兩種大蒜汁抑菌效果檢測技術比較及評價

夏俊芳，楊婷，張珍珍，武運，古麗娜孜，周咪，房丹，劉箐

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農業大學科學與技術學院，新疆烏魯木齊830052；3.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093）

兩種大蒜汁抑菌效果檢測技術比較及評價

夏俊芳1，楊婷1，張珍珍1，武運1，古麗娜孜1，周咪2，房丹2，劉箐3，*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農業大學科學與技術學院，新疆烏魯木齊830052；3.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093）

抑菌能力是評價食品防腐效果的一項重要指標，不同的抑菌試驗方法對食品防腐劑抗菌能力的評價有較大影響，因此，選用枯草芽孢桿菌和啤酒酵母為受試菌株分別采用牛津杯法和濾紙片法，分別對鮮榨蒜汁和4℃存貯7 d蒜汁抑菌效果進行評價，對大蒜汁抑菌特性進行研究，為大蒜汁的生物抑菌、防腐提供理論基礎和工藝參數，同時為抑菌效果的評價做出科學、合理的判斷。

鮮榨蒜汁；抑菌圈直徑；牛津杯法；濾紙片法

大蒜是“地里長出來的抗生素”，具有天然廣譜抗菌特性。大蒜中的抑菌活性成分主要是含硫化合物等揮發性物質及大蒜素等，具有很強的殺菌作用［1-3］；目前國內外對大蒜抑菌、抗菌作用的研究報道集中于大蒜活性物質——大蒜油、大蒜素等對微生物的抑制方面［4-11］，而不是用整個大蒜破碎后的汁液進行研究。大蒜油、大蒜素在提取中，自身天然活性會受到損失或改變，而且提取率較低，提取后的殘留物不能再食用，造成原料的大量浪費，且提取后的大蒜油、大蒜素性質極不穩定，易失去活性，在生產中較難利用開發。若將完整大蒜采用榨汁方式獲得完整榨汁液，對榨汁液抑菌效果進行評價分析，期望用榨汁液獲得抑菌特性成果，同時為蒜汁抑菌評價方法的選擇提供科學、合理的判斷。

抑菌能力是評價食品防腐劑效果的一項重要指標，不同的抑菌試驗方法對食品防腐劑抗菌能力的評價有較大影響，因此，本研究采用完整大蒜直接取汁，選用枯草芽孢桿菌和啤酒酵母為受試菌株采用兩種評價方法（牛津杯和濾紙片法）對鮮榨和4℃7 d存貯期的蒜汁抑菌特性進行分析，為大蒜汁的生物抑菌、防腐提供理論基礎和工藝參數，為大蒜的進一步開發利用生產食品保藏、防腐的天然生物防腐劑提供技術參考。

1材料與方法

1.1主要材料與儀器

1.1.1試驗材料

新鮮白皮大蒜：購于新疆烏魯木齊北園春農貿市場。

本研究選用引起番茄醬腐敗的主要微生物：枯草芽孢桿菌及啤酒酵母（分別是導致番茄醬平酸腐敗的嗜溫需氧芽孢桿菌和導致番茄醬發生脹袋現象的發酵糖產酸產氣的酵母代表屬［12-14］為試驗菌株，以上菌種均由新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室提供。

營養瓊脂培養基、YPD培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.2儀器

DJ100—3型電子分析天平：上海恒平科學儀器有限公司提供；LRH—280型生化培養箱：上海森信試驗儀器有限公司提供；LDZX—40SCI型高壓滅菌鍋：上海早安醫療器械廠產品；牛津杯（內徑6mm，外徑8mm，高10 mm）。

1.2方法

1.2.1菌懸液的制備

枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌株分別用營養肉湯37℃和28℃培養18 h倍比稀釋，稀釋倒平板計數確定細菌懸液濃度。枯草芽孢桿菌原菌液平均濃度是6.32×108CFU/mL，啤酒酵母原菌液平均濃度是9.8× 108CFU/mL，4℃冰箱中貯存備用。

1.2.2大蒜汁濃度制備

各種濃度大蒜汁的制備：取一定量的大蒜去皮于榨汁機中壓榨成汁，再于離心機3 000 r/min離心20 min，取上清液作為100%的大蒜汁，采用二倍稀釋法［13］用適量無菌水稀釋成濃度為50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%的大蒜稀釋液，用試管振蕩器混勻、備用。

