苦蕎麥黃酮對心肌缺血再灌注大鼠心功能的影響*

潘嘉西　葉向陽　王永光　潘嘉林　林加鋒△

（1.溫州醫科大學附屬第三醫院，浙江瑞安325200；2.溫州醫科大學附屬第二醫院，浙江溫州325000）

·研究報告·

苦蕎麥黃酮對心肌缺血再灌注大鼠心功能的影響*

潘嘉西1葉向陽1王永光1潘嘉林2林加鋒2△

（1.溫州醫科大學附屬第三醫院，浙江瑞安325200；2.溫州醫科大學附屬第二醫院，浙江溫州325000）

目的觀察苦蕎麥黃酮對缺血再灌注大鼠心肌的保護作用，并初步探討其可能機制。方法SD大鼠隨機分成假手術組、模型組、苦蕎麥黃酮處理組，建立心肌缺血再灌注損傷模型，觀察并記錄缺血和再灌注狀態下大鼠的血流動力學指標［左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末期壓力（LVDEP）、左室內壓上升最大速率（±dp/dtmax）、左室內壓下降最大速率（-dp/dtmax）］的變化；測定血清中血清乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮（NO）的含量；采用TTC法計算心肌梗死程度。結果與模型組相比，黃酮組的LVSP及±dp/dtmax的絕對值均顯著升高，LVEDP值顯著下降；黃酮組能有效降低心肌缺血再灌注大鼠血清中LDH、CK和MDA的含量，顯著增加SOD、GSH-PX和NO的含量，減輕心肌梗死程度。結論苦蕎麥黃酮對大鼠缺血再灌注心肌具有一定的保護作用，其機制可能與苦蕎麥黃酮可以提高氧自由基清除能力，抑制氧自由基產生，降低脂質過氧化損傷，增強NO水平有關。

苦蕎麥黃酮心肌缺血再灌注心功能

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是指心肌在缺血發生后，血流再次恢復灌注而引起的一系列心肌損傷，這是一個復雜的病理生理過程［1］。在心血管系統疾病中有著較高的發病率和死亡率［2-3］。缺血再灌注是造成臨床心臟外科手術失敗的重要原因之一，已成為心臟外科手術后亟待解決的問題［4］。

苦蕎麥（Buckwheat）又名韃靼蕎、野蕎麥、野南蕎，屬蓼科雙子葉植物，喜陰涼，耐瘠薄，主要分布于我國高寒山區［5］。苦蕎麥是一種重要的小宗雜糧作物和藥食同源植物，有著悠久的入藥歷史，其性味苦、平、寒，具有益氣力、續精神、解毒消腫、健胃行滯等作用，被稱為“藥食兩用”的糧食珍品［6-7］。苦蕎麥中含有其他禾谷類植物所沒有的黃酮類物質，其含量高達3.25，主要為蘆丁、槲皮素、山奈酚等［8］。黃酮類物質具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、改善血管微循環、對缺血損傷的保護作用等生理活性［9-10］。為進一步研究苦蕎麥中黃酮的藥理作用，本實驗將觀察苦蕎麥中所含的黃酮類物質對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，為其臨床應用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物30只SD大鼠，清潔級，體質量200～250 g，由浙江省疾病預防控制中心購買，本實驗研究獲得動物倫理委員會和動物實驗控制和監督委員會的同意。

1.2藥物及試劑苦蕎麥黃酮提取物：由西安斯諾特生物技術有限公司提供，使用前用生理鹽水溶解為100 mg/L備用；血清乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮（NO）試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。

1.3分組及給藥將SD大鼠隨機分為3組，每組10只，雌雄各半，苦蕎麥黃酮組予苦蕎麥黃酮提取物50 mg/（kg·d），假手術組和模型組給予相同體積的0.9%氯化鈉注射液，各組均為灌胃給藥，連續用藥7 d。

