大腸桿菌menA敲除對CoQ積累的影響研究

劉永青任琳張子鋒

（1.呂梁學院，離石 033000；2.西安交通大學生命科學與技術學院，西安 710049）

大腸桿菌menA敲除對CoQ積累的影響研究

劉永青1，2任琳1張子鋒1

（1.呂梁學院，離石 033000；2.西安交通大學生命科學與技術學院，西安 710049）

通過同源重組敲除大腸桿菌的menA基因，增加菌體CoQ合成量，用于構建CoQ高產菌株。以pKD4質粒為模板，PCR擴增kanr片段；在pKD46的輔助下，kanr片段轉化大腸桿菌，利用抗生素篩選和PCR驗證重組子；以紫外誘變菌為對照，發酵menA基因敲除菌株，分析CoQ種類和產量變化。成功獲得menA基因敲除菌株，CoQ種類不變，產量增加約為38%。首次敲除menA基因，改良株CoQ產量得到提高，達到預期目標。

大腸桿菌；基因敲除；menA基因；CoQ；同源重組

輔酶Q（CoQ）是一種脂溶性醌類衍生物，呼吸鏈上的電子傳遞體［1］。人體中主要以CoQ10的形式存在［2］，具有抗氧化、保護細胞膜完整、消除心血管治療中他汀類藥物導致的副作用等良好的生物學功能［3，4］，已成功地應用于線粒體相關的多種疾病的治療、預防保健和化妝品等領域［5-11］。較之合成或提取法，微生物發酵法制備的CoQ生物活性高、無原材料限制、成本低無污染，成為CoQ生產的理想途徑［12，13］。但目前生產菌株缺乏，成為發酵生產的瓶頸，因此構建CoQ高產菌株是實現CoQ發酵生產的必由之路［14］。

目前微生物發酵法選育CoQ高產菌株主要通過誘變育種和代謝工程育種實現。誘變育種包括基因誘變［15］和抗終產物結構類似物誘變［16］。運用誘變手段雖然可使菌株發生突變，但目標性不明確，需要無數次的變異才能達到目的，周期比較長，而且容易發生回復突變。Red同源重組技術是代謝工程育種的一種新興技術，可將一段抗性片段導入宿主菌細胞，利用λ噬菌體Red 重組酶的作用，使導入細胞的線性DNA 片段與染色體特定靶序列重組，靶基因被標記基因置換下來。

本研究基于Red同源重組技術，經L-阿拉伯糖誘導表達λ噬茵體的3個重組蛋白后，對pKD46介導的大腸桿菌CoQ合成旁路途徑［17，18］的關鍵基因1，4-二羥基-2-萘酸八異戊烯基轉移酶基因menA［19，20］進行敲除，阻斷旁路途徑、積累側鏈前體IPP，搜尋能提高菌株CoQ含量的有效途徑，為日后構建CoQ高產菌株積累經驗。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；pkD4、pkD46由軍事醫學科學院惠贈；10×PCR Buffer，10 mmol/mL dNTP，高保真Taq酶（10 U/μL），EB指示劑，6×loading buffer，DNA marker等均購自西安沃爾森；氨芐青霉素，卡納霉素，羅紅霉素，胰蛋白胨，瓊脂糖，無水氯化鈣，Tris，EDTA，酵母膏，瓊脂粉，牛肉膏等均購自交大物資中心；快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，PCR純化試劑盒，質粒提取試劑盒，基因組DNA提取試劑盒均購自大連寶生物。

1.2 方法

1.2.1 kanr片段擴增 以pKD4質粒作為模板設計帶有FRT位點的kanr基因引物，擴增kanr片段用于menA基因的敲除。上游引物為GATGGGGCTGA AAGGCCCCATTTTTATTGGCGCGTATTATGAGGAATT AGCCATGGTCC，下游引物為TTGTTAATTGATATTT GTCAGTTATGCTGCCCACTGGCTTAGTAGGCTGGAGC TGCTTC。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min10 s，35個循環；72℃延伸10 min。

1.2.2 menA基因的敲除 活化大腸桿菌DH5α，OD600=0.2-0.4時用CaCl2法制備感受態細胞。利用熱擊法將pKD46轉入感受態細胞，32℃復蘇45 min，涂布于含青霉素（50 μg/mL）的LB平板上，32℃過夜培養。

