利用雙熒光素酶報告系統鑒定靶向作用豬CD163基因的miRNA

吳俊靜　彭先文　喬木等

摘要：為了進一步篩選獲得抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）增殖的候選miRNA，為豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）防治及豬的抗病育種提供新策略，通過3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）測序獲得了豬CD163基因3′UTR的完整序列，生物信息學分析發現其具有miR-181c、miR-181d、miR-23b、miR-4262等miRNA的作用靶點。利用雙熒光素酶報告系統檢測發現，與陰性對照組相比，miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可極顯著（P<0.01）抑制熒光素酶的相對活性，其中miR-181d抑制效果最佳。

關鍵詞：雙熒光素酶報告系統；miRNA；CD163基因；豬

中圖分類號：R318； Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4854-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.052

Abstract： CD163 gene is one of the most important PRRSV entry mediators， which determines the cell susceptibility for PRRSV. If we can identify the miRNAs inhibiting CD163 gene expression， the anti-PRRSV miRNAs can be further acquired. In the present study， we got the full porcine CD163 3′UTR sequence by 3′RACE （Rapid-amplification of cDNA ends） sequencing， and found that it existed targeting sequences of miRNA，including miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262，by bioinformatics analysis. The results of dual luciferase reporter assay showed that miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262 could significantly reduced the related luciferase activity of reporter construct compared with the NC control group （P<0.01）， especially for miR-181d. These results indicated that the 4 miRNAs could directly target to porcine CD163 gene，which layed a foundation for the further screening of anti-PRRSV miRNAs in the future.

Key words： dual luciferase reporter system； miRNA； CD163 gene； pig

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種危害極大的傳染性疾病，因發病豬耳部發紺呈紫紅色斑塊狀，又稱藍耳病，主要導致母豬繁殖障礙（流產、死胎、弱胎、木乃伊胎等）、各年齡階段豬的呼吸道癥狀、哺乳仔豬的高死亡率、免疫抑制和持續性感染等[1]，造成巨大的經濟損失。PRRSV侵入宿主細胞首先通過與細胞膜表面上的特異性受體結合，利用細胞內吞作用感染易感細胞[2]，因此這些特異性受體存在與否決定了細胞對PRRSV的易感性。CD163是PRRSV感染宿主細胞的關鍵受體之一，參與介導病毒的內吞和增殖。

CD163是一種清道夫受體（Scavenger receptor），在PRRSV感染宿主細胞中起重要作用，主要參與病毒脫殼和基因組RNA的釋放過程。在PRRSV非易感細胞系（BHK-21、PK-15、NLFK）中轉染CD163真核表達質粒可以使這些細胞系感染 PRRSV 并在細胞內產生子代病毒粒子[3，4]。CD163的表達量高低與PRRSV復制效率呈正相關，上調CD163表達會增加病毒增殖，而下調CD163表達可降低病毒增殖[5]。豬肺泡巨噬細胞（PAM）是PRRSV的天然靶細胞，而采用CD163的抗體可以有效阻止PRRSV感染PAM[3]。永生化的PAM細胞系因無法正常表達CD163而變為PRRSV非易感細胞[6]。CD163是PRRSV感染過程中的關鍵受體，在PRRSV感染PAM或者是Marc-145細胞的過程中都必須要有CD163的表達。

MicroRNA（miRNA）是一類長約22 bp、高度保守的內源性非編碼RNA分子，其表達具有明顯的組織和時間特異性，能夠互補或部分互補的與靶mRNA結合，使mRNA降解或介導其翻譯抑制。成熟的miRNA可同時封閉多個靶基因的翻譯，干預調節miRNA可改變多個靶基因的表達水平，且干預調節效率很高[7]。miRNA在病毒感染和宿主天然免疫中起關鍵作用，參與病毒與宿主的互作，它有可能是細胞最原始的免疫方式。在小鼠中發現miR-126可通過靶向作用于VEGFR2調控病源引起的天然免疫反應[8]。在人巨噬細胞中，miR-155可靶向作用于SOCSS1，刺激干擾素信號通路下游基因表達，參與抗病毒天然免疫過程[9]。

