熒光碳點在脊椎類模式動物斑馬魚中的活體成像與毒理學研究

鄧 帥，李雨珊，段延芳，李 麗*，安利民*，鄭 敏，李炳生，吳 瓊，孫再成

（1.哈爾濱工業大學生命科學與技術學院，黑龍江哈爾濱 150080；2.黑龍江大學物理科學與技術學院，黑龍江哈爾濱 150080；3.發光學及應用國家重點實驗室中國科學院長春光學精密機械與物理研究所，吉林長春 130033；4.哈爾濱工業大學基礎與交叉科學研究院，黑龍江哈爾濱 150080）

文章編號：1000-7032（2015）04-0485-06

熒光碳點在脊椎類模式動物斑馬魚中的活體成像與毒理學研究

鄧 帥1，李雨珊1，段延芳2，李 麗1*，安利民2*，鄭 敏3，李炳生4，吳 瓊1，孫再成3

（1.哈爾濱工業大學生命科學與技術學院，黑龍江哈爾濱 150080；2.黑龍江大學物理科學與技術學院，黑龍江哈爾濱 150080；3.發光學及應用國家重點實驗室中國科學院長春光學精密機械與物理研究所，吉林長春 130033；4.哈爾濱工業大學基礎與交叉科學研究院，黑龍江哈爾濱 150080）

將熒光碳點引入透明斑馬魚胚胎中，研究了熒光碳點在斑馬魚中的活體成像和對斑馬魚的毒副作用。通過對水中添加熒光碳納米顆粒，從形態上觀察其對于斑馬魚個體發育的生物學效應，實時觀察其在斑馬魚體內富集代謝的情況，為熒光碳點及其復合物在生物活體成像方面的研究應用奠定基礎。結果表明，熒光碳點對斑馬魚生長發育無明顯的毒副作用，不會導致胚胎發育異常（通過觀察尾巴彎曲情況、色素深淺、血管發育速度、魚鰾發育速度來確定對胚胎發育的影響），并且對斑馬魚無明顯致死現象。熒光碳點進入斑馬魚體內的時間非常迅速，并且可以在48 h之內經代謝排出體外。

斑馬魚；熒光碳點；胚胎發育；生物毒性

1 引 言

熒光納米粒子在生物成像、藥效監測和腫瘤治療等方面有著潛在的應用前景［1-3］。為了實現這些功能，需要把納米粒子直接注入到生物體內，這樣就必須首先了解這些納米粒子對生物體的影響和在生物體內完整的代謝過程［4-5］。但是，對于許多半導體量子點，由于尺寸、表面效應或者含有重金屬等原因，實驗上已經證明其對人類健康存在著負面影響［6-8］。熒光碳量子點（碳點）是碳家族繼碳納米管、石墨烯、富勒烯之后的新成員，一出現便引起了廣泛的關注［9-10］。碳點具有分子量小、熒光穩定性高、激發光譜寬而連續、發射光譜連續可調等優點。此外，因為主要成分是碳，因而被認為具有生物相容性好且毒性低等特點，是生物標記和熒光成像等醫學應用的理想材料。經過近十年的努力，人們已經在碳點的制備和應用研究上取得了顯著的進步。

要使碳點能夠發光且發光波長連續可調，首先必須對其表面進行特殊的修飾。光電子能譜實驗證明經過修飾的碳點表面存在著C—N、C—O、C＝O和N—H化學鍵，表明這種發光碳點的表面非常復雜［11］。納米顆粒的性質與其表面特性有關，而經過修飾的碳點有沒有生物毒性還不清楚。目前大部分實驗是在老鼠表皮組織中進行成像和藥物診斷等方面的嘗試，而對于碳點自身對生物體的影響還沒有系統的研究。針對這個問題，我們引入了斑馬魚生物模型，研究了碳點對它的生物學影響。斑馬魚具有產卵數目多、魚卵容易收集篩選、胚胎透明易于觀察、靈敏度高和易重復等特點，是研究生態毒理性實驗的一種重要的模式動物［12］。利用斑馬魚透明和碳點發光的特點，我們用光直接激發進入到魚體內的碳點，觀察到了碳點在受精卵、活體內不同部位的熒光。本文系統研究了碳點從進入斑馬魚受精卵和斑馬魚活體體內、在體內的運動以及最后排出受精卵和體外的整個生物循環過程。實驗結果證明熒光碳點對斑馬魚受精卵和活體生長發育無明顯的毒副作用，不會可導致胚胎發育異常，也不會對斑馬魚的不同生理過程產生毒害作用，對斑馬魚無明顯致死現象。熒光CDs進入斑馬魚體內的時間非常迅速，并且可以經代謝排出體外。這也直接證明了CDs可以安全應用于醫學領域的生物成像和藥物監測等方面。