1.2.3采用牛津杯法對大蒜汁抑菌效果評價

吸取0.1 mL菌懸液涂布于雙碟平皿，用無菌鑷子鑷取規格完全一致的不銹鋼小管3個（即牛津小杯）置于含菌的瓊脂平板上，然后用移液槍在2個牛津杯中加入一定濃度的大蒜汁溶液0.1 mL，吸取0.1 mL無菌蒸餾水加入剩下的牛津杯中作為空白對照，室溫下靜置5 min～10 min，正置平板于恒溫培養箱中，枯草芽孢桿菌37℃，培養24 h，啤酒酵母28℃，培養24 h，測量抑菌圈直徑并拍照記錄結果。分別測量每一個抑菌圈兩個垂直方向的直徑大小，每個試驗重復3次，記錄各個重復的平均值。

1.2.3.1牛津杯法測不同濃度的大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌評價

參照1.2.3，取牛津杯，移液器加入梯度大蒜汁（100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%）0.1 mL，測不同濃度的大蒜汁對兩種菌的抑菌效果。

1.2.3.2牛津杯法測不同pH大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌評價

移取pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸緩沖液，與制備的大蒜汁混合，使所制備的大蒜汁終pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，采用牛津杯法測定兩種菌在不同pH下的抑菌圈大小。

1.2.4采用濾紙片法對大蒜汁抑菌效果評價

用打孔器將濾紙打成直徑為0.88 cm的圓形紙片，經121℃高壓蒸汽滅菌20 min后置于55℃～56℃烘箱內烘干。取濾紙圓片，置于大蒜汁中浸泡10 min，吸取0.1 mL菌懸液用無菌玻璃涂布器涂勻平皿，用無菌鑷子鑷取兩個上述浸泡至飽和濾紙圓片，在瓶壁上瀝去多余溶液，無菌操作放入測試培養基平板表面，并以無菌蒸餾水浸泡的濾紙片作為空白對照，室溫下靜置5 min～10 min，使菌液吸附進培養基，倒置平板與恒溫培養箱中枯草芽孢桿菌37℃培養，啤酒酵母菌28℃培養，測量抑菌圈的直徑。數據統計與處理，分別測量每一個抑菌圈兩個垂直方向的直徑大小，每個試驗重復3次，記錄各個重復的平均值。

1.2.4.1濾紙片杯法測不同濃度的大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌評價

取濾紙圓片，置于梯度大蒜汁（100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%）中浸泡10 min，采用1.2.4濾紙片法測不同濃度的大蒜汁抑菌效果。

1.2.4.2濾紙片法測不同pH大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌評價

移取pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸緩沖液，與制備的大蒜汁混合，使所制備的大蒜汁終pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，采用濾紙片法測定兩種菌在不同pH下的抑菌圈大小。

1.2.5不同抑菌試驗方法對苯甲酸鈉、山梨酸鉀防腐效果的影響

將苯甲酸鈉、山梨酸鉀分別調至最佳pH作用范圍，苯甲酸鈉pH2.5～4.0，在食品中的限量值為0.2 g/kg～1 g/kg，山梨酸鉀pH5.0～6.0，在食品中的限量值0.2 g/kg～2 g/kg，分別采用牛津杯法和濾紙片法測定防腐劑對兩種指示菌抑菌能力，并與大蒜汁抑菌效果進行比較。

2結果

2.1采用牛津杯法對大蒜汁抑菌效果評價

2.1.1牛津杯法測不同濃度的大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌效果評價

如圖1（A-1，B-1）所示，不同濃度大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌效果趨勢相同，隨著大蒜汁濃度的降低抑菌效果逐漸減弱。對枯草芽孢桿菌的抑菌效果，鮮榨蒜汁與7 d蒜汁在6.25%都有抑菌圈出現（A-1）。圖A-2所示，鮮榨蒜汁的抑菌效果優于7 d蒜汁，100%鮮榨蒜汁抑菌圈直徑高于同濃度7 d蒜汁，高出9.4%，50%鮮榨汁抑菌圈直徑高于同濃度7 d蒜汁21.7%，25%鮮榨汁抑菌圈直徑高于同濃度7 d蒜汁26.3%，、12.5%鮮榨汁抑菌圈直徑高于同濃度7 d蒜汁13.3%，6.25%鮮榨汁抑菌效果與同濃度7 d蒜汁無顯著性差異，表明4℃存貯7 d蒜汁仍有抑菌效果且7 d蒜汁在3.13%濃度下（A-1）出現了抑菌圈，這可能是由于大蒜素的產生需要和氧氣充分接觸，較長時間的存放使得低濃度蒜汁大蒜素含量增加，出現抑菌圈。

