葡萄多酚對(duì)果蠅壽命影響和小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的研究

張愛軍 臧家業(yè)

（國(guó)家海洋局第一海洋研究所，山東青島 266061）

葡萄多酚對(duì)果蠅壽命影響和小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的研究

張愛軍 臧家業(yè)

（國(guó)家海洋局第一海洋研究所，山東青島 266061）

目的，研究葡萄多酚對(duì)果蠅壽命的影響以及降低小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的作用。方法 用葡萄多酚樣品喂食果蠅，以高、中、低三種劑量的原花青素喂食小鼠45d，對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果，果蠅生存試驗(yàn)陽性。0.015%和0.045%的原花青素對(duì)雄性和雌性果蠅的最高壽命和平均壽命與對(duì)照比較均有顯著延長(zhǎng)作用（P＜0.01）。0.002%和0.005%的原花青素劑量組與對(duì)照組比較最高壽命和平均壽命均無顯著差別（P＞0.05）。對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量組與老齡對(duì)照組比較， MDA含量明顯降低，血清SOD活力明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論，表明該物質(zhì)對(duì)果蠅的最高壽命和平均壽命都有明顯延長(zhǎng)作用，對(duì)小鼠具有降低脂質(zhì)過氧化作用。

葡萄多酚 果蠅 壽命 脂質(zhì) 過氧化作用

葡萄多酚（Grape Proanthocyanidins， GPC）是從葡萄籽中提取的多酚類化合物［1］。主要含低聚原花青素（O l i g o m e r i c Proanthocyanidins），原花青素?fù)碛袕?qiáng)有力的抗氧化能力，在體內(nèi)其抗氧化、清除自由基能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍［2］。國(guó)外關(guān)于原花青素的功能研究較多，在日本厚生省已于1996年批準(zhǔn)把葡萄多酚列入《天然食品劑名單中》［3，4］。近幾年，國(guó)內(nèi)葡萄多酚的研究也逐步熱起來，將葡萄多酚開發(fā)成為保健品或藥品，必需進(jìn)行相關(guān)的生物安全性分析評(píng)價(jià)。因此，本文開展了葡萄多酚毒理學(xué)研究，為葡萄多酚開發(fā)應(yīng)用保健品或藥品提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

（1）樣品，紅棕色粉劑（水分4.4%，灰分1.3%，原花青素93.62 %），青島海隆達(dá)生化科技有限公司。原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，sigma公司提供。（2）試驗(yàn)動(dòng)物，黑腹果蠅，OreganK品系，山東師范大學(xué)生物系；健康二級(jí)昆明種雄性15月齡老齡鼠和8周少齡小鼠，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。（3）劑量選擇，以果蠅為研究動(dòng)物的劑量選擇：設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組和4個(gè)劑量組，各劑量組含原花青素分別為0.002%、0.005%、0.015 %、0.045%。以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物的劑量選擇：原花青素成人推薦量為120mg/kg·b.w（成年人體重按60kg計(jì)算）。分別擴(kuò)大3、10和30倍作為低（360 mg/kg·b.w）、中（1200 mg/kg·b.w）和高劑量（3600 mg/ kg·b.w）老齡鼠實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)老齡對(duì)照組和少齡對(duì)照組，每組動(dòng)物10只。用蒸餾水將樣品配制所需濃度，連續(xù)經(jīng)口灌胃45d，對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。（4）主要儀器和試劑，生化培養(yǎng)箱（25±0.5℃，濕度60%～65%）、培養(yǎng)指管、乙醚、丙酸；960-熒光分光光度計(jì)、722分光光度計(jì)、離心機(jī)、混旋器、微量加樣器、恒溫水浴鍋；6.7g/L硫代巴比妥酸TBA－冰醋酸（1：1）混合液、10nmol/ml四乙氧基丙烷、100g/L磷鎢酸、10mmol/L鹽酸羥胺、7.5mmol/L黃嘌呤、0.023u/ml黃嘌呤氧化酶、10g/L甲萘胺、3.3g/L對(duì)氨基苯磺酸、3g/L磺基水楊酸、SOD標(biāo)準(zhǔn)品等。

