創(chuàng)傷失血性MODS患者外周血單核細(xì)胞核因子-κB表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

張穎，王曉榮

臨床醫(yī)學(xué)

創(chuàng)傷失血性MODS患者外周血單核細(xì)胞核因子-κB表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

張穎，王曉榮＊

創(chuàng)傷失血性休克；單核細(xì)胞核因子-κB；預(yù)后

創(chuàng)傷失血性休克是臨床常見的危重癥之一，許多因素參與了其病理過(guò)程。特別是免疫/炎癥反應(yīng)的失控，促炎細(xì)胞因子的大量釋放和抗炎反應(yīng)過(guò)度強(qiáng)烈均可導(dǎo)致MODS［1］。因此對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)的深刻認(rèn)識(shí)有利于早期認(rèn)識(shí)MODS病理生理紊亂，使其早期積極干預(yù)成為可能。本研究對(duì)創(chuàng)傷失血性MODS患者外周血單核細(xì)胞核內(nèi)核因子-κB（NF-κB）的表達(dá)和血清IL-6、TNF-a水平進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討他們的變化在MODS病情發(fā)生、發(fā)展中作用，為臨床對(duì)MODS輔助臨床診斷、病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料2010年2月—2013年12月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院ICU收治的各種創(chuàng)傷失血性MODS患者40例，均符合1995年全國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議指定的MODS病情分期的診斷標(biāo)準(zhǔn)和嚴(yán)重程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2］。其中男26例，女14例；年齡23～65歲，平均45歲；平均24 h失血＞1000ml，MODS病情評(píng)分為（13.54±3.89）分；死亡18例為創(chuàng)傷失血性MODS死亡組，MODS病情評(píng)分為（18.89±3.67）分；生存22例為創(chuàng)傷失血性MODS生存組，MODS病情評(píng)分為（11.34± 3.34）分。正常對(duì)照組為與MODS年齡、性別相匹配的健康體檢者40例，其中男25例，女15例；年齡23～64歲，平均43歲。上述參與者均排除自身免疫性疾病、哮喘和過(guò)敏性疾病或感染性疾病等，MODS患者均沒有接受抗腫瘤藥物、放射和免疫抑制藥治療。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1靜脈血抽取MODS患者于確診＜24 h、24～48 h、48～72 h、＞72 h抽空腹靜脈血5ml，正常對(duì)照組均抽取空腹靜脈血5m l，分別放入加抗凝劑的Falcon（12mm×75mm）試管內(nèi)，1 h內(nèi)送檢。

1.2.2單核細(xì)胞懸液制備①取抗凝血100μl加入等量FACS溶解劑，室溫20min，加PBS緩沖液漂洗一次。②立即加入250μl溶解液A 200μl、溶解液B和RNAase A，室溫10min，1 500 r/min離心5min，棄上清液，即得單核細(xì)胞懸液。

1.2.3計(jì)數(shù)和染色向制備好的單核細(xì)胞懸液中加入PBS緩沖液0.5m l，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml。用血紅蛋白吸管吸取單核細(xì)胞懸液10μl置于載玻片的一端，涂片，采用Wright-Giemsa法染色，鏡下確證制備的懸液為單核細(xì)胞懸液。

1.2.4單核細(xì)胞培養(yǎng)將各組所分離的單核細(xì)胞分別用適量RPMI1640培養(yǎng)基混勻后置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄掉非貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×109個(gè)/L，分別加入24孔板內(nèi)，置37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，留取細(xì)胞并收集上清液。

1.2.5 NF-κB的活性檢測(cè)制備各組單核細(xì)胞核蛋白提取物，測(cè)定蛋白濃度；含κB序列（5＇-AGC TTC AGA GGG GAC TTT CCG AGA GG-3＇，3＇-AGT CTC CCC TGA AAG GCT CTC TCC AGCT-5＇）的兩條寡核苷酸單鏈退火后結(jié)合成雙鏈探針，在DNA聚合酶klenow大片段催化下，用α32-Pd-CTP（亞輝公司產(chǎn)品）標(biāo)記探針3＇端，純化后用凝膠電泳遷移率改變分析法檢測(cè)NF-κB活性。將圖片進(jìn)行密度掃描（數(shù)值以總灰度的對(duì)數(shù)表示），對(duì)NF-κB活性進(jìn)行半定量分析。

1.2.6血清和培養(yǎng)上清液IL-6、TNF-a水平檢測(cè)采用放射免疫分析法測(cè)定，試劑購(gòu)自北京東亞免疫技術(shù)研究所，按說(shuō)明書操作，儀器為FJ2008G自動(dòng)免疫計(jì)數(shù)器。

