Xpert MTB/RIF實驗在結核病診斷中的應用

劉慧梅 顏學兵

[摘要] 目的 評價利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術（Xpert MTB/RIF）實驗在結核病診斷中的檢驗效能。 方法 收集2014年10月～2015年5月徐州市傳染病醫院的237例可疑結核病患者進行結核菌檢測，將患者分為結核組和非結核組，其中結核組195例，非結核組42例。兩組患者均行Xpert MTB/RIF實驗、T-spot實驗、涂片鏡檢法、液體培養以及藥敏實驗，以臨床診斷為金標準，比較各項檢測的敏感性和特異性。 結果 以臨床診斷為金標準，Xpert MTB/RIF實驗檢測結核分枝桿菌敏感性為56.9%，T-spot實驗、痰涂片、液體培養敏感性依次為53.8%、26.7%、43.6%，Xpert MTB/RIF檢測敏感性明顯高于涂片鏡檢（χ2=36.691，P = 0.000）和液體培養（χ2=6.934，P = 0.008），但與T-spot實驗無差別（χ2=0.347，P = 0.541）。以傳統藥敏實驗結果作為金標準，Xpert MTB/RIF實驗檢測利福平耐藥的敏感性和特異性分別為88.9%和98.5%。 結論 Xpert MTB/RIF實驗較傳統的結核病實驗室診斷方法具有較好的敏感性和特異性，可作為結核病診斷的輔助手段。

[關鍵詞] 結核；利福平；利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術

[中圖分類號] R521 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）10（a）-0116-04

Application of Xpert MTB/RIF detection test in the diagnosis of tuberculosis

LIU Huimei1，2 YAN Xuebing3

1.Department of Medicine， Xuzhou Medical College， Jiangsu Province， Xuzhou 221000， China； 2.Department of Tuberculosis， Xuzhou Infectious Diseases Hospital， Jiangsu Province， Xuzhou 221000， China； 3.Department of Infectious Diseases， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College 221000， China

[Abstract] Objective To analyze the application value of Tuberculosis and rifampin resistance detection of Xpert MTB/RIF test. Methods From October 2014 to May 2015， 237 patients suspected tuberculosis in Xuzhou Infectious Diseases Hospital were selected， and they were divided into tuberculosis group （195 cases） and non-tuberculosis group（42 cases）. sputum samples of patients in two groups were collected to do liquid culture， smear， T-spot test， smear observed of lens and Xpert MTB/RIF test， clinical diagnosis was as the gold standard， sensitivity and specificity of every methods were ompared. Results The sensitivity of Xpert MTB/RIF， T-spot test， smear， liquid culture on testing Mycobacteria tuberculosis were 56.9%， 53.8%， 26.7%， 43.6% by clinical diagnosis as gold standard. The sensitivity of Xpert MTB/RIF was higher than smear （χ2=36.691，P = 0.000） and liquid culture （χ2=6.934， P = 0.008）， but there was no difference with T-spot test （χ2=0.347， P = 0.541）. According to the result of drug susceptibility test， the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF on testing rifampin resistance were 88.9% and 98.5%. Conclusion Comparing with traditional methods， Xpert MTB/RIF test has higher sensitivity and specificity and rifampin resistance. It can be applied as the auxiliary means for tuberculosis diagnosis.

[Key words] Tuberculosis； Rifampin； Xpert MTB/RIF

結核病的有效控制關鍵在于對結核患者的快速檢測及治療。傳統的實驗室診斷方法存在諸多不足，如抗酸菌涂片鏡檢方法操作簡便、快速、特異、經濟，但靈敏性較低[1-2]；固體培養法價格較低廉，敏感性較涂片鏡檢法高，但耗時達數周；液體培養法雖然可以提高敏感度、縮短報告時間，但經濟成本非常高[3-4]。因此尋找一種可以快速診斷結核病的實驗室方法顯得非常重要[5]。近年來，利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術（Xpert MTB/RIF）實驗逐漸受到國內外廣泛關注。該檢測方法國內臨床應用剛剛起步，缺乏對其診斷性能的報道。本研究旨在對Xpert MTB/RIF實驗與T-spot實驗等檢測方法在結核病診斷中的臨床價值進行對比研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年10月～2015年5月徐州市傳染病醫院結核科收治的237例患者，分為結核組和非結核組，分別為195例和42例，診斷均符合中華結核病診治指南診斷標準。結核組包括：肺結核組160例，男77例，女83例，年齡5～78歲；肺外結核組35例，男22例，女13例，年齡3～72歲，主要包括結核性腹膜炎10例、結核性腦膜炎3例、骨結核3例、淋巴結核6例、腸結核7例、腎結核3例、女性生殖系統結核3例。非結核組42例，主要是肺炎、肺癌等患者，男26例，女16例，年齡22～83歲。

