Dermol與E—cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究

楊文婧　趙瑞力

[摘要] 目的 探討喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Dermol與E-cadherin的表達(dá)及其相關(guān)性。 方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測Dermol與E-cadherin在48例喉鱗癌組織及30例癌旁正常組織中的表達(dá)情況，分析它們在不同組織中的相互關(guān)系及與喉鱗癌臨床參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果 Dermol、E-cadherin在喉鱗癌及癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期情況的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Dermol、E-cadherin的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）；不同年齡的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Dermol、E-cadherin的陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。喉鱗狀細(xì)胞Dermol的陽性表達(dá)與E-cadherin的陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.344，P < 0.05）。 結(jié)論 Dermol與E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、分化程度、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中的起重要作用，Dermol與E-cadherin的協(xié)同作用可能影響喉鱗狀細(xì)胞癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 喉鱗狀細(xì)胞癌；Dermol；E-cadherin；免疫組化

[中圖分類號] R739.65 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（c）-0125-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significances of Dermol and E-cadherin in laryngeal squamous cell carcinoma （LSCC）. Methods The expression of Dermol and E-cadherin was detected by immunohistochemistry SP method in 48 tissues of LSCC and 30 tissues of tumor-adjacent normal. The relationship between two factors and clinical pathological features of LSCC was investigated. Results The differences of the positive rate of Dermol and E-cadherin in tissues of LSCC and tumor-adjacent normal were statistically significant （P < 0.01）； the positive expression rate of Dermol and E-cadherin in different status of lympha node metastasis， clinical stage in LSCC was statistical significant different （P < 0.01 or P < 0.05）； but no statistically significant difference between the different age groups （P > 0.05）. The positive expression of Dermol was negatively related to that of E-cadherin （r = -0.344， P < 0.05）. Conclusion Dermol and E-cadherin play an important role in the occurrence， degree of differentiation， infiltration and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma. The synergistic effect of Dermol and E-cadherin may have some effects on the infiltration and metastasis of laryngeal carcinoma.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma； Dermol； E-cadherin； Immunohistochemistry

喉癌是頭頸部腫瘤中最為常見的一種，其中又以喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）最為多見，喉鱗狀細(xì)胞癌具有較高的侵襲能力，發(fā)生局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的能力較高[1]。雖然喉癌在早期有很高的生存率，但是大多數(shù)患者確診時(shí)已到了晚期（Ⅲ-Ⅳ期），從而導(dǎo)致了不良的預(yù)后效果。盡管手術(shù)技術(shù)和放療技術(shù)得到明顯改善，但喉鱗狀細(xì)胞癌的療效仍不十分理想。探索與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤因子，對喉鱗狀細(xì)胞癌的的治療有著重要的臨床指導(dǎo)意義。Dermol也被稱為Twist2，屬于堿性Helix-loop-helix（b-HLH）蛋白家族的成員。目前的研究發(fā)現(xiàn)Dermol蛋白在不同的腫瘤中表達(dá)并不相同，它在發(fā)育和腫瘤發(fā)展過程中的作用及機(jī)制尚不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。為了進(jìn)一步探討Dermol與E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲過程中的作用及兩者的相關(guān)性，本研究采用免疫組化法檢測喉鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中Dermol與E-cadherin的表達(dá)情況并進(jìn)行相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年2月～2013年3月滄州市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）耳鼻喉科的喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本及其癌旁正常組織，其中48例喉鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織30例。癌旁組織均經(jīng)病理檢查明確為正常組織。所有喉癌患者術(shù)前都未行放、化療，臨床資料完整。年齡41～80歲，中位年齡60.2歲；高分化13例，中分化19例，低分化16例；Ⅰ、Ⅱ期（早期）18例，Ⅲ、Ⅳ期（晚期）30例；聲門上型17例，聲門型31例。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑 Dermol鼠單克隆抗體（Twist2C1a）：sc-81417 Santa Cruz Biotechnology，Inc）；E-cadherin鼠單克隆抗體（ZM-0094北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）；鼠二抗免疫組化試劑盒（SP-9002北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色液（ZLI-9032北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)S-P方法 所選標(biāo)本均制成石蠟標(biāo)本，4 μm連續(xù)切片，一抗所選濃度Dermol鼠單克隆抗體1∶100，E-catenin鼠抗人單克隆抗體為1∶50。采用免疫組化SP法，嚴(yán)格遵守操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對照，為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，喉癌旁正常組織為正常對照組。

1.3 結(jié)果判定

Dermol蛋白陽性著色位于細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)片狀或顆粒狀的棕褐色的胞質(zhì)或胞核細(xì)胞為陽性細(xì)胞。結(jié)果采用半定量記分法判定[2]，首先按陽性著色程度評分，再按陽性細(xì)胞所占比例評分，將兩者的乘積作為判定結(jié)果：4～12分為陽性，<4分為陰性，陽性表達(dá)為異質(zhì)表達(dá)。E-catenin染色定位于細(xì)胞膜，采用Mattern積分法[3]，將陽性細(xì)胞百分率評分和染色強(qiáng)度評分相乘：陽性指數(shù)>3為陽性，≤3為陰性。>10%細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)和/或核表達(dá)為異位表達(dá)，異位表達(dá)均陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不符合正態(tài)分布的改用中位數(shù)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Spearman等級相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dermol、E-cadherin在喉鱗癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