與牛津杯法測啤酒酵母的效果相似（B-1），鮮榨蒜汁抑制啤酒酵母效果優于存貯7 d蒜汁，100%鮮榨蒜汁抑菌圈直徑高于同濃度7 d蒜汁高出12.5%，50%鮮榨汁抑菌圈直徑高于同濃度7 d蒜汁16.7%，25%鮮榨汁與同濃度7 d蒜汁抑菌圈直徑無顯著性差異，但4℃貯存7 d蒜汁在1.57%濃度下有抑菌圈出現（圖B-1）。

圖1　牛津杯法測不同濃度的大蒜汁對指示菌抑菌效果Fig.1Oxford cup method measurement different concentration of the garlic juice for the indicator bacteria antimicrobial effection

2.1.2牛津杯法測不同pH大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌評價

采用牛津杯法測不同pH鮮榨和4℃貯存7 d蒜汁對枯草芽孢桿菌、啤酒酵母抑菌效果，如圖2-A、圖2-B所示，pH 2～7都有抑菌圈出現，表明大蒜汁在較寬的pH范圍都有抑菌活性；圖2-C所示，抑菌圈直徑在pH 5～7時大蒜汁抑菌效果最佳這與文獻［9，16］大蒜素在pH=6.5時具有最強的生物活性相近，同時進一步驗證前人對大蒜汁中主要生物抑菌成分大蒜素在偏酸性（pH5～7）條件下較穩定的論斷［17-18］。通過測定大蒜原汁的pH為5.6，大蒜汁抑菌的最佳pH范圍5～7，這個范圍與大蒜原汁的pH接近。

圖2　牛津杯法測不同pH的100%大蒜汁對指示菌抑菌影響Fig.2Oxford cup method measurement different PH of the100%garlic juice for the indicator bacteria antimicrobial effect

2.2采用濾紙片法對大蒜汁抑菌效果評價

2.2.1濾紙片法測不同濃度的大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌評價

如圖3（A-1，B-1）所示，不同濃度大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌效果不同，大蒜汁濃度越大，抑菌效果越明顯，鮮榨蒜汁抑菌圈直徑高于同濃度7 d蒜汁。對枯草芽孢桿菌抑菌效果，100%鮮榨蒜汁高出7 d蒜汁22.2%，50%鮮榨汁抑菌圈直徑高于同濃度7d蒜汁4.5%，25%鮮榨蒜汁高于同濃度7d蒜汁5.9%，12.5%無顯著性差異，在6.25%濃度下4℃存貯7 d蒜汁仍有抑菌效果而鮮榨蒜汁無抑菌效果。

濾紙片法測啤酒酵母抑菌效果，鮮榨蒜汁抑制啤酒酵母效果與存貯7 d蒜汁抑菌效果相同，100%鮮榨蒜汁抑菌圈直徑高于同濃度7 d蒜汁，高出7.1%，50%7 d蒜汁抑菌圈直徑高于同濃度鮮榨汁8.9%，25%7 d蒜汁高于鮮榨汁抑菌圈直徑3.3%，且4℃貯存7 d蒜汁在1.57%濃度下有抑菌圈出現（圖3-B-1）。這可能是由于大蒜素的產生需要和氧氣充分接觸，較長時間的存放使得低濃度蒜汁大蒜素含量增加，出現抑菌圈。

圖3　濾紙片法測不同濃度的大蒜汁對指示菌抑菌效果Fig.3Filter paper method measurement different concentration of the garlic juice for the indicator bacteria antimicrobial effection

2.2.2濾紙片法測不同pH大蒜汁對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑菌評價

如圖4-A、圖4-B所示，采用濾紙片法測鮮榨蒜汁和4℃貯存7d蒜汁在不同pH下抑菌效果，pH2～7時都有抑菌圈出現，表明大蒜汁在較寬的pH范圍都有抑菌活性，通過圖4-C抑菌圈直徑不論是鮮榨蒜汁還是7d存貯蒜汁對指示菌在pH5～6時大蒜汁抑菌效果最佳，這與2.1.2牛津杯法測不同pH大蒜汁的抑菌譜（pH5～7）比較窄，表明不同的抑菌方法對結果的產生有較大影響。