1.2 方法

囑咐患者清晨嗽口后用力咳出深部濃痰，一式3份，一份用于結核分枝桿菌（MTB）培養，一份用于痰涂片檢查，一份用于XpertMTB/RIF檢測。標本收集的注意事項：①痰液標本收集以清晨為最佳，因為該時間段患者痰量多，含菌量多；②在醫生或護士指導下取樣，不得私自取樣；③囑咐患者漱口3遍以上，以除去淺表固有細菌。如果患者昏迷或無力咳嗽，不宜收集樣本，醫護人員應該協助患者采取合適體位，叩背以使痰液松動，再用吸痰器吸引，在吸痰器吸管中段搜集痰液，按吸痰法將痰液吸入集痰器內。

1.3 結核感染T細胞斑點（T-spot）、液體培養、Xpert MTB/RIF及藥敏實驗

T-spot實驗：采集肝素抗凝外周血5 mL，分離外周單個核細胞（PBMC）放入包被γ-INF抗體的微孔板，加入結核特異性抗原早期分泌靶向抗原（early secreting antigen target 6，ESAT-6）和培養濾過蛋白（culture filtrate protein 10，CFP-10）作為刺激原，溫箱培養24 h后，洗去抗原致敏效應T淋巴細胞，加入生物素標記的二抗，再經酶聯顯色，在細胞因子分泌的地方形成斑點，通過記錄斑點讀數檢測結核特異抗原致敏效應T淋巴細胞數量。結果判定：當空白對照孔內斑點數為0～5個時，任一實驗孔斑點數減去空白孔斑點數≥6個，結果為陽性；如果空白對照孔斑點數>6個時，任一實驗孔斑點數≥空白孔斑點數的2倍，結果同樣表明陽性結果；如果上述標準不符合且陽性質控對照孔正常時，檢測結果為陰性。

液體培養及藥敏試驗：在Ⅱ級生物安全操作柜中接種環刮取菌落，涂抹至羅氏培養基斜面，旋緊螺旋蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～20 s，制成均勻的菌液。靜置10 min后，用吸管接種約0.1 mL至中性羅氏培養及斜面上。傳代后的培養基放置在36℃培養，每周觀察菌落生長情況，于肉眼可見菌落出現后1～2周進行藥敏試驗。制備菌液：在磨菌瓶中加入1～2滴10%吐溫-80℃水溶液，用無菌吸管尖端刮取2～3周新鮮菌落，置于磨菌瓶中。旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～20 s。靜置5 min，小心打開瓶蓋，加入約2 mL滅菌生理鹽水，靜置片刻，使菌液中的大塊物質沉淀。用無菌吸管吸取上部的菌液，約1 mL，轉移到另一無菌試管中，與標準買時比濁管比濁。逐漸滴加滅菌生理鹽水，直至菌液濁與標準麥氏比濁管一致，即得到1 mg/mL的菌液。接種：在無菌帶有螺旋蓋的試管中以無菌手法加入2mL滅菌生理鹽水備用，每株待測菌準備2管。菌液靜置，帶顆粒或菌塊沉淀。用22 SWG標準接種環2滿環1 mg/mL的菌液，平移至2 mL滅菌生理鹽水中，即稀釋成1×10-2 mg/mL菌液。用同樣方法再進行100倍稀釋，即成1×10-4 mg/mL菌液。用22 SWG標準接種環分別取1滿環1×10-2 mg/mL和1×10-4 mg/mL的菌液，用劃線法均勻接種菌量為1×10-4 mg和1×10-6 mg。接種后的培養基直立放置于恒溫培養內，36℃培養，培養4周后報告結果。