Dermol在喉鱗狀細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率為58.33%（28/48）高于癌旁正常組織黏膜的16.67%（5/30）；E-cadherin在喉鱗狀細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率為22.91%（11/48），低于癌旁正常組織黏膜的100.00%（30/30）（P < 0.01）。見圖1、2，表1。

2.2 喉鱗狀細(xì)胞癌中Dermol、E-cadherin表達(dá)與喉鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Dermol在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；E-cadherin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。Dermol在Ⅰ、Ⅱ期（早期）喉鱗癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于Ⅲ、Ⅳ期（晚期）者；E-cadherin在Ⅰ、Ⅱ期（早期）喉鱗癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期（晚期）者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。Dermol在不同病理分化程度的喉鱗癌組織中陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。E-cadherin在高分化鱗狀細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率較高，而在中低分化鱗狀細(xì)胞癌中未見表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05）。Dermol與E-cadherin在聲門上型喉癌中的陽性表達(dá)率與在聲門型喉癌比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。不同年齡喉鱗癌患者喉鱗癌組織中Dermol與E-cadherin陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 Dermol與E-cadherin在喉鱗癌中的相關(guān)性

在48例喉癌中，3例癌組織中Dermol、E-cadherin均呈陽性表達(dá)，12例癌組織中Dermol、E-cadherin均呈陰性表達(dá)。Dermol表達(dá)陽性但E-cadherin表達(dá)陰性的喉癌組織有25例；E-cadherin表達(dá)陽性但Dermol表達(dá)陰性的喉癌有8例。經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.344，P < 0.05）。

3 討論

Dermol是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，屬于螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族，在不同的種屬之間其核苷酸和氨基酸序列高度保守。Dermol是在使用E12作為引物的一種雙酵母雜交體中首次被發(fā)現(xiàn)，由于它的表達(dá)模式是在老鼠胚胎的dermis（真皮）組織中，所以被稱為Dermol[4]。后來由于Dermol與Twist1的高度同源和表達(dá)模式的重疊性被命名為Twist2。目前大量的研究已經(jīng)證實(shí)，Twist1可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。Dermol可能與Twist1相似誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn)Dermol異常表達(dá)與腫瘤有著密切關(guān)系，Dermol與乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、甲狀腺癌及肝癌的表達(dá)在國內(nèi)外有相關(guān)報(bào)道[5-12]，但其在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義卻鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果表明：Dermol蛋白表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕褐色。48例喉鱗癌組織中陽性表達(dá)率（58.33%）明顯高于30例癌旁正常組織中陽性表達(dá)率（16.67%）（P < 0.01）。在喉鱗癌組織中Dermol蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)（P < 0.05或P < 0.01），而與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型及年齡無關(guān)（P > 0.05）。由此可見，Dermol在喉鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床分期具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推斷Dermol高表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌組織具有更強(qiáng)的侵襲能力，Dermol可能成為判斷喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)防或預(yù)后的檢測指標(biāo)之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，在口腔/咽部癌癥患者中，Dermol與較高的腫瘤分級和較短的生存率有關(guān)，Dermol通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞凋亡來助于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的侵襲[13]。

E-catenin是Wnt信號傳導(dǎo)通路中重要的調(diào)控一員[14]，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中E-catenin遇到啟動(dòng)子區(qū)域甲基化、轉(zhuǎn)錄抑制或基因突變時(shí)，其結(jié)構(gòu)功能便會(huì)出現(xiàn)異常，細(xì)胞的黏附功能出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。在甲狀腺癌[16]、食道癌[17]、胃癌[18]及喉癌[19]中均發(fā)現(xiàn)E-catenin表達(dá)下調(diào)，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有一定相關(guān)性。國外曾有研究發(fā)現(xiàn)[20]，E-catenin在頭頸部鱗癌中表達(dá)下調(diào)，并與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的血管侵襲性和患者生存率相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，癌旁正常組織中E-catenin表達(dá)陽性染色定位于細(xì)胞膜，而喉鱗狀細(xì)胞癌組織中E-catenin表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中。喉鱗狀細(xì)胞癌中E-catenin陽性表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，喉鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移、侵襲能力越高，E-catenin的陽性表達(dá)率越低，也同樣證實(shí)了E-catenin與喉鱗狀細(xì)胞癌的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)。

喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。通過對EMT機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Dermol形成Twist1/Twist2/Mi2/NuRD蛋白復(fù)合物，其與E-box的啟動(dòng)子結(jié)合，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，導(dǎo)致了EMT的發(fā)生，這同樣可能是喉鱗狀細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的途徑之一。本研究結(jié)果同時(shí)顯示：Dermol的表達(dá)率越高，E-catenin的表達(dá)率越低，喉鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，Dermol蛋白表達(dá)與E-catenin的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r = -0.344，P = 0.034）。由此可推測：Dermol的過度表達(dá)可能引起了E-cadherin表達(dá)的下調(diào)，兩者協(xié)同促進(jìn)了EMT的發(fā)生，導(dǎo)致了喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和侵襲。同時(shí)檢測喉鱗狀細(xì)胞癌中Dermol和E-catenin的表達(dá)可能有助于對腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)性的分級。此次研究尚未涉及喉鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后及5年生存率，Dermol在喉鱗狀細(xì)胞癌中的調(diào)控機(jī)制及與患者預(yù)后及生存率的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2015-04-24 本文編輯：任 念）