2　結(jié)果

2.1不同時(shí)間段對(duì)照組和MODS組外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)對(duì)照組外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)隨時(shí)間變化波動(dòng)較小均保持在低水平（59.21±11.02）。MODS組在＜24 h、24～48 h、48～72 h、＞72 h時(shí)間段外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)分別為（666.58±137.18）（893.34±195.438）（751.52±176.36）（523.56±158.22），與對(duì)照組同一時(shí)間段外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)比較（表1），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P均＜0.01。MODS組患者外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)在24～48 h達(dá)到峰值，隨后逐步降低。

表1　不同時(shí)間外周靜脈血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)比較（±s）

表1　不同時(shí)間外周靜脈血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01

NF-κB時(shí)間段＜24 h 24～48 h 48～72 h＞72 h對(duì)照組40 60.55±12.01 60.33±11.89 58.44±12.21 58.46±11.87 MODS組40 666.58±137.18*893.34±195.43*751.52±176.36*523.56±118.22*組別n

2.2不同時(shí)間段對(duì)照組和MODS組細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6、TNF-a水平的變化對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6、TNF-a水平隨時(shí)間變化波動(dòng)較小均在正常范圍，各時(shí)間段比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P均＞0.05。MODS組患者在＜24h、24～48 h、48～72 h、＞72 h時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6、TNF-a水平與對(duì)照組同一時(shí)間段IL-6、TNF-a水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P均＜0.01。MODS組患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6、TNF-a在48～72 h達(dá)到峰值，隨后有逐步降低趨勢(shì)，見表2。

表2　兩組IL-6、TNF-a水平比較（±s）

表2　兩組IL-6、TNF-a水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01

MODS組IL-6（μg/L）TNF-a（ng/L）IL-6（μg/L）TNF-a（ng/L）＜24 h（n=40）上清液17.13±3.65 23.23±4.12 481.34±165.36*214.15±84.34*血清16.52±3.32 22.14±4.33 105.65±39.45*123.34±34.25*24～48 h（n=40）上清液17.32±3.54 24.45±4.79 532.13±157.87*223.59±90.63*血清16.12±3.23 21.22±4.32 145.54±49.45*125.68±34.56*48～72 h（n=40）上清液17.24±3.48 23.56±4.71 612.31±189.63*258.71±89.68*血清16.34±3.15 21.32±4.22 165.32±45.21*126.24±34.65*＞72 h（n=40）上清液17.32±3.34 23.61±4.56 591.65±179.28*236.76±86.36*血清16.42±3.22 22.12±4.31 163.21±43.23*126.12±34.10*時(shí)間對(duì)照組

2.3患者M(jìn)ODS評(píng)分、NF-κB、IL-6和TNF-a的變化與預(yù)后的關(guān)系死亡組患者M(jìn)ODS評(píng)分明顯高于生存組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.01；MODS組死亡患者外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)（686.58±148.12）與生存組患者（346.34±106.43）比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.01；MODS組死亡患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6含量與生存組患者比較顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P均＜0.01；MODS組死亡患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清TNF-a含量與生存組患者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P均＜0.05，見表3。

表3　各組MODS評(píng)分、NF-κB、IL-6和TNF-a比較（±s）

表3　各組MODS評(píng)分、NF-κB、IL-6和TNF-a比較（±s）

注：與生存組比較*P＜0.01

組別TNF-a（ng/L）IL-6（μg/L）NF-κB MODS評(píng)分死亡組（n=18）上清液325.57±98.56*761.68±169.32*686.58±148.12*18.89±3.67*血清154.72±65.26*255.6±98.1*生存組（n=22）上清液116.71±79.37*521.36±149.12*346.34±106.43 11.34±3.34血清99.56±55.15 94.2±68.5

2.4 MODS評(píng)分與NF-κB、IL-6和TNF-a的相關(guān)性分析經(jīng)spearman相關(guān)分析顯示，MODS組患者的MODS評(píng)分與細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6和TNF-a含量無(wú)明顯相關(guān)性；而與外周靜脈血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系r=0.4564，P＜0.05。細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清中TNF-a含量與IL-6含量間呈明顯正相關(guān)關(guān)系r1=0.5869，P＜0.01；r1= 0.5102，P＜0.01。

2.5影響MODS患者外周血單核細(xì)胞NF-κB活性、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6和TNF-a水平的危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析對(duì)影響MODS患者外周血單核細(xì)胞NF-κB活性、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6和TNF-a水平的危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析顯示，嚴(yán)重感染，胃腸道損傷，感染并發(fā)癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷均是影響患者外周血單核細(xì)胞NF-κB活性、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6和TNF-a水平的危險(xiǎn)因素，見表4。

表4　影響MODS患者IL-6和TNF-a水平的危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析結(jié)果