表1　原花青素對(duì)果蠅生存時(shí)間的影響

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1葡萄多酚對(duì)果蠅壽命影響的研究方法

（1）果蠅飼料配制，用玉米粉、白糖、瓊脂、丙酸、干酵母粉分別以8.5%、6.5%、1.0%、0.5%、0.75%的比例用蒸餾水配制成基礎(chǔ)飼料。按劑量分組要求，稱取原花青素加入到溶化的基礎(chǔ)飼料中，充分調(diào)勻，配制成試驗(yàn)飼料。調(diào)pH值使各組一致。（2）擴(kuò)增果蠅，在裝有基礎(chǔ)飼料的指管中放入雌雄各半20只果蠅，25℃恒溫箱內(nèi)飼養(yǎng)。（3）分組試驗(yàn)，從上述指管中每日定時(shí)挑選8h內(nèi)孵出的成蟲，乙醚麻醉后稱體重，分組，每管20只，雌雄分養(yǎng)，每組雌雄各200只。在成蟲期空白對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組給予含不同劑量受試物的試驗(yàn)飼料。每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅存活數(shù)、死亡數(shù)，直到全部死亡。每組最后死亡的20只果蠅成蟲存活天數(shù)的平均數(shù)，為該組的最高壽命。每組全部果蠅成蟲存活天數(shù)的平均數(shù)，為該組的平均壽命。試驗(yàn)結(jié)束，計(jì)算平均壽命，最高壽命及半數(shù)死亡時(shí)間。

1.2.2葡萄多酚小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的研究方法

（1）全血中過氧化脂質(zhì)降解物丙二醛（MDA）含量測(cè)定。

樣品制備：取全血50ul加入1ml生理鹽水，2000r/min離心10min，取上清液待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將10nmol/ml四乙氧基丙烷，用蒸餾水稀釋成0.25、0.5、1、1.5、2和5nmol/ml，分別取1ml加入TBA－冰醋酸（1：1）混合液1ml，混勻，沸水浴75min，流水冷卻至室溫，加5ml正丁醇振蕩提取2min，3000r/min離心10min，取上清液（正丁醇層）用熒光光度計(jì)測(cè)熒光強(qiáng)度（狹縫10nm，激發(fā)光波廠515nm，發(fā)射光波長(zhǎng)553nm）。

全血樣品測(cè)定：全血樣品上清液0.5ml，加入1/6mol/L硫酸4ml、100g/L磷鎢酸0.5ml搖勻，室溫放置5min，3000r/min離心10min，棄上清液，沉淀加1/6mol/L硫酸2ml、100g/L磷鎢酸0.3ml搖勻，室溫放置5min， 3000r/min離心10min，棄上清液，沉淀加1ml蒸餾水振搖2min，以下操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)以濃度0.5 nmol/ ml的四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

全血MDA含量計(jì)算：MDA含量（nmol/ml）=0.5×f/F×1/ 0.05×1.05/0.5

式中F：0.5nmol/ml四乙氧基丙烷熒光強(qiáng)度；

旅游管理專業(yè)學(xué)生綜合素質(zhì)課程開設(shè)充分考慮了學(xué)生的專業(yè)性質(zhì)和能力需要，提升了學(xué)生的人文素養(yǎng)和人文品格。開設(shè)了中國(guó)傳統(tǒng)文化、經(jīng)典古詩文賞析、文學(xué)欣賞等選修課；為了提高旅游管理專業(yè)學(xué)生的基本能力和職業(yè)素質(zhì)，開設(shè)了演講與口才、溝通與禮儀、辦公自動(dòng)化等課程，著重培養(yǎng)學(xué)生可持續(xù)發(fā)展的能力、職業(yè)道德、人際交往能力、藝術(shù)鑒賞能力、團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力等。

f：樣品熒光強(qiáng)度。

（2）血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定（羥胺法）。

血清樣品制備：取全血50ul，制備血清待測(cè)。

血清中SOD活力測(cè)定：依次取1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.8）1.0ml，血清樣品20ul，10mmol/L鹽酸羥胺0.1ml，7.5mmol/L黃嘌呤0.1ml，0.023u/ml黃嘌呤氧化酶0.1ml，雙蒸水0.5ml加入到試管內(nèi)混勻，37℃恒溫水浴30min，再加入3.3g/L對(duì)氨基磺酸2.0ml，10g/L甲萘胺2.0ml，混勻，常溫放置15min，倒入1cm光徑比色杯，以蒸餾水調(diào)零，530nm處比色測(cè)定OD值，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照測(cè)定。

SOD活力的計(jì)算：按以下公式計(jì)算SOD百分抑制率：SOD百分抑制率=（對(duì)照管OD－測(cè)定管OD）/對(duì)照管OD×100%按每ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)單位，按以下公式計(jì)算SOD的活力：