挑選陽性克隆傳代，加L-阿拉伯糖（終濃度為0.1%），繼續培養至OD600=0.5-0.6，無菌條件下操作：冰浴15 min，4℃，2 500 r/min離心10 min，棄上清，分別用無菌水和500 μL 10%滅菌甘油冰上溫和清洗，重復前操作，溶于500 μL 10%滅菌甘油得制備DH5α（pKD46）感受態細胞。將kanr片段電轉化，電擊參數為：25 μF，200 Ω，2.5 kV，5 ms。32℃孵育1 h，涂布于含青霉素（50 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板上，32℃過夜培養［21］。挑取陽性單克隆，劃線接種于含氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上，轉接2次，驗證其遺傳穩定性。

1.2.3 E.coli［menA］菌株的驗證 分別以穩定傳代的E.coli［menA］和E.coli原始菌株基因組為模板，PCR擴增驗證menA基因是否被敲除。上游驗證引物：ATGGCAGGTGAACGAATC；下游驗證引物1：CCATTTCCCGCATCACAT，下游驗證引物2：CAGTCATAGCCGAATAGC；PCR擴增條件同前，退火溫度改變為56.9℃。

1.2.4 大腸桿菌中CoQ的提取純化 制備流程：發酵液→4 000 r/min離心20 min收集菌體→真空冷凍干燥后稱重→90℃醇堿皂化30 min，同時加入焦性沒食子酸防止CoQ被氧化→石油醚萃取2次→超純水洗至pH7.0→無水Na2SO4干燥→-20℃冷凍1 h→過濾除雜→旋轉蒸發儀干燥→10 mL無水乙醇定容→低溫保存待用。

1.2.5 menA基因敲除對CoQ種類和含量的影響測定

1.2.5.1 CoQ10標準曲線的繪制 CoQ10標準曲線制備過程如下：配制0.2 mg/mL的CoQ10標準品溶液，分別稀釋成5、10、15、20、25和30 μg/mL濃度，在275 nm處紫外檢測其吸收值［22］。

1.2.5.2 HPLC方法驗證CoQ種類 為了檢測基因敲除后是否造成CoQ種類的改變，在CoQ提取純化基礎上，對各菌株的提取液進行了HPLC檢測，以大腸桿菌DH5α提取液作為CoQ8的保留時間標準對照。實驗參數［23，24］為：色譜柱為Agilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm）；流動相為95%無水乙醇：5%甲醇；流速l mL/min；檢測波長275 nm；溫度25℃；進樣量20 μL。

1.2.5.3 menA基因敲除對CoQ含量的影響測定 實驗以M9培養基作為基礎培養基，需要情況下加入卡那霉素50 μg/mL，培養至對數中期（13 h），提取純化CoQ，采用紫外分光光度計法測定menA基因敲除菌株E.coli［menA］的CoQ含量，以出發菌株E.coli為對照。

1.2.6 紫外線誘變對CoQ含量的影響

1.2.6.1 菌懸液制備 分別取10 mL培養至對數期的發酵液于6個無菌離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，沉淀用10 mL生理鹽水洗滌離心2次。

1.2.6.2 紫外線誘變 紫外燈預熱15 min，取6組菌懸液各0.1 mL注入LB平板中，涂布均勻。紫外燈照射條件：15 W，30 cm，照射時間分別為15、30、45、60、75、90 s，整個過程在暗室中完成。未經照射的平板作為對照，每組3個平行。照射后立即取出，暗室中37℃培養24 h。將處理好的菌懸液做適當稀釋，將細胞濃度控制在107-108個/mL。

1.2.6.3 初篩 根據致死率曲線，取對菌株致死率為70%-80%的處理時間進行誘變［25］。吸取0.1 mL菌懸液涂布于羅紅霉素篩選平板上，進行紫外照射。挑選長勢好的菌株進行復篩。

1.2.6.4 復篩 經初篩挑選的突變株，種子液中過夜培養，按2%的接種量轉入發酵培養液，37℃ 180 r/min搖床培養至對數期，按方法1.5提取COQ，采用紫外分光光度計法測定突變菌株CoQ含量。

2 結果

2.1 kanr線性片段的擴增

設計kanr基因的擴增引物，以pKD4質粒為模板進行PCR。帶有FRT位點的kanr基因凈長1 496 bp，加上兩端外延部分及menA基因同源臂共長1 636 bp（圖1），凝膠電泳結果（圖2）顯示擴增產物與理論長度相符。

圖1 kanr基因片段擴增引物設計示意圖

圖2 kanr線性片段擴增結果

2.2 kanr線性片段重組結果

抗性篩選結果顯示，對照組由于kanr基因未轉入，平板上沒有菌株生長；而轉入kanr基因的平板上有單菌落出現。以初步認為此菌落是kanr基因重組成功菌株。從上述平板B中挑取陽性菌落，將單克隆接種于含氨芐青霉素、卡那霉素的LB培養基上傳代培養，發現其遺傳穩定性良好。

