環介導等溫擴增技術在食品檢測中的應用

馮唐鍇，江雪，韓文華

（景德鎮學院生物與化學工程系，江西景德鎮333000）

環介導等溫擴增技術在食品檢測中的應用

馮唐鍇，江雪，韓文華

（景德鎮學院生物與化學工程系，江西景德鎮333000）

環介導等溫擴增技術是一種新興的核酸擴增技術，被廣泛用于生物特異性核酸片段的檢測。該技術在食品檢測中扮演著越來越重要的角色。簡介環介導等溫擴增技術的基本原理，并對該技術在食品病原體檢測和轉基因食物檢測等方面的應用進行綜述。

環介導等溫擴增；核酸；食品；檢測

核酸擴增是生命科學領域最重要的技術手段之一，截止到2015年，使用最廣泛的核酸擴增技術是聚合酶鏈式反應（PCR），此外還有環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP）［1］等技術。LAMP技術使DNA擴增時間縮短到1 h以內，且靈敏度高、專一性強、操作簡便，十分適合用于食品或食源生物中特定核酸序列的檢測。

1LAMP技術簡介

1.1LAMP特異性引物的設計

靶序列選擇和引物設計是LAMP技術成敗的關鍵。靶序列通常為被檢生物的特異性核酸片段，長度一般在300 bp以內，最好為130 bp～200 bp。選定靶序列后，即可如圖1所示開始設計引物。首先在靶序列（+）鏈選取6個特異區域（F3c、F2c、F1c，B1、B2、B3），其中F2c和B2為待擴增片段兩端長度為18 nt～24 nt的特異序列，F1c和B1為位于F2c和B2內側的特異序列，且與F2c和B2相距約40 nt，長度18 nt～24 nt。F3c和B3為分別位于F2c和B2外側長度為17nt～21nt的特異序列。（-）鏈中有六段與（+）鏈選定序列互補的區域（F3、F2、F1、B1c、B2c、B3c）。然后根據這些特異序列設計LAMP引物組，其中包括2條較長的內引物和2條較短的外引物。圖1中F3和B3即為外引物，內引物分別被稱為FIP和BIP，FIP包含F1c和F2，其序列特征為5′-F1c-TTTT-F2-3′；BIP包含B1c和B2，序列特征為5′-B1c-TTTT-B2-3′，其中4個連續的T是多聚胸腺嘧啶核苷酸連接子［1］。LAMP引物設計相當復雜，通常在確定靶序列之后可借助PrimerExplorerV4軟件或LAMP引物設計在線網站（http：//primerexplor－er.jp/e/）輔助設計［2］。

圖1　靶序列上6對特異區域及其相關引物設計Fig.1The 6 specific areas in the target sequence and related primers Design

1.2LAMP反應過程

LAMP是特殊的DNA聚合酶（通常為BstDNA聚合酶）在體外擴增特定DNA片段的一種方法，反應通常分為3個階段。第一階段為原料底物準備階段（即啞鈴狀模板合成階段）；第二階段為循環擴增階段；第三階段為伸長和再循環階段。第一階段的反應需要外引物F3、B3和內引物FIP、BIP，該階段形成了一條兩端環狀的單鏈，又稱“啞鈴結構”。擴增階段啞鈴結構的DNA通過自我引導完成延伸，生成雙鏈莖環結構。最后的伸長和再循環階段可在之前的基礎上擴增出一系列多環花椰菜樣復雜結構的DNA片段混合物［1］。

1.3LAMP反應體系

LAMP反應體系包括靶序列模板DNA、引物、DNA聚合酶、緩沖液和dNTP等。反應總體積一般為25 μL，其中模板DNA總量控制在10-23mol以內；內引物FIP和BIP各0.8 μmol/L，外引物F3和B3各0.1 μmol/L～0.2 μmol/L，外引物的濃度一般是內引物的1/4～1/10；DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶或BcaBEST DNA聚合酶，體系中總量控制在133.4 nkat～166.7 nkat［1］。LAMP緩沖液中通常還需要加入破壞DNA雙螺旋穩定性的物質以提高反應速率和特異性。

2LAMP技術在食品檢測中的應用

LAMP技術作為一種檢測手段，在實踐應用當中充分顯示了靈敏度高、特異性強、速度快、設備簡單以及產物檢測方便等優勢。截至2015年，該技術廣泛應用于各種DNA和RNA樣品的檢測，下面主要介紹該技術在食品檢測領域的最新研究及應用。