2 實 驗

2.1 熒光碳點的制備和提純

熒光碳點的制備方法見參考文獻［11］。在進行毒理實驗之前，先對碳點進行提純處理：取碳點粗產物2 mL，加入丙酮后離心，分離得到產物；將所得產物重新溶入少量水中，加入丙酮，再次離心，純化；將其溶于水后轉入截留分子量為1 500 u的透析袋中，每隔4 h換一次水，進行透析。24 h后，使用PBS調節pH值為7，然后配成不同濃度的碳點溶液，分別對斑馬魚受精卵和幼魚進行處理，觀察碳點在受精卵和幼魚中的代謝情況和毒理實驗。

2.2 碳點的代謝特性實驗

配成碳點濃度為0，50，100，200，400 μg/mL的溶液各4 mL，加入6孔培養皿中，選取受精后3 h的斑馬魚魚卵開始染毒實驗，每孔20只，每隔24 h更換液體，并進行觀察計數。選用濃度為0，25，50，100 μg/mL的溶液，每組溶液中培養20只孵化5 d的幼魚，染毒處理1.5 h后用E3培養液洗3次，然后在熒光顯微鏡460 nm波長照射光下觀察幼魚發光及代謝情況，隨后在24 h和48 h時再次在熒光顯微鏡下觀察幼魚發光情況。

2.3 斑馬魚毒理實驗（孵化率，心率，自主運動，畸形統計）

取濃度為0，25，50，100，200，400 μg/mL的溶液，加入6孔培養皿中，選取受精后3 h的斑馬魚魚卵開始染毒實驗，每孔18只。在產卵24 h后，每隔3 h統計魚的孵化率，直到魚全部孵化為止。在魚產卵24 h時統計魚卵的自主運動（即魚卵中的幼魚在1 min內的擺尾次數）情況，每組取9只魚卵。在魚產卵48 h時統計幼魚的心率，每組取5只幼魚。最后，統計魚的畸形率。

3 結果與討論

3.1 熒光碳點在斑馬魚受精卵內和幼魚體內的代謝特性

含有重金屬的納米粒子進入到生物體后一般會沉積到體內，很難排出體外，這也成了限制納米粒子在醫學方面應用的主要障礙。因為碳點的一個重要應用是生物成像，所以有必要了解它進入生物體內的代謝特性。利用斑馬魚透明和碳點發光的特點，我們在光照的條件下，觀察了碳點在受精卵和幼魚中的動態代謝情況。

碳點進入卵或魚體內后，在365 nm光激發下，將發出藍色光（～465 nm）。我們用不同濃度的碳點溶液對斑馬魚受精卵處理1.5 h，然后取出洗凈，置于純水中。圖1為不同靜置時間下的熒光碳點的代謝情況。從對比實驗可以看出，溶液中存在的碳點可以通過細胞膜進入到細胞中（0 h是指細胞卵被洗凈后，立刻進行觀察）。隨著碳點濃度的增加，細胞的發光亮度也增大，說明進入細胞的碳點數量增多。在魚卵表面，存在一些發光的大顆粒（見圖1底部左圖和右圖）。通過白光觀察細胞，發現亮點處是一些碳點的富集。而之所以富集，是由于細胞膜受損或壞死所致，并且即使通過多次洗滌，也很難除去。然后，把魚卵靜置在純水中24 h，再進行熒光觀測，發現溶液濃度為25 μg/mL實驗組碳點已完全代謝出魚體外，濃度為50，100 μg/mL實驗組碳點還略有殘留。等到靜置48 h后，100 μg/mL實驗組的受精卵中也觀察不到碳點，說明碳點可進入斑馬魚卵內富集且能正常代謝出來。在實驗過程中，發現碳點容易富集在細胞膜損傷處或壞死點，且難以洗掉，這一點可以從白光與熒光的對比實驗中看出。還有一點值得注意，從圖中可以發現碳點可以通過細胞膜進入到細胞質中，但是很難進入到細胞核中。