豬CD163基因在PRRSV感染宿主豬細胞的過程中起關鍵作用，同時miRNA介導的基因調控對調節機體免疫功能具有重要作用，廣泛參與機體抗病毒反應。miRNA多數是通過與靶基因的3′UTR區序列特異性識別來實現對基因表達的調控作用，因此本研究構建了豬CD163基因3′UTR雙熒光素酶報告載體，篩選鑒定了靶向調控豬CD163基因的miRNA，可為篩選抑制PRRSV感染增殖的miRNA奠定基礎。endprint

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Marc-145細胞系由華中農業大學保存，用含10%胎牛血清的DMEM培養基對Marc-145細胞進行培養。psi-CHECK2載體、雙熒光素酶檢測試劑盒、T4 DNA連接酶和感受態大腸桿菌DH5α購自Promega公司；去內毒素質粒小量抽提試劑盒購自Omega公司；Opti-MEM無血清培養基、胎牛血清購自Gibco公司；DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自HyClone公司；Trizol試劑和脂質體（LipofectaminTM 2000）購自Invitrogen公司；3′RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）試劑盒、限制性內切酶XhoⅠ和NotⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTP均購自Takara公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；miRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司人工合成。

1.2 豬CD163基因的3′RACE測序

提取湖北白豬（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所實驗豬場）肝臟組織總RNA，使用Takara的3′RACE Adaptor引物進行反轉錄反應，合成cDNA第一鏈。反應體系為10 μL，反應程序為：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。

參考豬CD163基因GenBank的cDNA序列（登錄號：NM_213976.1）設計外、內兩個上游特異性引物（外引物：5′-CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC-3′和內引物：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3′），結合Takara 3′RACE試劑盒的外、內兩個下游錨定引物（外引物：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′和內引物：5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′），利用槽式降落PCR擴增3′UTR區片段。第一輪外引物PCR擴增反應體系為50 μL，其中反轉錄cDNA 2 μL，反應程序為：95 ℃預熱4 min；95 ℃變性30 s，62～52 ℃退火30 s（每個循環降低0.5 ℃），72 ℃延伸90 s，共20個循環；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共15個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。第二輪內引物PCR擴增反應體系為50 μL，其中第1輪PCR產物1 μL，反應程序為：95 ℃預熱4 min；95 ℃變性30 s，64～54 ℃退火30 s（每個循環降低0.5 ℃），72 ℃延伸90 s，共20個循環；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，共15個循環；72℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從瓊脂糖回收目的DNA，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.3 靶向豬CD163基因3′UTR的miRNA預測

利用生物信息學工具TargenScan，參考人CD163基因3′UTR序列，預測調控CD163基因表達的物種間保守miRNA（miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-23b、miR-23c等）及其作用靶位點序列（TGAATGT和AATGTGA），詳見http：//www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_61/view

_gene.cgi？taxid=9606&rs=NM_203416&members=&showcnc=0&shownc=0&showncf=。對比新擴增獲得的豬CD163基因3′UTR區序列，發現也包含這些保守miRNAs的靶位點序列（TGAATGT和AATGTGA）。人工合成miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-4262及陰性對照（NC）miRNA模擬物。

1.4 豬CD163基因3′UTR雙熒光素酶報告載體的構建

結合豬CD163基因CDS序列和以上3′RACE測序結果，設計包含豬CD163基因3′UTR區的1對引物，PCR擴增豬CD163基因3′UTR區的 469 bp片段。所用引物：上游引物：5′-CCGCTCGAGTCGCT

CATCTTTTGTTGC-3′，含有XhoⅠ酶切識別位點（CTCGAG）和保護堿基（CCG）；下游引物：5′-ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG-3′，含有NotⅠ酶切識別位點（GCGGCCGC）和保護堿基（ATTT）。PCR擴增反應體系為50 μL，反應程序為：95 ℃預熱4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，5個循環；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR反應產物用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用過柱離心的方法從瓊脂糖回收純化PCR產物，并對其進行測序驗證。