2.1LAMP技術對食源致病菌的檢測

LAMP技術檢測食源性致病菌的研究不斷增多，技術方法也相對成熟。以下是利用LAMP技術檢測幾種代表性菌種的方法。

利用LAMP技術檢測大腸桿菌的研究最為廣泛和成熟。針對不同類型的大腸桿菌，可選取不同靶序列設計引物，開展專門檢測。羅海等［3］選用不耐熱型產腸毒素大腸桿菌的不耐熱腸毒素（LT）基因的保守區設計引物，建立了LAMP技術快速檢測的方法。劉道亮等［4］針對肉類中的大腸桿菌O157∶H7，利用其特異性抗原rfbE基因及鞭毛H7特異性抗原fliC基因作為靶序列，設計了2套增加了環引物的改良LAMP引物序列建立快速檢測方法，肉眼即可觀察結果，實現了單管同時檢測。

多種類別的沙門氏菌可導致人畜局部感染性化膿，引起敗血癥，甚至誘發死亡。萬進等［5］以沙門氏菌高度保守的fimY基因為靶序列設計引物，建立LAMP反應體系。陽性菌株檢出率100%，該技術對牛奶中沙門氏菌污染的快速檢測相當靈敏。張宏偉等［6］則利用該菌種的invA基因設計引物，構建的LAMP體系同樣能對食品中沙門氏菌進行很好的檢測。

葡萄球菌是一種革蘭氏陽性球菌，少數可致病且為最常見的化膿性球菌。最常見的是金黃色葡萄球菌，該菌種的LAMP檢測方法較多，蔡克周等［7］利用LAMP方法檢測了豬血中的金黃色葡萄球菌。劉偉等［8］同樣建立了其他食品金黃色葡萄球菌LAMP檢測的成熟方法。凝固酶陽性葡萄球菌可引起人的局部化膿感染，也可引起肺炎、敗血癥等多種疾病。張宏偉等［9］利用此菌種特有的coa基因設計引物，建立了特異性好、檢出率高的LAMP檢測方法。

副溶血性弧菌是一種寄生于各種水產品的有害菌，是引起人類食物中毒的重要病原體之一。張毅等［10］將LAMP技術與疊氮溴化乙錠染色觀察相結合，以副溶血性弧菌tlh基因作為靶序列設計特異性引物，建立了快速檢測食品中副溶血性弧菌的方法。他們還利用該法實現了克氏螯蝦寄生副溶血性弧菌的檢測，其結果與國家標準檢測方法一致［11］。

阪崎腸桿菌能引起新生兒腦膜炎、小腸結腸炎等，且感染死亡率高。張宏偉等［12］利用阪崎腸桿菌16S-23S rDNA間區（ITS）序列設計特異性引物建立LAMP檢測方法，該法對奶粉樣品阪崎腸桿菌檢測低限達1.2 CFU/100 g。柏建山等［13］也用類似方法對寵物乳粉阪崎腸桿菌進行了檢測，同樣取得了較好結果。

除了上述菌種以外，LAMP技術還可用于志賀氏菌［14］、單增李斯特氏菌［15］、銅綠假單胞菌［16］、耐熱芽孢菌［17］、溶藻弧菌［18］、霍亂弧菌［19］等多種細菌的檢測。

2.2LAMP技術對食源致病病毒的檢測

食源病毒主要存在于家禽、家畜、水產、蔬菜活體中，易導致其大量死亡，造成經濟損失。自Pham等［20］將逆轉錄方法和LAMP技術聯用形成RT-LAMP技術，并用于雞新城疫病毒快速診斷之后，該技術便被廣泛應用于各類農產品活體中各類病毒的檢測。

2.2.1家禽病毒檢測

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）能引起的禽類流感，給世界養禽業造成了巨大損失。該病毒是RNA病毒，可分為16個HA亞型，有些亞型可以感染到人，甚至造成死亡。RT-LAMP技術檢測禽流感病毒的靈敏性也很高，適用于農場大規模家禽檢測［21］。成思佳等［22］針對H1N1亞型禽流感病毒的M基因和HA基因設計了兩組特異性引物，建立了RT-LAMP單管快速檢測方法，反應結果通過濁度或SYBR Green N熒光進行判定，最低可檢測到10拷貝/管病毒顆粒。彭宜等［23］分別針對禽流感病毒H1亞型的HA基因及N1、N2亞型的NA基因設計了3套LAMP特異性引物，實現了上述3種亞型病毒的可視化檢測。李啟明等［24］也建立了敏度達10拷貝RNA分子水平的H5N1亞型的RT-LAMP檢測方法。彭宜等［25］和但曉雅等［26］各自利用H9亞型HA基因設計引物，建立和改良了適用于H9亞型的RT-LAMP快速檢測方法。