圖1 熒光碳點在斑馬魚受精卵中的發光與代謝情況。24 h后，25 μg/mL碳點處理的魚體內的碳點已經被排除體外。細胞膜損壞部位容易引起碳點的富集。

用不同濃度的碳點溶液處理1.5 h后，取出在純水中靜置不同時間后的斑馬魚幼魚的熒光成像如圖2所示。從圖中可以看出，隨著用于處理的碳點濃度的增加，發光亮度增大，說明進入到體內的碳點增多。從圖中還可以看到，在水中加入碳點來處理斑馬魚，碳點主要富集在口、鰓部和內臟等處，并無進入血液循環。隨著靜置時間的延長（48 h），斑馬魚幼魚能將從水中吸入的碳點完全排出體外。而我們在實驗中發現，一些納米粒子如二氧化硅小顆粒等，容易沉積在生物體內，無法排出體外，并且會引起一些嚴重的疾病。

圖2 用不同濃度的碳點溶液處理斑馬魚后，碳點在魚體內的代謝情況。利用碳點的發光特性，可以看出48 h后，碳點可以經過代謝排出體外。

3.2 熒光碳點在斑馬魚受精卵內和幼魚體內的毒理實驗

圖3 斑馬魚卵在碳點溶液中存活率統計

圖4 斑馬魚受精卵在各濃度熒光碳點溶液中的孵化率

從圖1中可知，碳點會進入到受精卵中，因而有可能對生命活動有影響。我們首先研究了不同碳點濃度的水溶液中，斑馬魚受精卵的存活率和孵化率。提純后的碳點配制成濃度為0，50，100，200，400 μg/mL的溶液，每組溶液中培養20只受精卵，持續168 h觀察它們的存活率。實驗統計結果總結在圖3中，發現實驗組與對照組并無明顯區別。為了進一步了解碳點濃度對受精卵的影響，在此基礎上，我們又進行了更大濃度的實驗，碳點濃度分別為0，500，1 000，2 000 μg/mL，實驗組和對照組仍無差別，僅有少數個體死亡，但這是少數受精卵無法正常生長發育的正常現象。圖4是斑馬魚受精卵在不同濃度的碳點溶液中的孵化率。受精卵經過35 h開始孵化成幼魚。從圖中可以看出，即使在濃度很高的碳點溶液中，受精卵的孵化率也未受到影響?；谝陨蠈嶒灲Y果可以得出結論：碳點具有良好的生物相容性，對斑馬魚的受精卵沒有明顯的致死、致畸等不良作用，也不影響其孵化率。

在接下來的實驗中，我們研究了碳點濃度對斑馬魚的自主運動和心率的影響。圖5是斑馬魚在不同濃度的碳點溶液中的自主運動情況。實驗表明，熒光碳點對斑馬魚自主運動的頻率影響不大。在0～400 μg/mL的濃度范圍內，自主運動基本不受碳點濃度的影響。圖6是不同濃度的碳點溶液對斑馬魚心率的影響。從圖中可以看出，熒光碳點對斑馬魚心率影響不大，在正常范圍內波動。