標本符合以下特點可直接用于藥敏試驗：①出現肉眼可見菌落后1～2周的新鮮菌落；②沒有其他污染菌共存；③涂片確認為抗酸菌。

Xpert MTB/RIF實驗：以1：2的比例，往痰液標本中加入處理液，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標本充分液化。再將混合液轉移至反應盒中，將反應試劑盒放入Gene Xpert儀器（美國Cepheid公司生產）中，按說明書進行檢測，約2 h即可讀取結果。結果判斷：依照探針的循環閾值（Ct值），當內對照探針Ct值≤38時為陽性，反之則為無效，提示標本的DNA提取不合格或含有PCR抑制物。5個探針中至少2個探針Ct值≤38即為檢測到MTB，可進一步按照Ct值對MTB進行半定量。Ct值<16為高含量，Ct值為16～22為中等含量，Ct值為22～28為低含量，Ct值>28為極低含量。檢測利福平耐藥的基礎在于MTB特異性分子信標早期Ct值和晚期Ct值之差。即△Ct值。系統設置的結果判斷標準為△Ct>3.5提示對利福平耐藥，△Ct<3.5提示對利福平敏感。由于終止循環數為38個循環，因此當早期探針Ct值>34.5或晚期探針Ct值>38時，利福平耐藥結果為不確定。目前研究表明95%的利福平耐藥菌株在rpoB基因81 bp區域（RRDR）存在基因突變。

1.4 結果判定

1.4.1 痰涂片結果判定 按照中國防癆協會基礎專業委員會制訂的實驗室檢查規程進行[6-7]。①抗酸桿菌陰性（-）：連續觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌。②報告抗酸桿菌菌素：1～8條/300個視野。③抗酸桿菌陽性（+）：每100個視野發現3～9條抗酸桿菌。④抗酸桿菌陽性（++）：每10個視野發現1～9條抗酸桿菌。⑤抗酸桿菌陽性（+++）：每個視野發現1～9條抗酸桿菌。⑥抗酸桿菌陽性（++++）：每個視野發現平均10條抗酸桿菌。

1.4.2 藥敏結果判定 （-）：無菌落生長；報告實際菌落數：<50個菌落；（+）：50～100個菌落；（++）：100～200個菌落；（+++）：大部分融合（200～500個菌落）；（++++）：融合（>500個菌落）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。Kappa>0.4，表示兩種實驗檢驗一致性結果較好；Kappa<0.4，表示檢驗結果一致性較差。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Xpert MTB/RIF實驗與其他結核檢測方法的結果比較

結核組患者Xpert MTB/RIF實驗檢測敏感性顯著高于液體培養（χ2=36.691，P = 0.000）和痰涂片（χ2=6.934，P = 0.008），與T-spot比較差異無統計學意義（χ2=0.347，P = 0.541）。非結核組4種方法特異性均較高且差異無統計學意義（χ2=0.346、0.346、1.012， P = 0.557、0.557、0.314）。基于入組情況將患者分為肺結核、肺外結核進行分析，4種檢測方法均表明肺結核組結核分枝桿菌檢測敏感性（Xpert MTB/RIF、T-spot痰涂片、液體培養）明顯高于肺外結核組（χ2=8.915、5.880、7.142、7.457，P = 0.003、0.015、0.008、0.006）。見表1。

表1 結核敏感性及非結核特異性比較[n（%）]

注：與本組Xpert MIB/RIF比較，*P < 0.01；與肺結核組比較，△P < 0.05，△P < 0.05；敏感性（結核組）=結核組陽性例數/結核組總例數×100%；特異性（非結核組）=非結核組陰性例數/非結核組總例數×100%

