八寶粥軟罐頭中一種致腐微生物的分離鑒定

何義，朱景松，姜旋，苑寧，張偉

（河北農業大學，河北保定071000）

八寶粥軟罐頭中一種致腐微生物的分離鑒定

何義，朱景松，姜旋，苑寧，張偉*

（河北農業大學，河北保定071000）

從脹袋的八寶粥軟罐頭中分離出一株致腐細菌zjs001，對其進行形態觀察、革蘭氏染色和API 20E生化鑒定，同時提取其基因組DNA，進行16SrDNA PCR擴增，對擴增產物進行測序，與NCBI中已知序列進行比對，以確定其種屬，研究結果表明，引起八寶粥脹袋的腐敗菌為陰溝腸桿菌。

八寶粥；軟罐頭；致腐菌；鑒定

八寶粥是中國傳統食品，歷史悠久，銷量大且廣泛。八寶粥由糯米、香米、蓮子、大棗、花生、紅豆、綠豆、銀耳、白糖等多種原料制成［1］，具有健脾益胃、清熱潤肺、安神補腎的作用，并且含有豐富的營養素，易于消化吸收，深受廣大消費者的喜愛。

八寶粥軟罐頭采用了新型的包裝形式［2］，由蒸煮袋［3］等包裝材料代替了以往的易拉罐，具有成本低、攜帶方便、營養損失少等優點［4］。但由于包裝材料、殺菌技術及經驗不足，導致八寶粥軟罐頭穩定性較差，在貯存過程中易被微生物污染，大大降低了產品的保質期［5-9］。目前，關于八寶粥的研究多集中于配方和工藝的優化［10］，八寶粥致腐微生物的研究鮮有報道。為此，本試驗以脹袋后的八寶粥軟罐頭為研究對象，對其中的腐敗菌進行了分離鑒定，確定了腐敗菌的分類，為八寶粥軟罐頭的安全生產、品質控制、防腐保鮮提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料、試劑

材料：腐敗變質的八寶粥軟罐頭。

試劑：革蘭氏染色液：杭州百思生物技術有限公司；引物合成：華大基因；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×擴增緩沖液（含Mg2+）、膠回收試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；API試劑條：法國梅里埃公司。

培養基：YEPD瓊脂、營養瓊脂、營養肉湯、LB肉湯。

1.2方法

1.2.1保溫試驗和密封試驗

將廠家隨機抽取的100袋八寶粥樣品放在37℃的溫箱中培養7 d，觀察是否有脹袋現象。將脹袋的粥樣放入水浴鍋內，然后慢慢升高水的溫度至90℃左右，觀察此過程中是否有連續氣泡冒出，如果沒有，表明袋密封完好。

1.2.2腐敗菌的分離、純化

采用無菌操作方法取脹袋的粥樣20g放入錐形瓶中混合，加入20mL的無菌蒸餾水，此即含菌的原液，然后采用梯度稀釋的方法，取0.1 mL菌懸液分別涂布于營養瓊脂和YEPD平板，分別在36℃和28℃培養。然后挑取單菌落純化3次，鏡檢，按菌落形態和鏡檢結果進行分離純化，分別采用斜面保藏和液體石蠟密封保存。

1.2.3菌種的生化鑒定

1.2.3.1菌體形態鑒定

挑取試管斜面保存的菌種，稀釋到10～8，涂布于營養瓊脂平板上，37℃培養24 h～48 h，觀察菌落特征，挑取單個菌落進行革蘭氏染色及鏡檢。

1.2.3.2API細菌生化鑒定

通過革蘭氏染色和氧化酶試驗結果確定采用API試紙條的類型，測定操作與結果判斷按API法要求進行。根據生化反應結果進行編碼，從API 20E V3.2數據庫中查找此編碼可鑒定菌種。

1.2.416SrDNA分子生物學鑒定

1.2.4.1引物的設計與合成

根據文獻報道，設計16SrDNA通用引物：上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’；下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。送華大基因合成。

1.2.4.2基因組DNA的提取

采用熱裂解法提取分離菌株的基因組DNA，并經過電泳檢測確認。

1.2.4.316SrDNA序列PCR擴增

PCR反應體系和PCR程序如表1和表2所示。

表1　PCR反應體系Table 1The PCR reaction system

表2　PCR程序Table 2The PCR program

1.2.4.4電泳檢測

PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNAMarker為DL2000，凝膠成像觀察拍照。

1.2.4.5PCR擴增產物回收及序列測定

PCR擴增產物經電泳確認后，用試劑盒回收DNA條帶，送華大基因測序。根據測序得到的基因序列在NCBI上進行Blast比對，查找同源性大于或等于99%的菌種，用MEGA4軟件進行多序列同源性分析，構建系統發育樹。

2結果與分析

2.1保溫試驗和密封試驗

100袋八寶粥樣品在保溫試驗中只有一袋出現了膨脹現象。氣密性檢測顯示各袋密封性良好，未出現漏袋現象。粥樣簡單染色鏡檢結果：大量短桿狀細菌，單個或成對排列，未發現酵母菌和真菌。結果如表3所示。

表3　結果報告單Table 3The results report

2.2腐敗菌的分離、純化

按“1.2.2”方法從營養瓊脂平板上篩選出1株腐敗細菌，YEPD平板上未發現酵母菌和真菌。將這株細菌在營養瓊脂平板上反復純化培養后，斜面保存備用。2.3菌種的生化鑒定