1.4模型制備采用大鼠冠狀動脈左前降支結扎法［11］制作心肌缺血再灌注模型。各組大鼠給藥7 d后，于末次給藥30 min后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉，固定大鼠，四肢皮下插電極，監測Ⅱ導聯心電圖。分離雙側頸總動脈，由頸總動脈插管至左心室，連接微型動物呼吸機進行人工呼吸。于左側胸骨第3、4肋間開胸，用手術線結扎冠狀動脈左前降支，然后將心臟放回胸腔，擠出胸腔內氣體，迅速關閉胸腔。結扎45 min后，解除結扎，心肌再灌注60 min。當心電圖ST段明顯上抬，結扎部位心肌顏色變暗，再灌注時，ST段回落1/2以上，心肌顏色變紅表明心肌缺血再灌注造模成功。假手術組穿線不結扎。模型建立成功后，對相關指標進行檢測。

1.5指標采集及檢測1）心臟功能測定。采用BL-420S生物機能實驗系統監測大鼠的心功能，分別記錄結扎前（T0）、結扎后45 min（T1）、再灌注60 min（T2）后各項指標：左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末期壓力（LVDEP）、左室內壓上升最大速率（+dp/dtmax）、左心室內壓最大下降速率（-dp/dtmax）。2）生化指標的檢測。造模成功后，從頸總動脈取血2 mL于肝素化的離心管中，4℃3000 r/min離心10 min，取上清液，放于-80℃冰箱冷凍保存。按照試劑盒說明分別測定血清乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮（NO）的含量。3）心肌梗死面積的測定。再灌注結束后，重新將冠狀動脈左前降支結扎通過左心房注入2%伊文思藍，非缺血區被染成藍色，而缺血區心肌不被染色。將動物處死摘取心臟，預冷的0.9%氯化鈉溶液清洗心臟，沖凈余血，去除心房和右心室，放于-80℃冰箱速凍5 min。然后從心尖到心基部平行切為1～1.5 mm厚的薄片，將切片置于1%TTC磷酸鹽緩沖液中（pH=7.4），37℃溫育15 min，用冷水沖洗掉多余的染料，4%甲醛固定。非梗死區為藍色，危險區為紅色，梗死區為白色。顯微鏡下沿不同顏色邊緣仔細分離各區域心肌，電子天平分別稱量，以梗死區質量與危險區質量的比值（白色梗死區質量/危險區質量×100%）表示左心室梗死心肌范圍。

1.6統計學處理應用SPSS17.0統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析對多組間均數進行比較，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠心臟功能測定比較見表1。各組大鼠的心功能指標在心肌缺血前差異無統計學意義。與假手術組相比，模型組和黃酮組在缺血末與再灌期間的LVSP及±dp/dt的絕對值均顯著降低，LVEDP顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃酮組的LVSP及±dp/dt的絕對值均顯著升高，LVEDP值顯著下降（P＜0.05）。

表1　各組大鼠心臟功能測定比較±s）

表1　各組大鼠心臟功能測定比較±s）

與假手術組同時期比較，**P＜0.01；與模型組同時期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

LVSP（mmHg）LVDEP（mmHg）121.93±7.844.74±0.51 121.83±8.264.72±0.44 123.92±7.884.66±0.51模型組T0120.84±9.634.74±0.49（n=30）T1100.33±7.80**7.07±0.52**T273.32±10.41**11.77±0.76**黃酮組T0125.19±7.424.74±0.52（n=30）T1108.41±5.41**△6.13±0.29**△△T297.03±7.63**△△9.62±0.83**△△組別時間假手術組T0（n=30）T1 T2 +dp/dtmax（mmHg/s）5025.86±84.32 4995.11±86.13 4992.10±86.84 4990.69±77.12 4382.91±131.89**3537.19±149.90**4975.58±95.74 4628.82±164.20**△△4192.94±122.57**△-dp/dtmax（mmHg/s）-3564.71±116.28 -3554.41±118.22 -3500.53±111.33 -3496.45±96.51 -2982.82±111.87**-2265.41±159.90**-3509.39±102.51 -3193.61±130.75**△△-2619.75±72.19**△△