將篩選到的目的菌株稀釋涂布接種在卡那霉素單抗培養基上，42℃過夜消除pKD46。將42℃下形成的單菌落分別接種于卡那霉素單抗培養基和氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性培養基上驗證抗性，選取在卡那霉素培養基上生長良好而氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性培養基無法生長的菌種，視為pKD46消除的E.coli［△menA］候選菌株進行進一步驗證。

2.3 E.coli［△menA］重組子驗證

選取pKD46質粒消除的待驗證E.coli［△menA］候選菌株，提取基因組DNA，用設計的兩對引物P3-P4和P3-P5分別對menA 基因敲除前后的菌株進行PCR擴增，引物擴增到762 bp片段說明menA基因被kanr敲除，若用P3-P4引物擴增到1 082 bp片段說明menA基因未被敲除。

擴增產物電泳結果（圖4）顯示，第2-5泳道為E.coli［△menA］候選菌株PCR結果，當用P3-P4引物擴增時，未能擴增得到理論上的1 082 bp menA基因片段，說明menA基因不存在。當用P3-P5引物擴增時，獲得了762 bp的片段，與理論上推測的kanr替換menA結果一致，說明敲除成功。對照組E.coli菌株PCR結果（泳道6-9）顯示，P3-P4引物可以和E.coli菌株基因組模板特異結合，PCR產物大小為1 082 bp（泳道8，9）；而P3-P5引物擴增的結果是無特異性條帶生成（泳道6，7）。通過menA 基因敲除前后菌株特異PCR產物的鑒定，認為實驗構建菌株即為E.coli［△menA］菌株，此構建工作已順利完成。

圖3 E.coli［△menA］菌株PCR驗證示意圖

圖4 E.coli［△menA］重組子PCR驗證結果

2.4 紫外誘變

紫外誘變大腸桿菌的致死率曲線如圖5，隨著紫外照射時間延長，大腸桿菌致死率提高，當紫外誘變時間為60 s時，致死率達到78%。下一步對紫外誘變60 s的正突變菌株進行研究。

圖5 紫外誘變大腸桿菌的致死率曲線

取稀釋好的菌懸液涂于初篩培養基平板上，紫外處理60 s，37℃培養24 h，得突變菌落17株，挑選單菌落保存于斜面培養基，搖床復篩，測定突變株COQ產量。

2.5 menA基因敲除與紫外誘變對CoQ的影響測定

2.5.1 CoQ10標準曲線的繪制 用無水乙醇配制不同濃度的CoQ10標準品溶液，OD275nm處檢測其吸光值，標準曲線如圖6。以CoQ10質量濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標進行回歸計算，得回歸方程為y=0.018x+0.008，相關系數R2=0.998。

圖6 CoQ10標準曲線

2.5.2 menA基因敲除與紫外誘變對CoQ含量的影響測定 采用紫外分光光度計法分別測定menA基因敲除菌和突變株的CoQ含量，結果如表1所示，紫外誘變產生2株正突變株（編號為D1，D2），CoQ含量都有不同程度的提高，但相比于menA基因敲除菌，CoQ含量提高不大，故選定menA基因敲除菌作為候選菌株進一步研究。

測定結果表明，menA敲除菌株在相同條件下，比出發菌CoQ含量明顯提高，提高幅度約為38%。2.5.3 CoQ種類驗證 分別以CoQ10標準品和原始大腸桿菌DH5α CoQ提取液作為CoQ8對照，對menA基因敲除菌CoQ提取物進行了HPLC定性鑒定（圖7）。從圖7可以看出，CoQ10標準品保留時間為7.1 min，原始大腸桿菌CoQ8提取液保留時間為5.6 min，根據保留時間可以判斷大腸桿菌menA基因敲除菌CoQ提取物中為CoQ8。