3　討論

隨著對(duì)創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展認(rèn)識(shí)的不斷深入，創(chuàng)傷/SIRS/MODS/MOF/死亡作為創(chuàng)傷并發(fā)癥的演變過(guò)程已達(dá)成共識(shí)［3］。創(chuàng)傷后并發(fā)癥如感染、ARDS和MODS等的發(fā)生率及其引發(fā)的死亡率仍居高不下，主要原因?yàn)樯鲜霾l(fā)癥發(fā)展速度極快。特別是病情發(fā)展到MOF階段，即使采取最及時(shí)的治療措施都難以遏止其發(fā)展進(jìn)程［4］。因此如能早期實(shí)施干預(yù)措施，對(duì)逆轉(zhuǎn)并發(fā)癥的演變和降低病死率都有重要意義。

NF-κB蛋白是一種化學(xué)上高度保守的免疫反應(yīng)蛋白，由Rel蛋白家族的兩位成員組成。Rel蛋白間可形成多種形式的同源或異源二聚體，其中以p50/p65最為典型，幾乎存在于體內(nèi)所有細(xì)胞，但是p65 C端含有一個(gè)以上反式激活區(qū)，具有激活靶基因轉(zhuǎn)錄的功能。NF-κB未激活時(shí)以二聚體與IκB單體偶聯(lián)，當(dāng)細(xì)胞接受胞外刺激信號(hào)（如脂多糖、TNF-a、氧自由基等）后NF-κB激活迅速由胞漿向胞核移位，并與核內(nèi)相應(yīng)DNA上κB序列結(jié)合，通過(guò)調(diào)控單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞炎性因子過(guò)度表達(dá)釋放，通過(guò)“扳機(jī)樣作用”觸發(fā)炎性因子的“瀑布樣效應(yīng)”［5］。

在嚴(yán)重創(chuàng)傷或出血性休克的情況下，有效血容量明顯減少，心輸出量明顯下降，血液灌流不足，微循環(huán)障礙，從而直接影響主要臟器如腦、心、肺、肝、腎等的功能［6］。在失血性休克大鼠病理過(guò)程中，肝組織在傷后NF-κB迅速表達(dá)，傷后6 h達(dá)到峰值，傷后8 h仍維持較高水平，NF-κB持續(xù)高表達(dá)一直維持在肝這一病理過(guò)程的始終，表明NF-κB在創(chuàng)傷失血性休克傷后肝繼發(fā)性損害中扮演著重要角色，參與了肝損傷的發(fā)生［7］。同樣的研究發(fā)現(xiàn)，在失血性休克鼠模型的肺組織細(xì)胞中NF-κB的活性在短期內(nèi)立即升高，隨后各種細(xì)胞因子的含量也明顯增加，炎癥介質(zhì)的大量釋放產(chǎn)生瀑布樣反應(yīng)，導(dǎo)致膿毒癥，甚至臟器功能不全和多臟器功能障礙綜合征（MODS）［8-10］。

MODS是嚴(yán)重創(chuàng)傷后主要并發(fā)癥和死亡原因之一。研究表明NF-κB的活化在創(chuàng)傷后MODS的發(fā)生中具有十分重要的作用，處于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心地位［11］。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明嚴(yán)重創(chuàng)傷的早期已可誘導(dǎo)NF-κB的活化。在LPS引起的MODS大鼠模型中，顯示在NF-κB啟動(dòng)子控制下可表達(dá)蟲熒光素酶DNA：LPS刺激時(shí)，NF-κB活化表現(xiàn)為器官特異性和時(shí)間依賴性。給予LPS 1～2 h后，可誘導(dǎo)肝NF-κB活化，2 h后使肺NF-κB活化，以及1～4 h激活脾中的NF-κB。在給予LPS 6 h后，可發(fā)現(xiàn)肺NF-κB依賴性細(xì)胞因子mRNA和血清細(xì)胞因子增加，24 h后可發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞性肺泡炎的組織學(xué)證據(jù)。這些結(jié)果提示NF-κB在急性肺損傷發(fā)病中的重要作用。在采用盲腸結(jié)扎或穿孔制成的鼠膿毒血癥模型中，3 h后可在肝和肺中檢測(cè)到早期激活的NF-κB。對(duì)鼠全身應(yīng)用胰酶后，肺炎癥反應(yīng)與NF-κB在肺內(nèi)的活性增加有關(guān)，可解釋急性胰腺炎時(shí)出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)的機(jī)制?？傊絹?lái)越多的證據(jù)顯示，NF-κB參與了MODS的發(fā)生和發(fā)展［12］。