2.2各組大鼠血清生化指標比較見表2。與假手術組比較，模型組和黃酮組血清中LDH、CK和MDA的含量顯著升高，SOD、GSH-PX和NO的含量顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，黃酮組的LDH、CK和MDA的含量顯著降低，SOD、GSH-PX和NO含量顯著升高（P＜0.01）。

表2　各組大鼠血清生化指標比較±s）

表2　各組大鼠血清生化指標比較±s）

組別n LDH（U/L）CK（U/L）SOD（U/mL）MDA（μmol/L）GSH-PX（μmol/L）NO（μmol/L）假手術組30模型組30 849.89±120.941577.14±163.30150.84±26.11 1963.58±123.83**3489.18±258.36**78.89±12.61**4.36±0.94 8.58±1.21**1607.13±157.0547.98±10.80 1180.88±162.44**17.78±6.83**黃酮組301277.43±177.37**△△2660.33±137.94**△△113.07±19.81**△△6.08±1.34**△△1430.81±156.04**△29.03±5.72**△△

2.3各組大鼠心肌梗死范圍比較見表3。經伊文思藍染色后，假手術組心肌全部為藍色，無梗死區；再由TTC染色后，模型組與黃酮組可以看到明顯的白色梗死區，黃酮組較模型組梗死區范圍明顯縮小（P＜0.01）。

表3　各組大鼠心肌梗死范圍比較（±s）

表3　各組大鼠心肌梗死范圍比較（±s）

組別n梗死區/危險區（%）梗死區質量（g）危險區質量（g）假手術組300模型組3049.85±4.74 0 0 0.33±0.040.67±0.03黃酮組3035.06±6.18△△0.23±0.030.67±0.05

3　討論

心肌缺血再灌注常發生于溶栓治療、心臟移植等手術過程中，是臨床上常見的難以克服的病理變化，其表現為心臟功能狀態異常，恢復供血后心功能恢復與預期呈現顯著差別，甚至心肌遭受進一步損傷。心肌缺血再灌注產生的原因比較復雜，可能與氧自由基的產生及其導致的脂質過氧化反應、一氧化氮、細胞內鈣超載等作用有關，特別是氧自由基學說在其中占有重要地位［12］。因此，尋找可以有效清除氧自由基抑制脂質過氧化反應，恢復缺血區心肌細胞正常功能的藥物已成為心肌缺血再灌注研究的重要方面。黃酮類物質具有抗氧化清除氧自由基，抑制炎癥反應，對心血管的保護等作用。邵瑩等［13］發現淡竹葉黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用；李玉田等［14］在苦蕎麥黃酮對家犬腎缺血的影響研究中發現苦蕎麥黃酮具有一定的抗缺血作用。黃葉梅等［15］發現苦蕎黃酮可以保護缺血再灌注后大鼠腦組織的損傷，但有關苦蕎麥黃酮的相關作用未見報道，據此本文以苦蕎麥黃酮為研究對象探討其對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

本實驗采用大鼠冠脈結扎45 min，再灌注60 min的方法制備心肌缺血再灌注動物模型，觀察苦蕎麥黃酮對該動物模型的影響。心功能的改變是本病重要表現之一［16］。在反映心功能狀態的指標中，LVSP和+dp/dtmax反映心臟的收縮功能，LVEDP和-dp/dtmax反映心臟的舒張功能。本研究結果顯示，模型組的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高，即心臟發展張力降低，靜止張力升高，心肌收縮功能下降，出現心功能障礙，提示心臟功能受損；而黃酮組能明顯升高LVSP、+dp/dtmax、和-dp/dtmax，降低LVEDP值，表明苦蕎麥黃酮可以改善MIRI引起的心臟舒縮功能，改善心功能狀態。