除禽流感外，RT-LAMP技術同樣可用于其他禽類病毒的檢測。鵝副黏病毒會引起鵝消化道急、烈性傳染病。鮮思美等［27］針對該病毒F基因設計引物，建立了RT-LAMP檢測方法。鵝細小病毒又稱小鵝瘟病毒，是嚴重危害鵝鴨養殖的傳染病源。傅秋玲等［28］針對該病毒VP3基因設計引物，建立了RT-LAMP檢測方法。禽呼腸孤病毒主要引發多種禽類的心包炎、肝炎等各種疾病。馬利等［29］針對該病毒p10基因設計引物，建立了使用SYBR GreenⅠ鈣黃綠素熒光顯示結果的LAMP檢測方法。

2.2.2其他動物類病毒的檢測

陳長木等［30］運用RT-LAMP技術檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其結果和傳統RT-PCR方法檢測結果的符合率為96.2%。秦智鋒等［31］建立了1套針對口蹄疫病毒的LAMP檢測方法，該法可特異性檢出多個類型的口蹄疫病毒，與其它病毒無交叉反應，其靈敏度與實時熒光RT-PCR相當，肉眼可直接觀察結果。楊慧等［32］采用LAMP技術檢測犬細小病毒具有良好的特異性，最低檢出量達9.3×10-5ng/μL。在水產品檢疫中，Gunimaladevi等［33］首先用RT-LAMP方法檢測虹了鱒魚及鮭魚中的傳染性造血器官壞死病毒，靈敏度比套式PCR方法高10倍。此外，LAMP還可用于對蝦黃頭病病毒［34］、對蝦白斑綜合癥病毒［35］、魚類虹色病毒［36］等許多水產品活體病毒的檢測。

2.2.3菜蔬等植物病毒的檢測

除禽、畜病毒外，LAMP技術同樣能用于蔬菜病毒檢測。番茄黃化曲葉病毒能引番茄、煙草、南瓜、木薯、棉花等重要經濟作物生長緩慢，植株嚴重矮縮，無法正常開花結果，對農業生產造成毀滅性危害。Fukuta等［37］針對該病毒高度保守序列設計了LAMP引物，建立了高效便捷的檢測方法，靈敏度達傳統PCR法的100倍。

2.3LAMP技術對轉基因食品的鑒定

當前社會對是否推廣轉基因食品存在較大爭議，建立靈敏易行的轉基因食品鑒定方法顯得尤為必要。LAMP技術在這方面也能發揮重大作用，相關研究已取得了較大進展。LAMP技術檢測轉基因食品的靶基因可以是被轉化的基因本身，也可以是轉基因常用的啟動子。大多數轉基因食品都含有CaMV-35S啟動子，因此檢測該啟動子的存在與否可判斷食品是否為轉基因。Fukuta等［38］就利用這一原理設計了轉基因食品的LAMP鑒定方法，肖維威等［39］將該法進一步推廣到大豆、玉米、油菜、甜菜等多種轉基因食品的檢測上。閆興華等［40］利用外源cordapA基因設計LAMP特異引物，對轉基因玉米LY038進行了檢測。于妍等［41］針對人工改造的外源cry1Ac基因設計LAMP特異引物，并利用熒光顯色對轉入該基因的水稻“華恢1號”進行了鑒定。蔡穎等［42］根據外源插入片段與植物基因組序列設計和篩選了品系特異性引物，建立了轉基因大豆A5547-127品系的LAMP快速檢測方法。

2.4LAMP技術的其他應用

劉昊等［43］利用開心果過敏原Pisv1基因設計LAMP引物，建立了食物過敏原成分的LAMP檢測方法。Karanis P等［44］則首次將LAMP技術應用到對隱孢子蟲檢測上，開辟了食品中寄生蟲檢測的新途徑。

3小結

LAMP技術理論設計巧妙，實踐操作上具有特異性好、靈敏度高、快速便捷、易于觀察及容易推廣等特點，這使得該技術在食品檢測方面的應用越來越廣泛。靶序列的選擇及引物的設計是LAMP成敗的關鍵，實驗條件的優化是LAMP方法建立的必要過程。LAMP技術檢測結果可用傳統電泳方法觀察，反應后的渾濁度和沉淀量也可直接用肉眼觀察，引入各種熒光染料則能進一步提高觀測效果。針對RNA對象的檢測，則必須進一步建立完善的RT-LAMP方法。該技術也存在其缺點，如不能完整擴增較大基因片段，只能作為一種簡單檢測手段使用。希望能夠通過技術創新，將該技術進一步推廣到更加廣闊的基因操作領域。

