貴州興義華西雨蛙的分子鑒定

熊榮川　李明　田應洲等

摘要：對采自貴州省興義市的華西雨蛙（Hyla gongshanensis）標本進行了線粒體16S rRNA基因擴增，并用雙重單系法分析構建了華西雨蛙各種群的系統發育樹。結果表明，該標本屬華西雨蛙，群內部分化為興義支系、云南曲靖支系和越南沙巴支系，而3個支系間相互聚類關系有待進一步深入研究。

關鍵詞：華西雨蛙（Hyla gongshanensis）；16S rRNA基因；克隆；分子鑒定

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4865-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.055

Abstract： The mitochondrial 16S rRNA of two Hyla gongshanensis samples from Xinyi city in Guizhou province was amplified and sequenced，the phylogenetic trees of various groups of H. gongshanensis was constructed using double monophyletic analyse. The results showed that this specimen was belonged to H. gongshanensis. H. gongshanensis recovered 3 lineages，including the Xinyi lineage， the Quqing lineage and the Sabah （Viet Nam） lineage， but the relationship among the three lineages was still unresolved.

Key words： Hyla gongshanensis； 16S rRNA gene； cloning； molecular identification

華西雨蛙（Hyla gongshanensis）隸屬于雨蛙科（Hylidae）雨蛙屬（Hyla），廣泛分布于中國四川、云南、貴州、湖南、廣西、廣東等地及印度和緬甸[1]。各地方種群間存在一定的形態差異，進一步將其分成5個亞種[2，3]，即指名亞種、川西亞種、景東亞種、騰沖亞種和武陵亞種。貴州省境內主要分布有景東亞種和武陵亞種兩個亞種，景東亞種主要分布于貴州省西部，武陵亞種主要分布于貴州省東北部。近年來，由于人為的農田耕作環境的改變以及農藥化肥的大量使用，種群數量大量減少，需要加強保護。

本研究利用華西雨蛙線粒體16S rRNA與其他華西雨蛙亞種同源基因進行相似性比較并構建系統發育樹，對華西雨蛙各地方種群間的系統發育關系進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

華西雨蛙標本于2014年6月23～25日采自貴州省興義市下五屯鎮，2個成體（標本號：LPSXY2014062308；LPSXY2014062501），保存于六盤水師范學院生命科學系標本館。

1.2 目的基因片段的擴增和序列測定

DNA模板的提取方法參照熊榮川等[4]的方法，擴增引物為1對兩棲動物通用的線粒體16S rRNA片段擴增引物P7/P8[5]，P7為上游引物：5-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3；P8為下游引物：5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3。PCR反應體系為：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，總DNA模板2 μL（含10～100 ng），上、下游引物各2 μL（10 μmol/L），ddH2O補至50 μL。 PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 系統發育分析

根據雙重單系法，對兩組16S rRNA基因數據進行系統發育分析。所測得的華西雨蛙16S rRNA基因序列經過Blast比對獲得100條初步的參考序列，與待定基因序列一起構成數據集A；經過雙重單系法的篩選，得到5條系統發育關系較近的16S rRNA序列并與待定基因序列一起構成數據集B（表1）。

對于數據集A，進行系統發育分析時不預先設定外群，構建無根系統發育樹。用MUSCLE[10]程序對序列進行比對，輔以人工校對。在jModelTest 2中篩選最適合該數據集序列演化模型以供最大似然法（Maximum likelihood，ML）分析。根據AIC標準，適合本數據集的模型為GTR+G+I，其中G=0.436，I= 0.487。使用FastTree[11]構建最大似然樹（ML tree）。ML樹支持率大于70%，表明該支系關系得到充分解決；在50%～70%之間為弱支持，否則視為未解決[12]。

對于數據集B，以中國雨蛙作為外群，用ClustalW[13]程序對序列進行比對，輔以人工校對。為了對待定基因的系統發育地位進行更準確判斷，對數據集B同時進行最大似然法分析和貝葉斯分析。在jModelTest 2中篩選最適合該數據集序列演化模型以供最大似然法分析。根據AIC標準，適合本數據集的模型為GTR+G，其中G=0.32。使用MEGA6.0[14]構建最大似然樹；以無根的鄰接樹為搜索起始樹，非參數自展抽樣次數設置為1 000。支持率大于70%，表明該支系關系得到充分解決；在50%～70%之間為弱支持，否則視為未解決[12]。

貝葉斯分析采用MrBayes 3.2[15]軟件，堿基替換模型設置為GTR+G+I。起始樹設為隨機樹，馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法設置為4條鏈同時運行1×106代，3條熱鏈1條冷鏈。每1 000代對系統樹進行抽樣，最終得到1 000棵系統發育樹。將前250棵樹舍棄后，根據剩余的樣本構建一致樹（Consensus tree），并計算相關參數。以后驗概率（Posterior probability，PP）來表示各分支的可信度（支持率），貝葉斯后驗概率大于等于95%說明其支系支持率得到充分解決[16]。endprint

1.4 遺傳距離的計算

選用MEGA6.0[14]分析數據集B中各序列間差異，依據Kimura2-parameter模型計算兩兩序列間的遺傳距離以及主要支系間的平均遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增及測序結果

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得600 bp左右的基因片段。經雙向測序并拼接，獲得長度分別為547 bp，核苷酸序列（GenBank登錄號：KP123603、KP123604），序列堿基組成存在明顯的偏向性：AT含量較高，GC含量較低。

2.2 系統發育分析結果

將所測得華西雨蛙16S rRNA基因序列進行搜索比對，其與GenBank中的已有華西雨蛙序列相似度最高，搜索得到的100條同源序列與KP123603、KP123604構成16S rRNA序列數據集A。基于數據集A構建的系統發育樹中（圖1），KP123603、KP123604與3條華西雨蛙同源序列聚為一個單系（華西雨蛙支系）。在其內部，KP123603、KP123604以較低的最大似然率獨立為一個支系（圖1），進一步與云南曲靖種群16S rRNA基因序列（KM271781）以及一未知序列（JQ621934）構成單系，而該單系與越南種群構成的華西雨蛙支系并沒有得到較高的最大似然支持率。

經過雙重單系法篩選得到5條近緣16S rRNA序列與KP123603、KP123604構成數據集B（表2），使用最大似然法及貝葉斯法構建系統進化樹（圖2）。結果表明，內群由3個支系構成，其中貴州興義為一個獨立支系且支持率較高，與云南曲靖支系互為姊妹群但是支持率并不高，另外越南沙巴種群獨立為一個支系。

2.3 遺傳距離

基于16S rRNA序列的遺傳距離（表2）表明，貴州興義華西雨蛙與越南種群的遺傳距離最近（0.004），內群各序列間的遺傳距離為0.008（0.000～0.012），內外群間遺傳距離為0.030（0.023～0.036）。

3 小結與討論

華西雨蛙因其各地方種群間存在一定形態差異而被學者劃分為5個不同的亞種[2，3]，即指名亞種、川西亞種、景東亞種、騰沖亞種和武陵亞種。隨著現代DNA測序技術以及生物信息學技術的發展，利用特定DNA片段對生物進行種類鑒定，已經成為深入認識生物種分類地位及種間親緣關系的一個重要手段，尤其是對于那些一直存在分類爭議的動物類群。本研究成功擴增了貴州興義華西雨蛙的線粒體16S rRNA基因，經過系統發育分析，其與華西雨蛙云南曲靖及越南沙巴的兩個種群聚為一個單系，因此應該屬于華西雨蛙。

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