圖5 斑馬魚在各濃度熒光碳點溶液中的自主運動情況

圖6 斑馬魚在各濃度熒光碳點溶液中的心率情況

圖7是斑馬魚在不同濃度的碳點溶液中發生的畸形率。從圖中可以看出，不同濃度的碳點溶液對斑馬魚實驗組的畸形率影響不大，100 μg/ mL濃度的碳點溶液產生的畸形率最高，但也沒有超過12%，說明熒光碳點的致畸率較低。從圖1、3、4可知，碳點能夠進入到受精卵內，但并不影響受精卵的存活率和孵化率，對斑馬魚胚胎發育這個階段影響較小。而從圖2、5、6、7可知，碳點可以進入到斑馬魚體內，但并不能通過滲透進入到斑馬魚的血液循環系統，因而需要進一步研究碳點進入血液循環系統后，對斑馬魚生理活動的影響。目前，把碳點注射到斑馬魚的血管中的實驗正在進行當中。從圖7可知，碳點也能引起少量的畸形。通過顯微鏡觀察了不同碳點溶液中畸形的特征，如圖8所示。在濃度為50 μg/mL的碳點溶液中，斑馬魚出現了心竇水腫和脊椎彎曲兩種畸變現象；而在100，200，400 μg/mL的碳點溶液中，斑馬魚出現的畸形均為脊椎彎曲。在現階段，我們對碳點導致畸形的原因還不清楚。

圖7 斑馬魚在各濃度熒光碳點溶液中的畸形率

圖8 畸形斑馬魚與正常魚的對照。碳點會引起心竇水腫和脊柱彎曲等畸形。

4 結 論

系統研究了不同濃度的碳點溶液對斑馬魚受精卵和幼魚的影響。熒光碳點在受精卵和斑馬魚中仍然能夠發光，并且比較穩定。碳點對生物系統沒有毒性，對生物各項生理指標影響較小，在體內代謝快，不會長期積累。由于熒光碳點具有低毒性及制造成本低的優點，所以其代替目前所使用的用于生物研究的標記物有很大的可行性。

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鄧帥（1993-），男，四川江油人，哈爾濱工業大學本科在讀，主要從事生物技術方面的研究。

E-mail：627884373@qq.com

李麗（1977-），女，內蒙古通遼人，博士，副教授，2010年于日本筑波大學獲得醫學博士學位，主要從事分子生物學方面的研究。

E-mail：lilili@hit.edu.cn

安利民（1979-），男，黑龍江富?？h人，副教授，2010年于哈爾濱工業大學獲得博士學位，主要從事熒光量子點方面的研究。

E-mail：alm59@126.com

Flourescent Imaging and Toxicology Study of Carbon Dots in Transparent Zebrafishes

DENG Shuai1，LI Yu-shan1，DUAN Yan-fang2，LI Li1*，AN Li-min2*，ZHENG Min3，LI Bing-sheng4，WU Qiong1，SUN Zai-cheng3

（1.School of Life Science and Technology，Harbin Institute of Technology，Harbin 150080，China；2.College of Physics Science and Technology，Heilongjiang University，Harbin 150080，China；3.State Key Laboratory of Luminescence and Applications，Changchun Institute of Optics，Fine Mechanics and Physics，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130033，China；4.Academy of Fundamental and Interdisciplinary Sciences，Harbin Institute of Technology，Harbin 150080，China）
*Corresponding Authors，E-mail：lilili@hit.edu.cn；alm59@126.com

In this paper，we introduce the carbon dots（CDs）into transparent embryos of zebrafishes and study the fluorescent imaging and toxicology of CDs.With immerging oosperms and infants of zebrafishes into the aqueous solution of CDs for 1.5 h，the CDs go through the cell membrane and emerge inside of them.Then，from the morphological，we study the biological effects on the individual development and in vivo observe the supersession of zebrafishes.We demonstrate that CDs have no apparent toxicity on the growing development and do not induce the development abnormity of embryo.Furthermore，the CDs do not lead to the death of zebrafishes.We also find that CDs can enterinto the zebrafisher rapidly and be expelled from the body within 48 h.

zebrafishes；carbon dots；embryonic development；biotoxicity

O482.31

A DOI：10.3788/fgxb20153604.0485

2015-01-05；

2015-02-07

國家自然科學基金（21403061，11474076）；黑龍江省博士后科研啟動基金（LBH-Q13082）；中國博士后科學基金（2013M541420）；黑龍江大學學科青年學術骨干百人支持計劃；新教師基金（20132302120069）資助項目