副豬嗜血桿菌反應調節因子CpxR自殺性質粒的構建

付書林　陳夏冰　何斌等

摘要：以副豬嗜血桿菌雙組分信號轉導系統CpxA/R中反應調節因子CpxR為研究對象，成功構建自殺性質粒ΔpEM-CpxR，這就為構建副豬嗜血桿菌CpxR突變株以及探究CpxA/CpxR雙組分信號轉導系統調控副豬嗜血桿菌分子致病機制提供了基礎。

關鍵詞：副豬嗜血桿菌；反應調節因子；CpxR；自殺性質粒

中圖分類號：S852.61+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4787-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.033

Abstract：Haemophilus parasuis （H. parasuis）， the causative agent of swine polyserositis， polyarthritis， and meningitis， is one of the most important bacterial diseases of pigs worldwide. The response regulator CpxR of two-Component Transduction System CpxA/R of H. parasuis was studied and the suicide plasmid ΔpEM-CpxR was successfully constructed， which providing the basis of constructing CpxR gene deletion mutant and exploring the TCS of CpxA/CpxR regulating the molecular pathogenesis of H. parasuis.

Key words： Haemophilus parasuis； response regulator； CpxR； suicide plasmid

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， HPS）引起豬的革拉氏疾病，臨床特征以多發性漿膜炎、關節炎、腦膜炎為主要特征。隨著規模化養豬技術的應用和飼養高度密集化，由副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病已經成為當前豬場最重要的細菌性傳染病之一，給世界養豬業帶來巨大的經濟損失[1]。雙組分信號轉導系統（Two-component transduction system， TCS）是細菌中廣泛存在的信號轉導機制，在病原菌中起著“神經系統”作用。經典的雙組分模式是由膜上的組氨酸激酶（Histine kinase， HK）和胞質上的反應調節因子（Response regulator， RR）組成[2]。應用序列相似性比較及功能域分析，表明在HPS-SH0165全基因組序列中存在CpxA/CpxR雙組分信號轉導系統。本試驗成功構建HPS反應調節因子CpxR自殺性質粒，為構建CpxR基因缺失突變株提供前期基礎，同時也為探究CpxA/CpxR雙組分信號轉導系統調控副豬嗜血桿菌分子致病機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 各種限制性內切酶、Ex Taq/LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、RNase酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、氯霉素（Chloramphenicol， Cm）均購自美國英駿公司。DNA回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉湯（Tryptic SoyBroth，TSB）粉劑購自美國Becton Dickinson and Company公司。

1.1.2 菌株與質粒 副豬嗜血桿菌血清5型SH0165菌株和自殺性質粒pEMOC2由華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 SH0165菌株中CpxR基因上下游同源臂的擴增與鑒定 參照已測序HPS血清5型SH0165菌株基因組序列，設計Cpx1、Cpx2、Cpx3、Cpx4兩對引物，擴增CpxR基因的上下游同源臂。以SH0165菌株為模板進行擴增，對PCR產物進行檢測、回收，連接到pMD-18T載體上，并轉化DH5α菌株，提取質粒并進行酶切鑒定。

1.2.2 重組轉移質粒pEM-CpxR的構建 將測序正確的T-P1用限制酶XbaI、SalI從pMD18-T載體切下，連接到經相同酶酶切的重組轉移質粒pEMOC2上，然后轉換提取重組質粒pEM-P1，再將測序正確的T-P2用NotI、XbaI從pMD18-T載體切下，連接到經相同酶酶切的重組轉移質粒pEM-P1上去，轉化提取質粒鑒定正確，得到重組轉移質粒pEM-CpxR。

2 結果與分析

2.1 雙組分調控系統CpxA/R基因結構分析

由圖1可知，HPS血清5型菌株SH0165測序結果顯示，CpxA、CpxR兩個基因轉錄方向一致，基因相靠近，進化比較保守。

2.2 CpxR基因上下游同源臂的擴增

以SH0165菌株基因組為模板擴增CpxR基因的上、下游同源臂，分別為1 030、998 bp。與預期結果大小相同。回收純化并將目的片段連接到pMD-18T載體上，送上海生工有限公司測序。測序結果表明與公布序列相比相似性為100%（圖2、圖3）。

2.3 重組轉移自殺性質粒pEM-CpxR的構建與鑒定

將測序正確的CpxR基因下游同源臂與自殺性質粒pEMOC2載體用NotI/XbaI雙酶切，回收下游同源臂和pEMOC2載體，用T4連接酶進行過夜連接，構建重組轉移質粒pEM-P2，并轉化DH5α菌株，提取質粒用NotI/XbaI雙酶切進行鑒定，顯示998 bp左右的目的片段，與下游同源臂相符合，結果表明質粒pEM-P2構建成功（圖4）。

然后，再將測序正確CpxR基因上游同源臂與質粒pEM-P2用SalI/XbaI酶進行雙酶切，回收純化上游同源臂和pEMOC2載體，并用T4連接酶進行過夜連接，構建重組轉移質粒pEM-CpxR。并轉化DH5α菌株，提取質粒，經NotI/SalI雙酶切鑒定，與目的片段2 028 bp大小相一致的片段，結果表明，重組自殺性質粒pEM-CpxR構建成功（圖5）。

3 討論

CpxA/CpxR雙組分信號轉導系統屬于OmpR家族，可以通過感應細菌外膜的壓力，參與細胞膜蛋白質的折疊以及蛋白質的降解[3]。在杜克雷嗜血桿菌研究中發現，它能夠控制毒力相關因子lspB-lspA2、flp、dsrA的表達[4]，CpxA的磷酸化使杜克雷嗜血桿菌的毒力相關因子上調表達[5]。在致病性大腸桿菌和志賀菌屬中，CpxA/CpxR能夠決定毒力相關因子的表達[6]。Hung等[7]通過構建CpxR突變株，表明CpxA/CpxR能夠影響大腸桿菌P菌毛的合成，在缺少葡萄糖培養基中，CpxA-P可以作用于毒力相關因子pap基因的上游從而使該基因上調表達。病原微生物在侵入宿主引起發病過程中，能夠通過CpxA/CpxR雙組分信號轉導系統感受體內外各種信號的變化，繼而調節相關基因進行反應以完成其致病過程。因此，CpxA/CpxR雙組分信號轉導系統在病原菌致病過程中起著重要作用。

本研究在前期工作基礎上，擬構建副豬嗜血桿菌雙組分信號轉導系統CpxA/CpxR兩個單基因CpxA、CpxR突變株，詳細研究雙組分信號轉導系統CpxA/CpxR調控副豬嗜血桿菌致病性的機理。探究副豬嗜血桿菌CpxA/CpxR雙組分信號轉導系統調控致病性的分子機制研究，一方面可以詮釋關鍵生命活動的調控機理，另一方面還可以闡明副豬嗜血桿菌的分子致病機制，為開發副豬嗜血桿菌新型分子疫苗和藥物提供基礎。

參考文獻：

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[2] CASINO P， MIGUEL-ROMERO L， MARINA A. Visualizing autophosphorylation in histidine kinases[J]. Nat Commun， 2014， 5：3645.

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[7] HUNG D L， RAIVIO T L， JONES C H，et al. Cpx signaling pathway monitors biogenesis and affects assembly and expression of P pili[J]. EMBO J，2001，20（7）：1508-1518.