPhLTP、DDP單獨處理組，提示兩藥聯用誘導B16細胞發生凋亡可能依賴于胞內ROS放大信號的作用，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。

許多研究結果表明線粒體是細胞凋亡的核心，線粒體膜電位對維持線粒體正常功能是十分必要的，大多抗癌藥物在誘導各種類型細胞凋亡均伴隨線粒體膜電位的下降，一旦線粒體膜電位崩潰，細胞凋亡不可逆轉［24］。如劉浩等［25］研究表明白藜蘆醇可通過降低黑色素瘤細胞的線粒體膜電位，誘導細胞凋亡。本研究發現rPhLTP、DDP單獨作用細胞后胞內Δψm隨藥物濃度的升高而降低，且兩藥聯用后胞內Δψm水平均低于rPhLTP、DDP單獨處理后胞內Δψm水平，但無顯著性差異。提示rPhLTP與DDP可能協同作用于線粒體，通過降低線粒體膜電位，破壞線粒體穩定性，使誘導凋亡的因子釋放到細胞質中誘導細胞凋亡，從而提高抗腫瘤效果。但二者聯合應用誘導細胞凋亡的作用機制及可能的作用靶點有待于進一步研究。

4 結論

rPhLTP與順鉑有協同作用，可增強順鉑對B16細胞的增殖抑制作用，并以濃度依賴性的方式促進B16細胞發生凋亡。

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（責任編輯 李楠）

The Synergistic Inhibitory Effects of Recombinant Peganum Harmala Lipid Transfer Protein and Cisplatin on the Proliferation of Melanoma B16 Cells in vitro

Chang Chenchen Wang Yan Guan Shan Sun Surong
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This work is to explore how the combination of recombinant Peganum harmala lipid transfer protein（rPhLTP）and cisplatin（DDP）inhibits the proliferation of melanoma B16 cells and induces the apoptosis of them. MTT assay was used to measure the effects of individual rPhLTP and DDP and combination of them on the proliferation of melanoma B16 cells. The cell apoptosis rate， reactive oxygen species（ROS）， and mitochondrial transmembrane potential（Δψm）level were measured using flow cytometry. The results showed that both inhibitory rate and apoptosis rate by the combination of rPhLTP and DDP were significantly higher（P ＜ 0.01）than by individual DDP or rPhLTP，moreover also levels of ROS raised inside cells by the combination were higher than by individuals（P ＜ 0.01）. However， the levels of Δψm inside the cells by the combination were lower than those by individuals， but the differences between the combination and individuals were not such significant. In conclusion， rPhLTP enhanced the inhibitory effect of DDP on the proliferation of B16 cells and promoted the cell apoptosis，indicating that rPhLTP and DDP has synergistic antitumor effect on B16 cells.

recombinant peganum harmala lipid transfer protein；cisplatin；melanoma B16 cells；proliferation inhibition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.027

2015-05-27

新疆維吾爾自治區科技支疆項目（20091129），新疆生物資源基因工程重點實驗室開放基金項目（XJDX0201-2010-06）

常晨晨，女，碩士研究生，研究方向：分子克隆與藥物篩選；E-mail：528193074@qq.com

孫素榮，女，教授，碩士生導師，研究方向：細胞工程與藥物篩選；E-mail：sr_sun2005@163.com