2.3.1菌體形態鑒定

腐敗菌的菌落及菌體形態見圖1。

圖1　腐敗菌的菌落形態和菌體形態Fig.1Colony Morphology and Microscopic Morphology

菌落形態（如圖1中a所示）：圓形，有凸起，邊緣整齊，大而濕潤，黏稠，乳白色，不透明。

鏡檢菌體形態（如圖1中b所示）：革蘭氏染色為陰性（紅色），粗短桿菌，單個或成對排列，無芽孢。

2.3.2API細菌生化鑒定

通過革蘭氏染色和氧化酶試驗結果（陰性）確定采用API試紙條的類型為API20E。觀察API20E試劑條顏色反應，進行結果判斷，如表4所示。

表4　API結果表Table 4Result of API

根據生化反應結果進行編碼，形成一個7位數字數碼：3305563，從API 20E V3.2數據庫中查找此編碼，初步鑒定為陰溝腸桿菌，%ID為96.4≥90.0，T值為0.38≥0.25，為好的鑒定結果。

2.3.316SrDNA分子生物學鑒定

16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16SrR NA）的基因，長度約為1 500 bp，是細菌分類學研究中最常用、最有用的“分子化石”。將本菌株命名為zjs001，16SrDNA目的基因片段PCR擴增結果如圖2所示。

圖2　菌液PCR產物電泳圖Fig.2Electrophoresis for bacterium fluid PCR products

電泳驗證結果在1 500 bp左右處出現了亮色條帶，由此可以判斷擴增產物是菌株zjs001的16S rDNA。切膠后用膠回收試劑盒回收目的DNA，經測序后，菌株zjs001的16SrDNA全序列堿基長度為1 384 bp。在NCBI上進行Blast比對，選擇同源性高的菌株（≥99%）用MEGA4軟件進行多序列同源性分析，zjs001與Enterobacter cloacae（陰溝腸桿菌）JQ308592的同源性最高，為99.4%，與API細菌鑒定系統鑒定結果相符，可鑒定為陰溝腸桿菌。用MEGA4軟件進行多序列同源性分析，構建系統發育樹（如圖3所示），但系統發育進化樹顯示zjs001獨立為一小分支，也有為一新種或亞種的可能性，還有待進一步研究。

圖3　菌株zjs001的16SrDNA序列的系統發育進化樹Fig.3Phylogenetic tree based on the 16SrDNA seguences of strain zjs001

3討論與結論

八寶粥由8種糧谷物組成，每種都有其特定的微生物滋生，所以引起八寶粥食品腐敗的微生物種類繁多，其豐富的營養，為微生物的繁殖提供了條件和良好的生長環境。據前人研究知，細菌、霉菌、酵母等都可以引起八寶粥食品的腐敗。霉菌、酵母菌對高溫的抵抗力差，一般的高溫加熱就可以使霉菌、酵母菌致死，引起這兩種類型菌污染的原因是加熱不足或加熱不均勻，食品的某些部位沒有達到預想的溫度，出現了微生物的殘留，造成了食品的變質，本論文從脹袋的八寶粥中分離到一株主要腐敗細菌，通過形態觀察、革蘭氏染色、API 20E生化鑒定和16SrDNA分子測序方法的鑒定結果為陰溝腸桿菌，說明陰溝腸桿菌能導致該種八寶粥軟罐頭食品腐敗，其污染可能是由于加熱不均勻所致，在大批量的生產中只有少數出現腐敗問題，可見嚴格按照規范生產操作至關重要。

微生物的鑒定方法很多，目前比較經典的是生理生化試驗和分子生物學鑒定相結合的方法。生理生化試驗對不同代謝產物、代謝酶系統的檢測對細菌進行鑒定。分子生物學是現代發展比較迅速和前沿的學科，根據四種核苷酸的排列順序可以對細菌進行鑒定。16SrDNA具有高度保守的序列，在生物的演變史中幾乎沒有發生變化，可利用保守區將細菌16SrDNA擴增出來，根據非保守區區分種屬。又由于16SrDNA大小適中，約1 500 bp大小的長度，對其測序相對容易，所以16SrDNA稱為鑒定細菌的首選。

［1］閆亞梅，戶長潤.軟罐頭八寶粥的研制［J］.山東食品發酵，1995（3）: 15-17

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［3］湯文杰.淺談蒸煮袋應用狀況［J］.今日印刷，2008（4）:20-21

［4］鄭海平，申利娟.碗裝八寶粥穩定性的影響因素研究［J］.食品工業，2012，33（5）:54-56

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［8］廖建龍.罐藏食品腐敗變質的原因及對策［J］.福建農業科技，2013（11）:68-69

［9］陳忠杰，李存法，王璐.引起罐藏食品腐敗變質的微生物探討［J］.鄭州牧業工程高等專科學校學報，2012，32（1）:19-21

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Separation and Identification Spoilage Microorganisms in the Soft Can of Rice Pudding

HE Yi，ZHU Jing-song，JIANG Xuan，YUAN Ning，ZHANG Wei*
（Agricultural Univorsity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

A strain of pathogenic Microbal zjs001 was successfully isolated from the spoilage of one soft can of rice pudding，by morphological observation.Gram staining and biochemical characterization of 20E API were performed，and the genomic DNA wasextracted，and PCR 16SrDNA was amplified and sequenced.The amplified products were sequenced and compared with the known sequences in NCBI，identified as Enterobacter cloacae.

rice porridge；soft can；rot fungus；identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.036

2015-08-17

何義（1979—），男（漢），助理研究員，碩士，研究方向：食品科學。

張偉（1963—），男，教授，研究方向：食品科學。