SOD活力（u/ml）=SOD百分抑制率/50%×樣品稀釋倍數(shù)（3）統(tǒng)計(jì)處理：采用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果

2.1原花青素對(duì)果蠅壽命影響的結(jié)果

2.2原花青素對(duì)小鼠全血中過氧化脂質(zhì)降解物丙二醛（MDA）含量的影響

表1顯示，經(jīng)口給予老齡小鼠原花青素45d，老齡對(duì)照組MDA236.5 ±38.9nmol/ml，少齡對(duì)照組MDA167.6±37.4nmol/ml，低劑量組MDA233.9±33.4nmol/ml，中劑量組MDA223.4±42.8nmol/ml，高劑量組MDA189.0±37.4*nmol/ml。（注：* P＜0.05，高劑量實(shí)驗(yàn)組與老齡對(duì)照組比較）

高劑量組與老齡對(duì)照組比較，全血MDA含量明顯降低（P＜0.05），低劑量組和中劑量與老齡對(duì)照組比較，全血MDA含量差異無顯著性。

注：* P＜0.05，高劑量實(shí)驗(yàn)組與老齡對(duì)照組比較

2.3原花青素對(duì)老齡小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響

結(jié)果顯示，老齡對(duì)照組SOD208.1±8.2u/ml，少齡對(duì)照組279.2±14.9u/ml，低劑量組215.4±11.2u/ml，中劑量組225.1 ±18.0u/ml，高劑量組247.6±22.6*u/m。（注：* P＜0.05，高劑量實(shí)驗(yàn)組與老齡對(duì)照組比較）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)口給予老齡小鼠原花青素45d，高劑量組與老齡對(duì)照組比較，血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力明顯增高（P＜0.05），低劑量組和中劑量與老齡對(duì)照組比較，血清中SOD活力差異無顯著性。

3　結(jié)語

（1）用不同濃度的原花青素飼喂黑腹果蠅，研究原花青素對(duì)果蠅壽命的影響。結(jié)果表明，0.015%和0.045%的劑量組和對(duì)照組比較，果蠅的最高壽命和平均壽命都有明顯延長(zhǎng)，生存試驗(yàn)陽性。然而，0.002 %和0.005%的原花青素劑量組與對(duì)照組比較最高壽命和平均壽命均無顯著差別，說明該物質(zhì)只有達(dá)到一定含量才能起到延長(zhǎng)壽命的作用。

（2）經(jīng)口給予小鼠原花青素45天，高劑量組與老齡對(duì)照組比較，MDA含量明顯降低，血清SOD活力明顯升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原花青素有降低脂質(zhì)過氧化作用。

（3）原花青素之所以能夠延長(zhǎng)壽命，可能與其擁有強(qiáng)有力的抗氧化能力有關(guān)［5］。研究表明，原花青素在體內(nèi)其抗氧化、清除自由基能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍［6］。原花青素制品在歐美等西方國(guó)家市場(chǎng)非常走俏，一瓶60粒膠囊（每粒含原花青素50毫克）售價(jià)為23.95美元，而每粒含100毫克的原花青素一瓶售價(jià)為39.95美元，原花青素在保健品中市場(chǎng)零售價(jià)高達(dá)4.48萬元/千克。我國(guó)目前未有以原花青素為主要有效成份的藥品、保健品的開發(fā)才剛剛開始，目前的用量很少。但由于其明顯的生物活性效應(yīng)和使用效果，必將在食品添加劑，保健品，化妝品，藥品等方面得到廣泛的應(yīng)用，需求逐漸增加，具有相當(dāng)強(qiáng)勁的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)效益。

［1］王傳現(xiàn)，鐘進(jìn)義.葡多酚對(duì)活性氧自由基的清除作用研究.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，23（2）：170-173.

［2］鐘進(jìn)義，栗世如.葡多酚對(duì)小鼠DNA與染色體放射性損傷的防護(hù)作用［J］.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，1999，17：211-213.

［3］ Ricardo-Da-Silva LM， Rigaud J， Cheynier V， et al. Procyanidin dimmers and trimers from grape seeds［J］. Phytochemistry，1991，30（4）：1259-1264.

［4］Kanner J， Frankel E， Granio R， et al. Natural antioxidants in grapes and wines ［J］. J Agric FoodChem， 1994，42：64-68.

［5］王傳現(xiàn)，鐘進(jìn)義.葡多酚對(duì)活性氧自由基的清除作用研究.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，23（2）：170-173.

［6］中國(guó)制藥信息.1998，4.