2.2 Xpert MTB/RIF實驗與其他幾種檢測結果一致性的比較

Xpert MTB/RIF實驗與T-spot實驗檢出結果符合率為86.9%，一致性Kappa=0.737，一致性結果較好；Xpert MTB/RIF實驗與痰涂片檢出結果符合率為61.2%，一致性Kappa=0.200，一致性結果較差；Xpert MTB/RIF實驗與液體培養檢測結果符合率為78.5%，一致性Kappa=0.563，一致性結果較好。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF實驗與痰涂片和液體培養檢測結果一致性的比較（例，n=237）

2.3利福平耐藥檢測結果

在237例可疑結核患者中，液體培養陽性有85例，9例Xpert MTB/RIF實驗檢測失敗，共76例可進行利福平耐藥檢測效能分析。傳統比例法藥敏實驗檢測出耐藥菌9株，耐藥率為11.8%（9/76）。比例法耐藥的的患者標本中，XpertX系統檢測出8株為耐藥菌，敏感性為88.9%，比例法藥敏實驗檢測敏感菌67例中，有1例Xpert系統檢測出為耐藥菌，特異性為98.5%（66/67）。見表3。

表3 利福平耐藥檢測結果（例，n=76）

3 討論

我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，結核病患者數量約500萬例，居世界第二位，每年新增患者130萬，死亡病例約13萬例[8-11]。《2011年中國衛生統計年鑒》資料顯示，在甲乙類法定報告傳染病中，我國現階段結核病發病率為74.27/10萬，僅次于病毒性肝炎，位居第二，其死亡率為0.22/10萬，僅次于艾滋病，亦位居第二，而且發病人群以青壯年為主[12]。結核病的疫情控制與結核病的早期發現、合理規范治療、管理密切相關。盡管結核病的診斷水平有了很大提高，但傳統的結核病診斷方法依舊存在很多不足之處，嚴重影響結核病的診斷工作開展。Xpert MTB/RIF實驗是針對結核分枝桿菌rpoB基因利福平耐藥決定區設計引物、探針，檢測其是否發生突變[13-14]，2 h內即可診斷患者是否感染結核分枝桿菌以及耐藥性情況[15-16]。本次研究旨在比較Xpert MTB/RIF實驗與其他3種檢測方法檢測結核分枝桿菌的效能，并以藥敏實驗為金標準，分析其檢測利福平耐藥的應用價值。

本研究采用可疑結核患者血液、痰標本分別進行T-spot實驗、Xpert MTB/RIF實驗、涂片鏡檢、液體培養以及傳統比例法藥敏實驗檢測患者是否感染結核分枝桿菌及其對利福平耐藥情況。結果顯示，以臨床診斷為金標準，Xpert MTB/RIF實驗檢測結核分枝桿菌敏感性為56.9%，與國內趙冰等[17]研究結果基本一致。Xpert MTB/RIF實驗檢測結核分枝桿菌敏感性略高于T-spot實驗，明顯高于痰涂片鏡檢、液體培養。一致性檢驗結果表明，Xpert MTB/RIF實驗與液體培養、T-spot實驗檢測結果一致性較好。

研究表明將Xpert MTB/RIF實驗檢測利福平耐藥情況應用于耐藥高危人群（耐藥率>20%）中開展，檢測結果更具有價值[17]。以比例法藥敏實驗作為金標準，Xpert MTB/RIF實驗檢測利福平耐藥的敏感性為88.9%，特異性為98.5%，與既往的研究[18-19]結果基本一致。但敏感性低于Boehme等[20]研究結果。由于本次研究中76例培養陽性標本進行藥敏實驗，耐藥率僅為11.8%，目標人群利福平耐藥率較低，敏感性過低可能是由于利福平耐藥患者過少所致。因此世界衛生組織建議如果在利福平耐藥率較低人群中應用Xpert MTB/RIF檢測技術檢測利福平耐藥情況，檢測結果為耐藥，樣本仍需采用藥敏實驗進一步驗證Xpert檢測結果。

綜上所述，Xpert MTB/RIF實驗操作簡單、檢測快速、敏感性高并且對實驗室要求較低，因此可以很好的輔助臨床醫生及時診斷目標疾病，具有一定的使用前景。

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（收稿日期：2015-06-03 本文編輯：任 念）