［1］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）:E63

［2］沙才華，徐博文，廖秀云，等.淺談環介導等溫擴增技術及其在動物病毒病檢疫中的應用［J］.獸醫研究，2013，294（10）:6-7

［3］羅海，鄭春亮，萬紅梅，等.環介導等溫擴增法快速檢測產腸毒素大腸桿菌的研究［J］.食品研究與開發，2010，31（7）:127-130

［4］劉道亮，胡連霞，趙占民，等.改良環介導等溫擴增技術快速檢測肉類中的大腸桿菌O157:H7［J］.微生物學通報，2011，38（3）:430-435

［5］萬進，張璐，曹興元.環介導等溫擴增技術對牛奶中沙門氏菌快速檢測的研究［J］.農產品質量與安全，2012（增刊）:71-75

［6］張宏偉，葉露萌，彭楊思.利用環介導等溫擴增技術對沙門氏菌進行檢測［J］.食品研究與開發，2009，35（5）:115-118

［7］蔡克周，薛崇浪，張旻，等.環介導等溫擴增檢測豬血中金黃色葡萄球菌［J］.肉類研究，2012，26（11）:27-30

［8］劉偉，蔡國瑞，劉國紅，等.等溫擴增技術在檢測食品中金黃色葡萄球菌的應用［J］.食品研究與開發，2013，34（24）:225-228

［9］張宏偉，劉偉，侯麗萍，等.LAMP法檢測食品中凝固酶陽性葡萄球菌［J］.食品研究與開發，2011，32（5）:126-130

［10］張毅，王愛華，王貴春.EMA-LAMP方法快速檢測食源性副溶血性弧菌活細胞［J］.江蘇農業科學，2012，40（10）:290-292

［11］張毅，胡定金.環介導等溫擴增技術檢測克氏螯蝦樣品中的副溶血性弧菌［J］.河南農業科學，2013，42（3）:128-130

［12］張宏偉，于佳，鄭文杰，等.利用環介導等溫擴增技術對奶粉中阪崎腸桿菌進行檢測［J］.食品研究與開發，2009，30（6）:114-117

［13］柏建山，簡志華，伍朝暉，等.環介導等溫擴增法檢測進口寵物乳粉中阪崎腸桿菌［J］.中國衛生檢驗雜志，2011，21（3）:620-621

［14］祁軍，張霞，蔣剛強，等.交叉引物等溫擴增技術檢測志賀氏菌［J］.食品研究與開發，2013，34（11）:65-68

［15］劉旸，張海英，劉國紅，等.單增李斯特氏菌快速檢測方法的建立［J］.食品研究與開發，2012，33（9）:134-136

［16］劉偉，侯麗萍，趙良娟，等.環介導等溫擴增技術檢測食品中銅綠假單胞菌［J］.食品研究與開發，2012，33（5）:140-142

［17］竇明理，霍貴成.環介導等溫擴增技術快速檢測食品中的耐熱芽孢菌［J］.食品安全與檢測，2012，37（12）:320-324

［18］徐義剛，吳巖，劉忠梅，等.基于DNA環介導等溫擴增技術快速檢測溶藻弧菌的研究［J］.中國畜牧獸醫，2013，40（4）:72-76

［19］匡燕云，葉衛翔，呂敬章，等.霍亂弧菌環介導等溫擴增LAMP技術檢測［J］.中國公共衛生，2009，25（11）:1310-1312

［20］Hang Minh Pham，Chie Nakajima，Kazuhiko Ohashi，et al.Loop-Mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Newcastle Disease Virus［J］.Journal of clinical microbiology，2005，43（4）:1646-1650

［21］Poon LL，Leung CS，Chan KH，et al.Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification［J］.J Clin Microbiol，2005，43（1）:427-430

［22］成思佳，陳之遙，初亞男，等.單管高靈敏度等溫擴增技術快速檢測甲型H1N1流感病毒［J］.分析化學，2011，39（3）:335-340

［23］彭宜，謝芝勛，郭捷，等.利用RT-LAMP可視化檢測技術檢測H1亞型禽流感病毒及N1、N2亞型的分型［J］.病毒學報，2013，29（2）:154-161