氧自由基的產生和脂質過氧化反應是MIRI的主要機制［17］。SOD和MDA是反映氧化損傷的兩個重要生化指標。SOD是體內重要的抗氧化酶，可以有效清除氧陰離子自由基，對機體的氧化與抗氧化平衡起重要作用，其含量高低反映機體的抗氧化能力；MDA是脂質過氧化反應產物，其含量的變化可以間接反映機體受氧自由基攻擊損傷的程度［18］。GSH-PX也是對抗機體活性氧的一道防線，可以清除由活性氧和OH誘發的脂質過氧化物，起到保護細胞結構和功能的重要作用。實驗結果提示，模型組SOD、GSH-PX活性顯著降低，MDA含量顯著升高，細胞內氧自由基增加，同時脂質過氧化反應劇烈，導致心肌細胞受到損傷。而黃酮組SOD、GSH-PX的活性顯著升高，MDA含量顯著降低，表明苦蕎麥黃酮可以有效清除氧自由基，抑制脂質過氧化反應，減輕心肌細胞的損傷。心肌酶LDH、CK是心肌細胞損傷程度的重要指標，當心肌細胞受損時，膜的完整性遭到破壞［19］，使心肌酶漏出胞外，致使血清中濃度升高，血清中心肌酶的量則反映了心肌受損傷的程度和心肌梗死程度［20-21］。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組LDH、CK含量顯著升高，說明缺血再灌引起心肌損傷，造成心肌梗死；與模型組相比，黃酮組LDH、CK含量顯著下降，心肌梗死程度顯著下降，說明苦蕎麥黃酮對心肌細胞具有保護作用，減輕心肌細胞受損。NO可以有效對抗氧自由基的損害，對缺血再灌注后心肌有正性肌力作用。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組NO含量顯著下降，黃酮組與模型組相比NO含量顯著升高。說明苦蕎麥黃酮可以減少氧自由基的生成并加速清除，增強心肌抗氧化能力，改善心臟功能。

綜上可知，苦蕎麥黃酮對心肌MIRI大鼠的心肌具有保護作用，能夠改善MIRI大鼠的心功能。其機制可能與苦蕎麥黃酮可以提高氧自由基清除能力，抑制氧自由基產生，增強心肌抗氧化能力，降低脂質過氧化損傷、增強NO水平，減輕心肌梗死程度有關。本實驗結果為苦蕎麥黃酮的臨床應用提供研究依據，對尋找安全有效的保護心肌MIRI的藥物具有重要的意義。

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The Effects of Buckwheat Flavonoids on Cardiac Function in Rats with Myocardial Ischemia/ReperfusionInjury

PAN Jiaxi，YE Xiangyang，WANG Yongguang，et al.The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Zhejiang，Ruian 325200，China

Objective：To observe the protective effect of buckwheat flavonoids on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.Methods：30 SD rats were divided into the sham operation group（SHAM group），the model group（MIRI group）and the buckwheat flavonoids treatment group（BWF group）randomly.We used the methods of ligatured the coronary artery 45min and reperfusion 60 min to establish the model of myocardial ischemia reperfusion injury to observe and record the hemodynamic parameters（LVSP，LVDEP and±dp/dtmax）changes under the condition of ischemia and reperfusion.Serum lactate dehydrogenase（LDH），creatine kinase（CK），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），glutathione peroxide（GSH-PX）and nitric oxide（NO）content were measured，and the degree of myocardial infraction was calculated with TTC method to observe the protective effect of buckwheat flavonoids on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.Results：Compared with the MIRI group，the LVSP and the absolute value of±dp/dtmax were increased significantly；the LVEDP value was decreased significantly in BWF group.The BWF group reduced the content of LDH，CK，MDA，increased the content of SOD，GSH-PX and NO significantly，and reduced the extent of myocardial infarction.Conclusion：The buckwheat flavonoids have a protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.The mechanism may be related to buckwheat favnoids'improving the oxygen free radical scavenging ability，the inhibition of oxygen free radical，reducing lipid peroxidation，and enhance the level of NO.

Buckwheat flavonoids；Myocardial ischemia reperfusion；Heart function

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1509-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.002

2015-04-08）

國家自然科學基金（81070155）

（電子郵箱：404078964@qq.com）