將切膠純化回收后的PCR產物及psiCHECK-2載體分別用限制性內切酶XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，然后采用T4 DNA 連接酶將線性化psiCHECK-2載體與CD163基因3′UTR 片段相連，連接體系為10 μL：psi-CHECK2載體2 μL，CD163基因3′UTR擴增片段6 μL，T4連接酶1 μL，10× T4 DNA連接酶緩沖液1 μL。混合體系于4 ℃連接過夜。取5 μL的連接產物連接反應產物轉化50 μL感受態大腸桿菌DH5α，采用菌液PCR篩選陽性克隆，并將用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切正確的重組質粒進行測序鑒定，測序鑒定正確的重組質粒命名為psi-CHECK2-CD163-3UTR。

1.5 熒光素酶活性的檢測endprint

在轉染前1 d，將5×104個細胞接種在24孔板中，加入無抗生素的培養基培養細胞。轉染當天，更換細胞新鮮培養液，用Opti-MEM無血清培養基稀釋質粒和脂質體，每孔加入200 ng psi-CHECK2-CD163-3UTR質粒、80 nmol/L各miRNA、2 μL LipofectaminTM 2000脂質體。將細胞培養板放入無菌的5% CO2培養箱中，培養5 h后更換為新鮮完全培養基，24 h后裂解細胞檢測熒光素酶活性。上述試驗每組設3個平行孔，以不進行轉染的細胞作為空白對照，每組試驗重復3次。

用冷PBS清洗細胞2次，加入120 μL細胞裂解液1×PLB，室溫搖晃15 min充分裂解細胞，然后將裂解液收集至1.5 mL離心管中，按照Promega 公司的雙熒光素酶檢測試劑盒（Dual-Luciferase Reporter Assay）說明書提供的方法，采用PerkinElmer公司的VICTORTM X2 Multilabel Plate Reader儀器檢測雙熒光素酶活性。

1.6 數據分析

螢火蟲熒光值（M1）為內參熒光值，海腎熒光值（M2）為報告基因檢測值，結果以M2與M1的比值（M2/M1）計算，利用SPSS 17.0對檢測結果進行統計分析。數據以平均數±標準差表示，檢驗標準以P<0.05為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 豬CD163基因的3′RACE測序及分析

miRNA多數是通過與靶基因的3′UTR區序列特異性識別來實現對基因表達的調控作用，而目前GenBank數據庫中豬CD163基因的3′UTR序列并不完整，無法進行調控豬CD163基因表達miRNAs的篩選鑒定研究。為了獲得豬CD163基因3′UTR的全序列，采用3′RACE結合槽式降落PCR技術，成功擴增獲得了豬CD163基因的特異性片段（圖1），片段測序結果與GenBank數據庫中已知的豬CD163 mRNA序列（NM_213976.1）進行比對分析，獲得豬CD163 CDS下游（3′）新的181 bp核苷酸序列，該序列包含PolyA特征的3′UTR核苷酸序列。

利用TargetScan生物學軟件預測可調控CD163基因3′UTR區的物種間保守miRNA（miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-23b、miR-23c等）及作用靶位點序列（TGAATGT和AATGTGA），發現新擴增獲得的豬3′UTR區也包含這些保守miRNA的作用靶位點序列。

2.2 豬CD163基因3′UTR雙熒光素酶報告載體的構建與鑒定

根據獲得的豬CD163基因的CDS和3′RACR測序結果，設計包含3′UTR區的1對引物，在5′端和3′端分別引入XhoⅠ和NotⅠ酶切識別位點及保護堿基，利用PCR方法擴增獲得了豬CD163基因的469 bp長的目的片段（圖2），將該片段插入雙熒光素酶報告載體psi-CHECK2的XhoⅠ和NotⅠ酶切位點之間，構建豬CD163基因3′UTR雙熒光素酶報告基因載體psi-CHECK2-CD163-3UTR，構建的載體結構如圖3所示。采用菌液PCR鑒定陽性克隆，并用XhoⅠ和NotⅠ限制性內切酶進行雙酶切鑒定，證實酶切后得到的469 bp的豬CD163基因3′UTR片段與預期大小相符（圖4）。抽提的重組質粒經測序再次驗證插入序列的正確性。

2.3 miRNA對豬CD163基因3′UTR的調控

為了檢測以上預測的miRNA是否能靶向調控豬CD163基因3′UTR，將psi-CHECK2-CD163-3UTR和相應miRNA模擬物分別共轉染Marc-145細胞，采用雙熒光素酶報告系統檢測熒光素酶活性，結果如表1和圖5所示。與NC對照組相比，轉染miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262可以極顯著（P<0.01）降低雙熒光素酶報告載體psi-CHECK2-CD163-3UTR的熒光素酶活性，其中miR-181d抑制效果最佳（降低46%）。說明miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可靶向作用于豬CD163基因3′UTR，對豬CD163基因具有一定的調控作用。