表1 menA基因敲除和紫外誘變對CoQ含量的影響

圖7 大腸桿菌menA基因敲除菌CoQ提取液的HPLC鑒定圖（保留時間min）

3 討論

維生素K2又稱甲基萘醌，也是一種芳香族醌類化合物，與CoQ擁有相同的底物分支酸和聚異戊烯長鏈。大腸桿菌維生素K2的合成途徑涉及到6個特定的基因，依次為menA，menB，menC，menD，menE和menF。分支酸先在menF編碼的分支酸異構酶作用下變成異分支酸，然后在menD、menC、menB和menE基因編碼的相應酶作用下生成1，4-二羥基-2-萘酸，最后在menA基因編碼的1，4-二羥基-2-萘酸八異戊烯基轉移酶作用下發生鏈環縮合，1，4-二羥基-2-萘酸和聚異戊烯長鏈連接成維生素K2。其中，menA基因編碼的酶是維生素K2合成過程中的限速酶。大腸桿菌既產CoQ又產維生素K2，因此可在兼性厭氧條件下生長。維生素K2作為大腸桿菌在厭氧條件下替代CoQ的電子傳遞載體，在好氧條件下并非細菌正常生長所必需的物質。因此敲除menA基因可以使維生素K2合成底物聚異戊烯長鏈積累，使得CoQ合成前體增加，使反應向CoQ合成的方向流動。同時維生素K2和CoQ都是脂溶性的膜定位活性物質，抑制維生素K2的合成還可以留給CoQ更多的膜空間。加拿大學者Corinne在加拿大工業微生物學會年會摘要中報道了與本研究相似的大腸桿菌旁路基因敲除思路［20］，但尚未見研究結果報道。本實驗首次對menA基因進行了敲除，并對其積累CoQ的能力進行了測定，與預期結果相符，在豐富CoQ高產菌株的構建方面具有重要意義。menA基因敲除相較于紫外誘變方法穩定性好，無回復突變，可短時間內定向改造菌種，提高目標產物量。

在此基礎上，可增加COQ合成過程中關鍵酶的表達提高COQ產量［26-28］。華東理工大學葉江等［29，30］對大腸桿菌UbiCA強化表達來提高COQ合成能力。改變COQ10合成途徑［31］主要包括兩個方面：通過重組聚十異戊二烯合成酶使大腸桿菌合成COQ10；將真核生物合成IPP的甲羥戊酸途徑重組入大腸桿菌，使IPP供應能力加強。將脫氮副球菌的dps基因重組入大腸桿菌，使其獲得合成CoQ10的能力；或將酵母合成聚十異戊二烯的ispB基因與大腸桿菌的ubiA基因在大腸桿菌中共表達，使CoQ10產量提高。華南理工大學李家洲等［32］將放射型根瘤菌ddsA基因替換大腸桿菌ispB基因并強化CoQ合成關鍵酶來提高CoQ10產量。要想獲得理想的代謝工程COQ生產菌株，應進行系統代謝通量分析，確定修飾和改造的靶點，多點協同改造。Xu［33］、劉建忠等［34，35］通過多基因策略、染色體工程改造大腸桿菌高效生產CoQ10取得了一定的效果。

發酵工藝優化方面，有意識的控制培養基的溶氧或氧化還原電位，或在培養基中添加抑制呼吸作用的疊氮化合物，控制相對較高的pH值，都有助于提高COQ的產量。另外采取邊生產邊萃取［36］的方法有助于降低生產過程中COQ對自身合成的反饋調節。江南大學金賽等［37］通過根癌土壤桿菌產輔酶Q10的補料分批發酵工藝使CoQ10產量得到大幅提高。總之，要實現COQ的工業化生產，應從多方面入手：生物合成途徑的探討、高產COQ大腸桿菌的構建、高產菌株的選育、發酵工藝的優化以及COQ提純檢測等下游技術的研究。

4 結論

首次成功敲除menA基因，大腸桿菌CoQ產量增加約38%，種類不變，達到預期目標。

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（責任編輯李楠）

The Influence of Knockout of menA Gene in Escherichia coli on the Accumulation of CoQ

Liu Yongqing1，2Ren Lin1Zhang Zifeng1
（1. Lüliang University，Lishi 033000；2. College of Life Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049）

Knocking out menA gene of Escherichia coli by homologous recombination increases the synthetized amount of CoQ， which is used for constructing the strains of high-yield CoQ. Using pKD4 plasmid as template， the kanrfragments were amplified by PCR. In the presence of auxiliary plasmid pKD46， the kanrfragments were transformed into Escherichia coli， and the recombinant one was confirmed by antibiotic screening and verification of PCR；By contrast with uv-induced mutation， the strains with menA gene knocked out were fermented， and the types of CoQ and the changes of CoQ yield were analyzed. The results showed that the strains with menA gene knockout were successfully obtained，while the types of CoQ unchanged and the yield increased about 38%. In conclusion， this is the first time of knocking out menA gene， CoQ production of mutant strains is improved， and the desired goal is achieved， which lays a foundation for the further construction of high-yield CoQ strains.

Escherichia coli；gene knockout；menA genes；CoQ；homologous recombination

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.030

2015-06-10

呂梁市科技計劃項目（GG201330-2）

劉永青，男，碩士，研究方向：分子微生物；E-mail：liuyongqing07@163.com