2.3兩種方法對指示菌抑菌效果分析

分別采用牛津杯法和濾紙片法測不同存貯期不同濃度大蒜汁對指示菌的抑菌影響，由圖5-A蒜汁對枯草芽孢桿菌的抑菌效果，牛津杯法評價效果明顯優于濾紙片法，在6.25%下可以檢測到抑菌圈（高于濾紙片檢測限12.5%），檢測7 d蒜汁對枯草芽孢桿菌的抑菌效果，牛津杯法效果評價明顯優于濾紙片法，在3.13%下可以檢測到抑菌圈（高于濾紙片檢測限6.25%）；圖5-B蒜汁對啤酒酵母的抑菌效果，牛津杯法與濾紙片法檢測限一致，鮮榨汁液在3.13%下可以檢測到抑菌圈，測7 d蒜汁牛津杯法與濾紙片法檢測限一致，在1.57%下可以檢測到抑菌圈。表明當指示菌是細菌時，采用牛津杯法能較好地體現抑菌作用；當指示菌為酵母菌時，采用牛津杯法和濾紙片法效果一致。這可能是因為濾紙片中大蒜汁暴露在紙片表面，加之枯草芽孢桿菌培養溫度37℃使得大蒜抑菌物質隨水分有所揮發，造成靈敏度偏低，這與劉春云等［19］的研究結果相似。另大蒜汁抑菌效果啤酒酵母強與枯草芽孢桿菌，100%鮮榨蒜汁對啤酒酵母抑菌效果高于枯草芽孢桿菌28.6%（圖5），這與微生物細胞壁的結構有一定的相關性，G+細菌細胞壁結構致密，使得蒜汁抑制殺滅該菌較為困難。

圖4　濾紙片法測不同pH的100%大蒜汁對指示菌抑菌影響Fig.4Filter paper method measurement different PH of the100% garlic juice for the indicator bacteria antimicrobial effect

圖5　兩種方法對指示菌抑菌效果影響Fig.5Two kinds of methods effect of the indicator bacteria antimicrobial effect

2.4與苯甲酸鈉、山梨酸鉀防腐效果對比

苯甲酸鈉pH2.5～4.0，在食品中的限量值為0.2 g/kg～1g/kg，山梨酸鉀pH5.0～6.0，在食品中的限量值0.2g/kg～2 g/kg，擴大食品中最高限量值10倍、100倍觀察抑菌效果，顯示不同抑菌試驗方法對防腐劑防腐效果的影響，在適宜pH 1/10濃度的苯甲酸鈉對指示菌有抑菌作用（高于最高限量100倍），1/10濃度的山梨酸鉀有抑菌效果高于最高限量50倍且只對啤酒酵母有抑菌作用。通過表1抑菌圈直徑比較，采用牛津杯法評價對枯草芽孢桿菌效果優于濾紙片法，當指示菌為酵母菌時，采用牛津杯法和濾紙片法靈敏度無顯著差異。這與2.3評價兩種方法對大蒜汁抑菌效果的影響是一致的。

圖6　兩種方法對指示菌抑菌效果評價Fig.6Two kinds of methods evaluated theeffect of the index bacteria