3 小結與討論

CD163是PRRSV感染宿主細胞的一個關鍵受體，主要參與病毒脫殼和基因組RNA的釋放過程。它由單核細胞-巨噬細胞特異表達，結構包含信號肽、9個串聯的SRCR末端重復序列、一個跨膜區以及胞質尾區。2005年Welch等[10]首次發現CD163與PRRSV感染有關，PRRSV非易感系的豬腎細胞表達CD163后，可以被PRRSV感染并產生子代病毒。Calvert等[3]將從各種細胞系中分離得到CDl63分子轉染到PRRSV不敏感的細胞系后，這些細胞內都產生子代病毒粒子。并且CD163表達量的高低與PRRSV復制效率呈正相關，上調CD163表達會增加病毒增殖，而下調CD163表達可降低病毒增殖[5]。Ren等[11]發現豬CD163基因CDS區域序列變異與豬PRRSV易感性顯著相關。

近幾年有文獻報道miRNA參與調控PRRSV感染。在人工miRNA方面，Xiao等[12]和Xia等[13]針對PRRSV病毒基因組特點，設計人工miRNA，利用內源性miRNA代謝途徑加工成熟后靶向降解PRRSV RNA，從而達到抑制病毒感染的效果。這表明人工miRNA的應用可能成為有效抗PRRSV的新策略。在內源性抗PRRSV增殖的miRNA研究方面，Wang等[14]發現與天然免疫相關的miR-125b能顯著抑制PRRSV的RNA復制和病毒增殖，miR-125b并不是直接作用于PRRSV的基因組，而是作用于宿主細胞中NF-κB的抑制因子κB-Ras2，通過調控NF-κB信號通路抑制PRRSV的增殖。endprint

CD163在PRRSV感染宿主細胞過程中具有重要作用，PRRSV必須依賴CD163的表達才能在宿主細胞中繁殖。因此，如果能鑒定獲得抑制CD163基因表達的miRNA，就可以進一步篩選獲得抑制PRRSV增殖的候選miRNA，為PRRS防治及豬的抗病育種提供新策略。本研究擴增獲得了豬CD163基因3′UTR的完整序列，生物信息學分析發現其具有miR-181c、miR-181d、miR-23b、miR-4262等miRNA的作用靶點。利用雙熒光素酶報告系統鑒定發現miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可靶向作用豬CD163基因的3′UTR，其中miR-181d抑制效果最佳。這4個miRNA也可能是潛在的能抑制PRRSV增殖的miRNA。然而，本結果還需要借助體外細胞學實驗進一步驗證。

Guo等[15]發現miR-181能與PRRSV RNA非編碼序列結合，抑制PRRSV感染，且體內實驗證實鼻滴miR-181模擬物可抑制PRRSV在仔豬體內增殖，緩解攻毒后仔豬發病癥狀。研究還表明宿主miR-181在PAM細胞表達量較低，而在非易感細胞或組織中高表達。在此基礎上，Gao等[16]進一步研究發現miR-181能靶向抑制CD163基因表達，從而抑制PRRSV感染，與本研究結果一致。Zhang等[17]研究結果顯示，上調表達miR-23能抑制PRRSV感染，而干擾掉內源性miR-23表達會增強PRRSV增殖，表明miR-23具有一定的抗PRRSV增殖效應。他們進一步研究指出miR-23能通過激活IRF3/IRF7誘導產生Ⅰ型干擾素，從而抑制PRRSV感染。然而并未研究miR-23與CD163基因的靶向調控關系，很可能miR-23能通過多種途徑（包括抑制受體基因CD163的表達）達到抑制病毒的效果。有關miR-4262的相關研究報道比較少，其功能還不十分明確。

本研究利用雙熒光素酶報告系統明確了miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262能靶向作用豬CD163基因的3′UTR，對豬CD163基因具有負向調控作用，可為進一步篩選抗PRRSV增殖miRNA奠定基礎。

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