［24］李啟明，馬學軍，高寒春，等.逆轉錄環介導等溫核酸擴增技術（RT-LAMP）在H5N1禽流感病毒基因檢測中的應用［J］.病毒學報，2008，24（3）:18-24

［25］彭宜，謝芝勛，劉家波，等.H9亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立［J］.中國人獸共患病學報，2011，27（1）:19-23

［26］但曉雅，董英，鄒明強，等.改良逆轉錄環介導等溫擴增檢測技術快速實時檢測H9亞型禽流感病毒［J］.生物技術通報，2012，28（8）:125-129

［27］鮮思美，韋洪才，尹強軍，等.鵝副黏病毒環介導等溫擴增快速檢測方法的建立及應用［J］.生物技術通報，2012，28（11）:150-154

［28］傅秋玲，施少華，萬春和，等.檢測鵝細小病毒環介導等溫擴增方法的建立及結果判定方法改進［J］.福建農業學報，2013，28（1）:9-13

［29］馬利，張琳，張秀美，等.基于熒光顯色的環介導等溫擴增技術（LAMP）檢測禽呼腸孤病毒［J］.中國獸醫學報，2013，33（2）:166-170

［30］陳長木，崔尚金，張超范，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒反轉錄環媒恒溫檢測方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2009，31（5）:378-382

［31］秦智鋒，曾少靈，阮周曦，等.口蹄疫病毒RT-LAMP檢測方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2008，30（5）:63-65

［32］楊慧，曲光剛，趙元楷，等.犬細小病毒LAMP檢測方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2010，32（7）:550-553

［33］Gunimaladevi I，Kono T，Lapatra SE，et al.A loop mediated isothermal amplification（LAMP）method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus（IHNV）in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）［J］.Arch Virol，2005，150（5）:899-909

［34］Mekata T，Kono T，Savan R，et al.Detection of yellow head virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）［J］.J Virol Methods，2006，135（2）:151-156

［35］Tomoya Kono a，Ram Savan b，Masahiro Sakai，et al.Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification［J］.Journal of Virological Methods，2004，115（2）:59-65

［36］Christopher Marlowe A Caipang，Ikumi Haraguchi，Tsuyoshi Ohira，et al.Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）［J］.Journal of Virological Methods，2004，121（1）:155-161

［37］Fukuta S，Kato S，Yoshida K，et al.Detection of tomato yellow leaf curl virus by loop-mediated isothermal amplification reaction［J］.J Virol Methods，2003，112（2）:35-40

［38］Shiro Fukuta，Yuko Mizukami，Akira Ishida，et al.Real-time loopmediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified organisms［J］.Eur Food Res Technol，2004，218（5）:496-500

［39］肖維威，周琳華，吳永彬，等.LAMP技術檢測食品中轉基因成分CaMV35S啟動子的研究［J］.中國食品學報，2013，13（4）:149-155

［40］閆興華，許文濤，商穎，等.環介導等溫擴增技術（LAMP）快速檢測轉基因玉米LY038［J］.農業生物技術學報，2013，21（5）:621-626

［41］于妍，李志輝，王志鑫，等.轉cry1Ac基因抗蟲水稻環介導等溫擴增檢測方法的建立及應用［J］.河北農業大學學報，2013，36（4）:86-91

［42］蔡穎，周廣彪，劉津，等.轉基因大豆A5547-127品系成分LAMP快速檢測方法的建立［J］.食品研究與開發，2013，34（17）:69-74

［43］劉昊，黃文勝，鄧婷婷，等.LAMP法檢測食品中開心果過敏原成分［J］.食品科學，2013，34（22）:128-132

［44］Karanis P，Thekisoe O，Kiouptsi K，et al.Development and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal amplification procedure for sensiteve detection of Cryptosporidiumoocysts in fecal and water samples［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73（17）:5660-5662

The Application of Loop-mediated Isothermal Amplification Technology in Food Detection

FENG Tang-kai，JIANG Xue，HAN Wen-hua
（The Department of Biology and Chemistry，Jingdezhen University，Jingdezhen 333000，Jiangxi，China）

Loop mediated isothermal amplification technology is a kind of new technology in nucleic acid amplification.It is widely used in biological specific nucleic acid detection.This technology has been playing an increasingly important role in food detection.Introduces the basic principle of loop mediated isothermal amplification technology，and reviews the application of the technology in the detection of food borne pathogens and genetically modified food detection.

loop mediated isothermal amplification；nucleic acid；food；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.044

2014-03-24

馮唐鍇（1979—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品生物化學與分子生物學。