3討論

在本研究中我們采用牛津杯、濾紙片兩種方法來評價大蒜汁對番茄醬中常見腐敗微生物枯草芽孢桿菌、啤酒酵母的抑菌效果影響。將大蒜榨汁后發現汁液有一定的抑菌效果且隨著濃度增大抑菌效果增強，大蒜抑菌最佳pH為5～6，值得一提的是研究中發現不僅鮮榨蒜汁有抑菌活性，存貯7 d蒜汁仍有抑菌效果并在較低濃度下有抑菌效果。表明：1）通過直接取汁方式，可以保存大蒜中的主要抑菌物質——大蒜素，有期望將大蒜鮮榨汁作為天然防腐劑添加到食品中既能起到防腐保鮮作用又能增加產品風味，對原料充分使用，提高其經濟價值，解決大蒜素天然活性提取成本高、浪費大且易損失易改變的缺點。2）與防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀抑菌效果對比，大蒜汁具有較強抑菌效果，3.13%蒜汁有抑菌效果，而防腐劑超標使用100倍才有抑菌效果。3）不論對蒜汁抑菌效果評價還是化學防腐劑抑菌效果評價，對枯草芽孢桿菌抑菌效果牛津杯法優于濾紙片法，盡管牛津杯在使用中容易發生由于操作不當，在放置中力度難以掌握，造成牛津杯在培養基表面滑動，對操作者操作手法要求較高，但通過牛津杯可以使抑菌物質均勻緩慢地分布滲透到平板中，所得抑菌圈規則清晰便于測量，這點在防腐劑的抑菌檢測結果一致，通過牛津杯法，1/10濃度的苯甲酸鈉對枯草芽孢桿菌有抑菌圈出現，但采用濾紙片法卻檢測不到，對啤酒酵母抑菌效果兩種方法無顯著差異。可見不同的抑菌試驗方法對防腐劑效果的評價有明顯影響，選擇科學合理的評價方法對天然防腐物質的開發和準確評價具有重要作用。當指示菌為細菌時，采用牛津杯法，當指示菌為酵母菌時，可以采用濾紙片法進行評價。

表1　兩種抑菌方法測定不同質量濃度防腐劑溶液抑菌效果（±s，n=3）Table 1Two kinds of antibacterial methods determination different oncentration preservative antimicrobial effect（±s，n=3）

表1　兩種抑菌方法測定不同質量濃度防腐劑溶液抑菌效果（±s，n=3）Table 1Two kinds of antibacterial methods determination different oncentration preservative antimicrobial effect（±s，n=3）

注：“—”表示無抑菌圈。

平均抑菌圈直徑/cm牛津杯法濾紙片法枯草芽孢桿菌啤酒酵母枯草芽孢桿菌啤酒酵母苯甲酸鈉1/101.6±0.173.7±0.20—3.4±0.23苯甲酸鈉1/100——苯甲酸鈉1/1000——山梨酸鉀1/10—3.9±0.22—3.7±0.25山梨酸鉀1/100——山梨酸鉀1/1000——質量濃度/（g/L）

大蒜作為良好的天然食品防腐劑，具有良好的抑制和殺滅微生物的作用，本試驗通過榨汁方式，采用牛津杯法和濾紙片法取得了一定進展，但在試驗中，1）大蒜汁貯藏期時間選擇了鮮榨和7 d 2個時間段，還有待研究榨汁存貯時間更長的抑菌效果變化；2）受試菌株較少，僅選擇了枯草芽孢桿菌和啤酒酵母兩個指示菌，后期試驗需加大供試菌株。3）除了定性測定生物抑菌活性的方法、牛津杯法和濾紙片法外，還有定量法、活菌計數和酶標比濁法，后期試驗需做該兩法的對比評價，將定量與定性相結合，全面、準確反映抑菌活性，這對天然防腐劑的開發和評價具有重要意義。

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Two Kinds of Antibacterial Effect of Garlic Juice Detection Technology Comparison and Evaluation

XIA Jun-fang1，YANG Ting1，ZHANG Zhen-zhen1，WU Yun1，GU Linazi1，ZHOU Mi2，FANG Dan2，LIU Qing3，*
（1.College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；2.Institute of Science and Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；3.School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China）

Antibacterial ability is an important index to evaluate the effect of food preservatives，different experimental method evaluation the antibacterial ability of food preservatives will have a great influence，therefore，using Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae as the tested strains respectively use Oxford cup method and filter paper method to the fresh garlic juice and 4℃storage 7 days garlic juice bacteriostasis effect evaluate，for the antimicrobial properties of garlic juice were studied，for garlic juice biological antibacterial and preservative，provide experimental technique of a scientific theoretical basis and technological parameters，for the accurate evaluation of antibacterial effect provides a scientific and reasonable evaluation.

fresh garlic juice；the diameter of inhibition zone；oxford cup method；filter paper method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.039

2015-05-25

新疆農業大學大學生創新項目（201510758223）

夏俊芳（1986—），女（漢），助教，碩士，主要從事食品微生物安全控制研究。

劉箐（1970—），男（漢），教授，博士，主要從事食源性致病菌致病機理及快速檢測技術研究。