Altavilla等［13］在失血性休克小鼠模型中發(fā)現(xiàn)休克早期即出現(xiàn)肺、肝、腦細(xì)胞NF-κB的活化，提示NF-κB為MODS病理生理變化的啟動(dòng)因子。Paterson等［14］發(fā)現(xiàn)危重患者中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的NF-κB活性遠(yuǎn)較健康人的高，在10例患者中，存活96 h的患者單核細(xì)胞NF-κB活性不變，而4例死亡者在死亡前的NF-κB活性則較存活者的明顯增加。同時(shí)血IL-6，IL-8和細(xì)胞間黏附分子-1升高，但與NF-κB活性無(wú)關(guān)。Foulds等［15］研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后發(fā)生MODS的患者外周血單核和中性粒細(xì)胞中NF-κB的活性明顯高于未發(fā)生MODS的患者，死亡患者的NF-κB水平高于存活者。Bohrer等［14］觀察到敗血癥休克患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κB的結(jié)合力增加，且所有6 d內(nèi)死亡病例的第1天NF-κB活性均高于基礎(chǔ)值2倍以上，并顯示NF-κB活性與APACHE-II評(píng)分呈明顯正相關(guān)。有研究顯示，MODS組各時(shí)點(diǎn)外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κB活性明顯高于正常對(duì)照組，以第3天為最高點(diǎn)，說(shuō)明MODS早期存在NF-κB的活化增多；NF-κB活性在存活組呈降低的趨勢(shì)而死亡組維持在高水平，提示持續(xù)高水平的NF-κB活性預(yù)示預(yù)后不良。

本資料結(jié)果顯示，對(duì)照組外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)隨時(shí)間變化波動(dòng)較小，均保持在低水平，而創(chuàng)傷失血性MODS組患者外周血單核細(xì)胞在24 h內(nèi)就有NF-κB的強(qiáng)烈表達(dá)，這可能是細(xì)胞受到氧化劑、細(xì)菌、毒素等刺激后，IκB經(jīng)歷快速和大量的磷酸化后被非特異性蛋白酶水解，導(dǎo)致胞漿內(nèi)NF-κB大量快速向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，結(jié)合在被誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子序列上與之對(duì)應(yīng)的κB位點(diǎn)，并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)，24～48 h達(dá)到峰值。同時(shí)結(jié)果還顯示MODS組死亡患者外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性表達(dá)明顯高于生存組，MODS患者的MODS評(píng)分與NF-κB表達(dá)呈明顯正相關(guān)。提示患者早期外周血單核細(xì)胞核內(nèi)NF-κB明顯激活。動(dòng)物模型［16］研究發(fā)現(xiàn)，使用NF-κB拮抗藥可抑制NF-κB激活。若臨床能早期適度應(yīng)用NF-κB抑制藥，抑制NF-κB激活，阻止炎癥介質(zhì)的大量表達(dá)和釋放，對(duì)防止MODS的發(fā)生可能會(huì)起一定作用。

同時(shí)資料結(jié)果還顯示，創(chuàng)傷失血性MODS組患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6、TNF-a含量明顯高于正常對(duì)照組，MODS組死亡患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6、TNF-a含量明顯高于生存組，MODS患者的MODS評(píng)分與者細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清IL-6、TNF-a含量之間無(wú)明顯相關(guān)性，但細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清TNF-a含量與IL-6含量間呈明顯正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明急性失血致循環(huán)血量驟減而發(fā)生的一種低血容量性休克，并導(dǎo)致各臟器有效血流灌注不足及缺血性損害。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體會(huì)發(fā)生一系列連鎖反應(yīng)，如內(nèi)毒素移位、炎性因子的合成與釋放，形成炎癥瀑布反應(yīng)，使組織器官損害發(fā)展加重［17］。提示IL-6、TNF-a在MODS發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)它們的變化可作為病情的發(fā)展趨勢(shì)的一個(gè)輔助指標(biāo)。

總之，創(chuàng)傷失血性休克并發(fā)MODS可導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞NF-κB活性、IL-6、TNF-a含量的顯著變化，其變化與MODS病情發(fā)展和患者預(yù)后密切相關(guān)，因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)它們的變化對(duì)創(chuàng)傷失血性MODS的發(fā)生、發(fā)展及病情轉(zhuǎn)歸具有一定預(yù)警作用。推測(cè)臨床能早期適度應(yīng)用NF-κB抑制藥，抑制NF-κB激活，阻止炎癥介質(zhì)的大量表達(dá)和釋放，將對(duì)于防止MODS的發(fā)生提供新的治療途徑。

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［2015-03-06收稿，2015-04-02修回］

［本文編輯：宋敏］

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451150河南新鄭，河南省軍區(qū)教導(dǎo)大隊(duì)衛(wèi)生所（張穎）；250002山東濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部干休一所（王曉榮）

王曉榮，Email：rong61181@163.com